Protokolümüz, araştırmacıların sürüngenler tarafından kimyasal iletişimde kullanılan biyoaktif sinyal moleküllerini izole etmesine olanak sağlıyor. Ek test, hatta kimlik için bu bileşiklerin ayrılması ve saflaştırılması yanı sıra. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar kimyasal sinyallerin bir kaynak elde edebilir ve daha sonra izole kendi nicelik veya biyoassay kullanımı için onları ayıklayın.
Prosedürü bugün gösteren Holly Rucker, benim laboratuvar bir onur tez öğrencisi olacaktır. Beş santimetre karelik parçaları heksan uyumlu bir kapakla kapatılabilir cam bir kap içine yerleştirerek ve kabı mühürlemeden önce dökülen deri parçalarını tamamen batırmak için konteynere yetecek kadar heksan ekleyerek başlayın. Ertesi gün, onlar konteyner içinde kalan heksan korumak için yakalanan gibi parçaları sallayarak, döken parçaları kaldırmak için temiz metal forceps kullanın.
Çıkarılan lipid kütlesini belirlemek için ekstresi önceden tartılmış, yuvarlak alt şişeye aktarın ve vakum kaynağını döner evaporatöre çevirin ve vakum basıncının şişeyi kondansatörün boynuna tutmak için yeterli olduğundan emin olun. Kondansatörün ucundaki deliği açın, şişeyi kondansatörün boynuna kaydırın ve sistemi kapatmak için menfezi kapatın. Şişe serbest bırakıldığında şişenin kondansatörle bağlantısını kesemeyeceğinden emin olduktan sonra.
Şişenin sadece alt %10'u banyodaki suya değene kadar şişeyi düşürün ve orta hızda döndürmeye başlayın. Vakum, hız, kondansatör akışı ve banyo sıcaklığı optimum ise, şişeden ayrılan çözücü buhar bobinüzerinde yoğunlaşacak ve kurtarma şişesine damlayacaktır. Şişenin alt kısmında bir santimetreden daha az çapa sahip bir sıvı boncuk görünür kadar vakum altında örnek buharlanın.
Sonra rotasyon ve vakum kapatın ve banyo dan şişe yükseltmek. Vakum contası serbest bırakılırken şişe boynunu tutun ve kondansatörden şişenin kenarına kadar boynu bükün. Ekstredeki sıvı boncuğu, heksan buharlaştıkça katılaşır.
Boncuk yaklaşık beş dakika oda sıcaklığında kuruduktan sonra, lipidler şişede sarı balmumu bir yarı saydam beyaz oluşturacaktır. Son kütleyi elde etmek için şişeyi tartın ve heksanın kaydedilmiş hacmindeki lipitleri çözünve böylece bir mililitre heksane başına bir miligram veya daha fazla lipid elde edin. Bir kromatografi sütun hazırlamak için, bir cam kromatografi sütununun altına katlanmış fiberglas dört-dört santimetre kare konumlandırmak için sütun daha uzun bir ahşap dübel çubuk kullanın.
Kolonu duman kaputuniçinde standart bir halka standına sabitle ve stopcock'u açın. Daha sonra, yaklaşık üç santimetre kum fiberglas üzerinde dinlenene kadar sütuniçine yıkanmış ve kurutulmuş kum dökün. Daha sonra, sütunun altına koyu kağıt yerleştirin ve yavaşça dokunun.
Şimdi, sütunun altına 500 mililitrelik bir kabı yerleştirin ve kumu yaklaşık 25 mililitre heksan ile yavaşça ıslayın, kumun üzerinde yaklaşık 0,5 santimetre heksan varken stopcock'u kapatın. Nötr illumina etkinleştirmek için, pipet illumina boyunca damla larda illumina kütlesinin% 6 eşit bir hacim deiyonize su. Ve aktif illumina şişesi kapağı, şiddetle eşit şarj dağıtmak için çözüm dönen.
Illumina görünür kümeleri kaldığında, illumina tamamen heksan yaklaşık 0,5 santimetre ile kaplı olana kadar heksan ekleyin. Bir bulamaç oluşturmak için şişe girdap ve sütunun altına yeni bir 500 mililitrecam kabı yerleştirin. Stopcock açın, sonra tekrar illumina girdap, sürekli sütunun rezervuar düzenlenen bir havalandırmalı huni içine illumina dökmeden önce, illumina sütun içinde eşit yerleşir ve hiçbir büyük kabarcıklar veya çatlaklar formu dikkat.
Sütun, illumina'nın üst kısmı stabil olduğunda ve rezervuarın tabanındaki sütunun boynunun yaklaşık dört santimetre altında olduğunda oluşur. Daha sonra, artık illumina için heksan ile rezervuar ın iç durulamak için bir pipet kullanın ve yavaşça rezervuar altında yaklaşık bir santimetre illumina üstüne kum ikinci bir tabaka ekleyin. Lipid ekstresinin fraksiyonu için, yağ örneğini kolona aktarmak için uzun bir cam pipet kullanın ve kum tabakasını rahatsız etmemek için özü yavaşça pipetleyin.
Beş mililitre heksane ile özü durulayın ve yıkama yıkayın sütuna aktarın. Tüm ekstre eklendiğinde, stopcock'u açın ve numunenin kolona yüklenmesine izin verin. Numune eklendikten sonra, kolon çözücü ile doymuş olarak kalmalıdır.
Sütun kurursa, örnek kaybolur. İlk kesir toplamak için sütunun altına önceden tartılmış ve etiketli yuvarlak alt şişe yerleştirin. Ve kum tabakası rahatsız önlemek için rezervuar ın yan% 100 heksane dökmek için havalandırmalı cam huni kullanın.
Daha sonra, yaklaşık üç mililitre heksane sütunun üst kısmında kum üzerinde kaldığında stopcock kapatarak, elution başlamak için stopcock açın. Büyük hayvanlar doğal olarak daha fazla deri lipidleri üretmek gibi onların daha büyük toplam cilt yüzey alanı nedeniyle, hayvanın fındık havalandırma uzunluğu için çıkarılan lipid kütlesi standartlaştırmak için önemlidir. Bir kez toplam döken cilt kütlesi standartlaştırılmış, çıkarılan deri lipid kütlesinin dökülen deri kütlesi ile doğrusal ilişkisi tamamen kaldırılır.
Kesirasyondan sonra, aynı standardizasyon yaklaşımı tek tek kesirlerin kütleleri ile kullanılabilir. Örneğin, burada her bir fraksiyon toplam çıkarılan lipid kütlesine eşit katkıda bulunmuyor, çünkü nötr lipidler kütle oranına göre baskın bileşikler kümesidir, her bir kutup lipidi kümesine kıyasla. Bileşiklerin belirlenmesi nihai hedef ise, temiz cam kullanın ve numunelerin kirlenmesini önlemek için plastik kaçınmalısınız.
Bileşik tanımlama için, sıvı veya gaz kromatografisi, kütle spektrometresi ile birleştiğinde numuneler toplandıktan sonra takip edilebilir. Alternatif olarak, biyoassays örneğin biyo aktivitesini açıklamak için yapılabilir.
