Sideroforlar düşük molekül ağırlıklıdır, metal şelatlı biyomoleküller çevrede demir bisikletdahil. Bu protokol, toprak ve bitki numunelerinde siderofor aktivitesinin hızlı bir şekilde yüksek iş elde değerlendirmesine olanak sağlar. Sideroforre algılama için önceki yöntemler mikrobiyal toplumun önemli ortamı ortadan kaldırmış.
Tekniğimiz, nispeten bozulmamış mikrobiyal topluluk ve içinde bulunduğu yaşam alanı içinde tespit sağlar. Demir kullanılabilirliği tarım verimliliği için çok önemli olduğundan, bu protokolde bitkilere demir kullanılabilirliğini modüle mikropların rolünü araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntem toprak sağlığı ve siderofor üreten topluluklar üzerinde çiftlik yönetimi uygulamalarının etkisini değerlendirmek için yanı sıra zaman içinde bu toplulukların gelişimi için kullanılabilir.
Başlangıç olarak, asit cas talimi kullanımından önce en az iki saat boyunca 100 milimolar hidroklorik 100 milimolar nitrik asit tüm cam yıkama. Laboratuvar sınıfı kum ile dolu bir alüminyum fırın tepsisi hazırlayın ve alüminyum folyo ile kaplayın. Otoklav 121 santigrat derecede 30 dakika boyunca ve bir kenara koyun.
20 mililitre çift deiyonize suya 0365 gram ekleyerek HDTMA'yı hazırlayın ve çözeltiyi 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirerek çözünürlüğü teşvik edin. Steril manyetik karıştırma çubuğuyla hafifçe karıştırırken 25 mililitre çift deiyonize suya 0302 gram CAS ekleyin. Daha sonra 25 mililitre CAS çözeltisine beş mililitre azılı demir klorür heksahidit ekleyip hafifçe karıştırmaya devam edin.
Şimdi, yavaşça yavaşça karıştırArak demir CAS karmaşık çözüm içine HDTMA çözeltisi 20 mililitre ekleyin. Tampon çözeltisini 15,12 gram BORU'yu 375 mililitre çift deiyonize suya hafifçe karıştırarak eriterek hazırlayın. Beş molar sodyum hidroksit ile pH'ı 6.8'e ayarlayın.
Sonra 450 mililitre hacmi getirmek için su ekleyin. Şimdi çözeltiye beş gram agarose ekleyin. BORU tampon çözeltisini ve demir CAS karmaşık çözeltisini 121 derecede 30 dakika boyunca otomatik olarak tonulayın.
Her biri otoklavlandıktan sonra biyogüvenlik kabinindeki BORU tamponunun tamamına demir CAS karmaşık çözeltisinin tamamını dikkatlice ekleyin. 50 santigrat derecede bir su banyosunda karışık çözelti yerleştirin. Şimdi steril bir reaktif tekne steril kum içinde biyogüvenlik kabine ve ısı 50 santigrat derece yerleştirin.
Demir CAS kompleksi agar'ı tekneye aktarın, ardından 100 mikrolitreyi her kuyuya düz dipli steril 96 kuyulu bir mikroplakaya hızlıca aktarın. Önceden hazırlanmış modifiye M9 ortamda 800 mikromolar piroverdine standart hazırlayın. Çözeltiyi 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6,25 mikromolar çözeltiler halinde seyreltin.
3.2 milimolar EDTA standardını hazırlamak için önceden hazırlanmış modifiye M9 ortamının 500 mililitresine EDTA ekleyin. Bu çözeltiyi 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 ve 6,25 mikromolar çözeltilere seyreltin. Standart bir eğri oluşturmak için, 100 mikrolitre demir CAS kompleks agar orta içeren 96 kuyulu bir mikroplaka kuyuları ayırmak için pyoverdine ve EDTA her konsantrasyon100 mikrolitre ekleyin.
Her konsantrasyonun yinelenen teknik kopyalarını yapın. Ayrıca sadece M9 ile boş kuyular ekleyin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, bir, altı ve 24 saat kuluçka dan sonra 22 santigrat derece absorbans ölçmek ve standart eğrileri oluşturmak için emici ölçümler kullanın. Örnekleme ekipmanını 22 mikron filtre çift deiyonize su ile yıkayın ve ardından %70 etanol ve kağıt havlu ile silin.
Steril tekniği korumak ve çapraz kontaminasyonu azaltmak için numunelerden önce ve numuneler arasında yıkamayı gerçekleştirin. Bitki dokuları excising ve alanında bitkilerden küçük bir kök topu kazma sonra, laboratuvar ortamında örnek ayırma için ayrı bir etiketli plastik torba içinde kök topu yerleştirin. Tüm numuneleri doğrudan buzun üzerine yerleştirin ve siderofor üretim testini için numuneler işlenene kadar dört derece santigrat derecede tutun.
Toplu, gevşek bağlı rizosfer toprak ve sıkıca bağlı rizosfer toprak içine ayrı kök ilişkili toprak örnekleri. Bunu yapmak için, çanta kök topları almak ve yavaşça kök topu toprak sallamak. Torbada kalan toprakla birlikte topraktan sarsılan toprak, büyük toprağı oluşturur.
Bu gevşek bağlı rizosfer toprağı. Sıkıca bağlanmış numune ile kökleri alarak ve bir santrifüj tüpü koyarak sıkıca bağlı rhizopshere toprak oluşturun. 2-3 dakika çift deiyonize su ve girdap 30 mililitre ekleyin.
