Birçok proteinin yapılarının kovalent disülfür bağlantılarında stabilize olduğu iyi belirlenmiştir. Son çalışmalarda bu bağ bir post-çeviri değişiklik olarak sınıflandırılmıştır. Bu nedenle, hızlı ve basit bir yöntem kullanarak canlı hücrelerde sistein stabilize multimer kompleksleri tanımlamak mümkün olmak önemlidir.
Bu tekniğin en büyük avantajı, sonuçların hızlı, kolay ve minimum maliyetle elde edilebiliyor ve yorumlanabiliyor olmasıdır. Başlamak için, Minimum Esansiyel Orta Yüksek Glikoz altı santimetre kare santimetre çanak U-2 işletim sistemi hücreleri büyümek, ile takviye 10%FBS ve% 1 sodyum pirüuvat ile desteklenmektedir 37 santigrat derecede 5% karbondioksit. Kullanmadan hemen önce 10 milimolar iodoacetamide taze stok yapın.
Hücreler %50-60 biraraya geldikten sonra, doğrudan hücre kültürü ortamına 0.1 milimoler son konsantrasyon iyodoasetamid ekleyin. Yavaşça iki dakika oda sıcaklığında çanak kaya. Daha sonra, hücrelerden medya aspire ve soğuk PBS beş mililitre ile hücreleri üç kez yıkayın.
Son PBS yıkama çözeltisini aspire edin ve bir mililitre soğuk PBS ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak çanak alt hücreleri kazıyın. Bir mililitrelik pipet kullanarak PBS ve hücre süspansiyon uyup tüm sıvıyı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne dağıtın.
Hücreleri 7,500 kez g'de dört santigrat derecede üç dakika döndürün. PBS'yi hücre peletini arkada bırakarak aspire edin. Hücre pelet işleme kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.
Proteini çıkarmak için, 1X lysis tamponunun 100 mikrolitresini çift distile suda seyreltin. Bir milimolar son konsantrasyon kullanmadan hemen önce PMSF ekleyin. Daha sonra doğrudan hücre pelet ine 1X lysis tampon 50 mikrolitre ekleyin ve yeniden askıya.
Ekstraktını beş dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. %40'ta sabit darbe modunu kullanarak sekiz saniye sonicate ekstresi buz üzerinde tutmak. Beş dakika boyunca dört santigrat derece ve 16,000 kez g ekstresi spin.
İstenirse protein konsantrasyonu belirlemek için Bradford analizi gerçekleştirin. Numuneyi hazırlamak için çözünür protein ekstresinin 10 mikrolitresini alın ve 1X Laemmli SDS numune tamponunun 10 mikrolitresini ekleyin. Örnekleri buzda tut.
Jeli çalıştırmadan önce numuneyi 85 derecede beş dakika ısıtın. Formaldehit çapraz bağlama başlamak için, bir 175 santimetre kare şişe de U-2 işletim sistemi hücreleri büyümek 70-80% biraraya. Bir duman başlık olarak 15 dakika boyunca nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında% 1 ve inkübat nihai konsantrasyona orta doğrudan formaldehit fiksatif ekleyin.
Reaksiyonu gidermek için 0.125 molar son konsantrasyonuna 1.25 molar glisin ekleyin ve beş dakika boyunca bir rocker üzerinde nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında inkübat. Hücreleri beş mililitre soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Son PBS yıkama çözeltisini aspire edin ve 10 mililitre PBS ekleyin.
Bir hücre kazıyıcı kullanarak şişenin altındaki hücreleri kazıyın. 10 mililitrelik pipet kullanarak PBS ve hücre süspansiyonu çizin ve sıvının tamamını 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne dağıtın. Hücreleri 500 kez g ve dört santigrat derecede iki dakika döndürün.
PBS'yi hücre peletini arkada bırakarak aspire edin. PH 7.4'te 0.25 molar sakaroz, bir milimolar EDTA, 10 milimolar HEPES ve %0.5 BSA ekleyerek homojenizasyon tamponunun 10 mililitresini hazırlayın. Kullanmadan hemen önce, PMSF'yi bir milimolar son konsantrasyona ve üç mililitre çekirdek süspansiyon tamponuna ekleyin.
