Bu protokol, fare modelinde kanser kznizonlarının hedeflenen radyoterapisine önceden hedeflenen bir metodolojinin nasıl uygulanacağı açıklanmaktadır. Önceden hedeflenen radyoimmünoterapi veya PRIT bize antikor ve radyoligand ayrı ayrı enjekte etmek ve iki tıklama kimyası kullanarak in vivo birleştirmek sağlar sağlar. Biz kolorektal kanser bir knenograf modeli kullanarak PRIT mevcut iken, Bu teknik antikor hedefleyen herhangi bir yüzey antijen uygulanabilir.
Bu yaklaşımın etkinliğini azaltabilir gibi hızlı bir şekilde içselleştirmek veya yoğun döken bir antijen seçmek önemlidir. HuA33-TCO sentezlemek için ilk 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp kuru metilformamid mililitre TCO-NHS başına 40 miligram 125 mikrolitre çözelti hazırlamak. Bu çözüm, gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere 80 derece santigrat derecede yanlış bir şekilde işlenebilir ve dondurulabilir.
Ayrı bir 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüp fosfat tamponlu tuzlu bir mililitre huA33 mililitre çözeltisi başına beş miligram hazırlamak. 0,1 molar sodyum karbonat küçük aliquots kullanarak, 8,8 ve 9,0 arasında antikor çözeltisinin pH ayarlayın. PH'ı izlemek için pH kağıdı veya mikroelektrotlu bir pH metre kullanın ve pH'ın 9.0'ı geçmemesi için egzersiz yapın.
Antikor çözeltisine TCO-NHS'nin 40 molar eşdeğerliğine karşılık gelen bir hacim ekleyin. Hidrofobik TCO-NHS yağış önlemek için, yavaş ve ajitasyon ile ekleyin. Hafif ajitasyon ile bir saat boyunca bir termal karıştırıcı üzerinde 25 santigrat derecede kuluçka ya da reaksiyon alabileni bırakın.
HuA33-TCO immunoconjugate'i önceden paketlenmiş tek kullanımlık boyut dışlama tuzsuzlaştırma sütunu kullanarak arındırmadan önce, depolama sırasında kolonda bulunan koruyucu maddeleri çıkarmak için tedarikçi tarafından açıklanan boyut dışlama sütunundan genellikle sütunun hacmine karşılık gelen bir PBS hacmiyle beş kez yıkanmayı içerir. Reaksiyon karışımının hacmine dikkat çekerek, reaksiyon karışımını boyut dışlama sütununa ekleyin. Reaksiyon karışımı kolongirdikten sonra 2,5 mililitreye kadar sütuna eklenen çözeltinin toplam hacmini getirmek için uygun miktarda PBS ekleyin.
Elüent olarak PBS iki mililitre kullanarak ürün toplayın. 280 nanometre dalga boyu izleme bir UV vis spektrofotometre kullanarak huA33-TCO konsantrasyonu ölçün. Daha yüksek immünkonjuggate konsantrasyonuna sahip bir çözelti isteniyorsa, huA33-TCO çözeltisi, üreticinin talimatları doğrultusunda 50,000 moleküler ağırlık kesme ile bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak konsantre olun.
Tamamlanmış huA33-TCO immünkonjuggate'i karanlıkta 4 derece santigrat derecede saklayın. Eğer gelecekte dört günden fazla kullanılacaksa karanlıkta 80 santigrat derecede saklayın. Bir 1.7 mililitre santrifüj tüp 0.25 molar amonyum asetat tampon pH 5,5 ayarlanmış 200 mikrolitre ekleyin.
Tampon çözeltisine istenilen miktarda Lutetium-177 klorür ekleyin. Eklenen miktar deneydeki denek sayısına ve uygulanacak radyoaktif dozlara bağlı olacaktır. Radyoaktif karışıma DMSO'daki Tetrazine PEG7-DOTA'yı ekleyin.
Eklenen miktar, test edilen konu sayısına bağlıdır. Çözeltinin 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. Radyoetiketlemenin mobil faz olarak 50 milimolar EDTA pH 5.5 ile radyo-instant-thin-layer kromatografi kullanarak tamamlandığını doğrulayın.
Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine etiketli serbest Lutetium-177 EDTA tarafından koordine edilecek ve solvent ön ile seyahat ederken taban çizgisinde kalacaktır. Deri altı tümörlerin yerleştirilmesinin kısıtlama tekniğinizi etkilememesi çok önemlidir. Onları, senin dizginleme elinizin karşısındaki yan tarafa yerleştirmenizi öneririm.
Sol elimle dizginlediğimden beri tümörleri sağ kanada yerleştirmeyi seçtim. Kolorektal kanser kznograf ile sıralamak kadın atimik çıplak fareler, böylece her kohort ortalama tümör hacmi kabaca eşittir. Bunu yapmak için, bir elektronik tablo programının üç ayrı sütunda hayvan kimlik numaraları, kulak çentik paterni ve tümör hacmini listelayın.
Verileri en küçük tümör hacminden en büyük hacime doğru sıralayın. Dördüncü sütunda her hayvana bir kafes numarası atayın. Tüm hayvanlar bir kafes atanana kadar bir yılan gibi desen kafesler arasında döngüsü.
Kafesler atandıktan sonra verileri kafes numarasına göre sıralayın. PBS'de %1 büyükbaş serum albumini ile ön işlenmiş şırıngalarda 150 mikrolitre huA33-TCO çözeltisi immünkonjugate çekme dozlarını enjekte etmek ve bu şırıngaları buzda saklamak için. Radyoligand enjekte etmek için, 150 mikrolitrede ilk çekme dozları 0.9% steril salin içeren 1.1 radyoetiketli Tetrazine-PEG7-DOTA huA33-TCO miktarına göre eşdeğerdir.
Oblong tümörün en uzun tarafını ve uzunluğa dik olan genişliği ölçmek için kaliperkullanın. Zaman içinde kilo alımı veya kilo kaybı izlemek için bir denge üzerinde her fare tartın. Son olarak, yüksekliğin yaklaşık genişliğe eşit olduğunu varsayarak bir elipsoidin hacmi formüllerini kullanarak hacmi hesaplayın.
Burada gösterilen bir in vivo pretargeting ile huA33-TCO ve Lutetium-177-DOTA-PEG7-Tetrazine asimik çıplak farelerde subkutan SW12222 insan kolorektal caner tümörleri taşıyan biyodağılımıdır. Tüm enjeksiyon aralıkları tümör dokusunda yüksek aktivite konsantrasyonları yanı sıra sağlıklı organlarda düşük aktivite konsantrasyonları üretmek. 24 saatlik enjeksiyon aralığı enjeksiyon sonrası 120 saat en yüksek tümöral alımı sağlar.
Bu bulgulara göre sonraki uzunlamasına tedavi çalışması için 24 saatlik bir aralık seçilmiştir. Burada gösterilen deri altı SW1222 tümörleri taşıyan farelerin beş grup uzunlamasına tedavi çalışması zaman bir fonksiyonu olarak ortalama tümör hacmi tasvir, ve tümör hacmi zaman bir fonksiyonu olarak ilk hacmi normale. Kontrol gruplarına göre deneysel kohortların yanıtında belirgin bir fark vardır.
Önceden hedeflenen radyoimmünoterapi stratejisinin sadece bir bileşenini alan farelerdeki tümörler kontrolsüz büyümeye devam ederken, tam ön hedefli radyoimmünoterapi rejimini alan farelerin tümörleri büyümeyi durdurdu ve sonunda küçüldü. Daha da önemlisi, hiçbir toksik yan etkileri gözlendi, ve tüm hayvanlar ilk kitle% 20 içinde bir ağırlık muhafaza. Çarpıcı bir şekilde, deneysel kohortların fareleri soruşturmanın sonunda hayatta kalma nın mükemmel bir kaydına sahipti.
Bu prosedürü denerken tümörlerin doğru ve tekrarlı bir şekilde ölçülmesi son derece önemlidir. Radyoaktivite ile çalışırken güvenli protokoller ve tesisler geliştirmek için kurumunuzun radyasyon güvenliği görevlisine danışın. Uygun güvenlik kontrollerinizin yerinde olması maruz kalmanızı sınırlandıracak ve kontaminasyonu önleyecektir.
Ön hedefleme geleneksel radyoimmünoterapi daha arka plan organlarıiçin daha düşük bir radyasyon dozu sağlar. Bu protokolü paylaşarak, başkalarının hasta tedavisi için yeni ve heyecan verici gelişmelere yol açacak kendi modellerini ve fikirlerini test edebilmelerini umuyoruz.