Sıkıca bağlı rizosfer toprak bulamaç seyreltme almak için kökleri çıkarın. Numune torbası içindeki her bir toprak örneğini, torbayı açmadan mümkün olduğunca karıştırıp çevirerek homojenize edin. Her örnek iyice karıştırıldıktan sonra, steril 50 mililitrelik santrifüj tüp içinde modifiye M9 orta 20 mililitre her toprak numunesi iki gram aliquot ve askıya.
Numuneyi seyreltin ve havalandırmaya izin vermek için tüpü steril bir köpük fişi ile kapatın. Sıkıca bağlanmış rizosfer örnekleri için, steril 50 mililitrelik bir santrifüj tüp içinde modifiye M9 orta 20 mililitre rizosfer toprak bulamaç iki mililitre ekleyin. Numuneyi seyreltin ve havalandırmaya izin vermek için tüpü steril bir köpük fişi ile kapatın.
Doku örneğini hazırlamak için yüzey kök, ateş ve tahıl% 70 etanol ile sterilize. 30 saniye boyunca yüksek bir blender kullanarak modifiye M9 orta 20 mililitre taze doku Macerate iki gram. Daha sonra, numuneyi steril 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın, seyreltin ve tüpü steril köpük fişi ile kapatın.
Demir sınırlaması ile siderofor üretimini zenginleştirmek için oda sıcaklığında 50 mililitrelik santrifüj tüpler inkübed ve 160 RPM de sallayın. Zenginleştirme kültürünü başlattıktan 72 saat sonra 24, 48 ve 72 saat sonra steril tekniği kullanarak zenginleştirme tüplerinden bir mililitre alt numune çıkarın. Hücreleri peletize etmek için iki mililitrelik santrifüj tüpleri bir dakika için 10, 000 kez G'de alt örnekleri santrifüj edin.
Steril tekniği kullanarak, mikroplaka içinde yinelenen veya triplicate demir CAS karmaşık agar 100 mikrolitre çözeltisi için supernatant 100 mikrolitre ekleyin. Ayrıca 100 mikrolitre steril M9 ortamını boşluk olarak ekleyin. Sonra plakayı 28 derecede kuluçkaya yatırın.
Her tabak, kuvöze yerleştirilmeden önce folyo ile kaplanmış ve kapatılmalıdır. Kendi steril iki mililitre santrifüj tüp içine her örnek için kalan supernatant ve pelet askıya alın. Her örnek supernatant tüp içine steril gliserol 400 mikrolitre ekleyin ve gliserol stokları oluşturmak için pelet yeniden askıya.
Daha sonra analiz için eksi 80 santigrat derece stok dondurun. Emiciliği 6, 24, 48 ve 72 saat 420 nanometre dalga boyunda ölçün. Pseudomonas fluorescens tarafından biyosentezedilen bir piralyin karışımı mikromolar piralyin eşdeğerliği örneklerinde numunelerin absorbe sini yorumlamak ve ölçmek için standart olarak kullanılmıştır.
420 nanometrede absorbans ile pioverdine başlangıç konsantrasyonu arasındaki ilişki burada gösterilmiştir. 72 saatlik zenginleştirmenin siderofor aktivitesi, siderofor izolasyonu üzerindeki genotip ve örnek tipinin etkisini belirlemek için 48 saatlik kuluçka da değerlendirildi. Dökme toprak örneklerinde siderofor aktivitesi nispeten düşüktü ve dökme toprağın örneklendiği buğday genotipi arasında farklılıklar yoktu.
Ancak, 725 genotip izole gevşek bağlı toprak zenginleştirmemadsen ve 727 gevşek bağlı toprak ama Lewjain gelen göre daha fazla siderofor üretimi sergiledi. Tam tersine, sıkıca bağlanmış topraktan elde edilen zenginleştirmelerde siderofor üretimi genotipten yoğun olarak etkilenmedi. Tahıl dokusunun zenginleştirme kültürleri, genotipne bakılmaksızın nispeten düşük siderofor üretimi ne olursa olsun veremilmiştir.
Lewjain sürgün dokusunun zenginleştirmeleri diğer genotiplere göre önemli ölçüde daha düşük siderofor üretimine sahipti ve 725 sürgün doku kültürü daha değişken siderofor üretimine neden oldu. 725'in diğer tüm genotiplere göre %200 daha fazla siderofor aktivitesine sahip olduğu kök doku zenginleştirme kültürlerinde siderofor aktivitesinde en büyük fark gözlendi. Protokolün yürütülmesinin en yorucu yönlerinden biri, CAS demir agar mikroplakası oluşturmak için birçok adımı tamamlarken aseptik koşulları korumak ve siderofor aktivitesi için numuneleri test etmektir.
Kromatografik kültür tabanlı veya DNA tabanlı teknikler geniş bir yelpazede ya gerçek mikrotiter iyi ya da daha fazla biyokimyasal testler veya genetik karakterizasyon ve metabolik modelleme için gliserol korunmuş kültür uygulanabilir. Bu protokolü kullanarak siderophore aktivitesi daha sonra belirli organizmalar bu faaliyet sorumlu veya daha sonra daha büyük ekolojik etkiler için bir mekanizma olarak hedeflenmiş bağlantılı olabilir. Bu protokol, hava, su ve tortular gibi diğer çevresel bölmelerden elde edilen numunelerden elde edilen zenginleştirme kültürlerinde siderofor üretimini değerlendirmek için kolayca değiştirilebilir.