Doğrudan hücre peletinin homojenizasyon tamponunun beş mililitresini ekleyin ve tamamen askıya alın. Süspansiyonu 500 kez g ve dört santigrat derecede iki dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, süpernatant atın ve homojenizasyon tampon beş mililitre pelet resuspend.
Sonra sıkı bir uydurma cam Teflon homogenizer ile 500 RPM başına 10 vuruş hücreleri homojenize ve 1, 500 kez g ve dört derece Santigrat 10 dakika süspansiyon santrifüj. Santrifüjden sonra supernatant atın. Çekirdeği süspansiyon tampon bir mililitre pelet resuspend ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
Kuluçkadan sonra, 10 dakika boyunca 600 kez g santrifüj. Santrifüjden sonra, süpernatant atın, çekirdek süspansiyon tampon ve santrifüj bir mililitre pelet resuspend tekrar. Son pelet izole çekirdekler olacak.
1X lysis tamponunun 25 mikrolitresini doğrudan hücre peletine eklemeden önce tarif edilen proteinleri ayıklayın. Daha sonra çözünür protein ekstresinin her biri 10 mikrolitre alarak SDS PAGE için iki örnek hazırlayın ve 10 mikrolitre 2X Laemmli SDS numune tamponu ve bir mikrolitre BME ekleyin. Formaldehit çapraz bağlantısını tersine çevirmek için bir numuneyi 37 derecede 5 dakika, ikinci numuneyi ise 98 santigrat derecede 15 dakika ısıtın.
25 milimolar Tris, 192 milimolar glisin ve hacim Başına %0,1 ağırlık SD karıştırarak 1X Tris-glisin çalışan tampon bir litre hazırlayın. Daha sonra SDS PAGE çalışan aparatı ayarlayın. Üreticiprotokolüne göre %16 önceden yayınlanmış TGX SDS-PAGE paketini açın ve kaseti çıkarın. Kuyuları ve bandı kasetin altından astarlayan tarakçıkarın ve jeli çalışan aparata yerleştirin.
Kuyular sıvıya batırılana kadar odayı 1X çalışan tamponile doldurun. Plastik bir pipet kullanarak çalışan tampon ile kuyuları durula. Numuneleri, önceden boyanmış standart işaretleyicinin 10 mikrolitresi ile birlikte jel üzerine yükleyin.
Son olarak, boya ön jel in altından yaklaşık bir santimetre olana kadar 200 volt jel çalıştırın. BME azaltıcı ajanın yokluğunda toplam hücre ekstrelerinin batıda yapılan bir leke analizi, farklı insan hücre popülasyonlarında çok merik kompleks bir oluşum olduğunu göstermiştir. Kompleks, incelenen dört hücre hattında da BME eklenmesiyle ortadan kayboldu ve disülfür bağlantısının varlığını gösterdi.
Hasat sırasında insan hücrelerinde dUTPase monomerik onay dUTPase isoformen az üç bir kombinasyonudur: mitokondriyal isoform, nükleer isoform, ve bir kesilmiş versiyonu M24 kaydetti. Kontrol olarak kullanılan mitokondriyal izoform disülfür bağlantısı oluşturmamış ve monomerik protein için öngörülen moleküler ağırlığa göç etmiştir. Nükleer dUTPase'nin formaldehit çapraz bağlanması çok meric kompleks oluşumunu göstermiştir.
Çapraz bağlantı, numuneyi 95 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırarak tersine çevrildiğinde, kompleksin dengesi bozuldu ve monomerik durumunda görüntülenebilecekti. Iyodoacetamide eklemek, serbest sistein kalıntılarını engellemek ve disülfür bağlantılarının ekstraksiyon prosedürünün bir sonucu olmadığından emin olmak için bu prosedürde önemli bir adımdır. SDS-PAGE örneklerinize BME veya DDT gibi herhangi bir azaltıcı etken eklememeniz önemlidir, çünkü bu durum örneğinizde bulunan disülfür bağlantılarını azaltacaktır.
