Bu yöntem in vitro nöral kök hücrelerin farklılaşmasını artırmak ve Parkinson hastalığı gibi nörolojik hastalıkların tedavisine katkıda bulunma potansiyeline sahiptir. Bu tekniğin en önemli avantajları, doku nakli için nöral kök hücrelerin güvenli yönlendirilmiş farklılaşması için soğuk atmosferik plazmaların tek adımda uygulanabiliyor olmasıdır. Soğuk atmosferik plazma kısa bir tedavi süresi içinde nöral kök hücre farklılaşmasını artırabilir.
Ve hücrelere daha fazla hasar ihtiyacı ile, transplantasyon için istenilen hücreleri sağlayan. 25 santimetre karelik bir şişede beşinci murine nöral kök hücreleri yaklaşık beş kez on tohumlama ile başlayın. 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit 2-3 gün boyunca tam DMEM beş mililitre içerir.
Hücreler %85'lik biraraya geldiğinde, kültürü bir mililitre PBS ile yıkayın. Tedaviden önce, bir dakika için yüzde 25 tripsin bir mililitre ile. Hücreler ayrıldığında, bir mililitre kültür ortamıyla reaksiyonu durdurun.
Ve pipet birkaç kez tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için. Saydıktan sonra, mililitre konsantrasyonu başına dördüncü hücrelere iki kez on hücreleri seyreltin. 12 hücreli kültür plakasının dokuz kuyuda bir poli-D-lizin kaplı kapak üzerine bir mililitre kök hücre tohumu.
Hücre yoğunluğunu mikroskop altında kontrol edin. Ve hücreleri 12 saat boyunca kuvöze geri ver. Hücreler bağlandığında, kapak fişlerini yıkama başına bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 48 saat boyunca farklılaşma ortamıyla tedavi edin.
Jet alımı için, önce güç kaynağının çıkış kablosunu plazma jet cihazına bağlayın. Ve gerilimi tespit etmek için çıkış teli ile yüksek gerilim sondasının ucu. Daha sonra çıkış geriliminden gelen bilgileri kaydetmek için yüksek gerilim probunun diğer ucunu osiloskopa bağlayın.
Güç kaynağının, osiloskopun ve yüksek gerilim sondasının topraklı olduğundan emin olmak için tüm devreyi kontrol edin. Ve gaz tüpünü plazma jet cihazına bağlı olduğundan emin olmak için gaz hattını kontrol edin. Daha sonra, helyum ve oksijen gaz vanaları açın ve oksijen helyum dakikada 01 litre bir litre gaz akışını ayarlayın.
Devreyi tekrar kontrol edin ve plazma jeti oluşturmak için çıkış düğmesine basın. Plazma nöral kök hücreleri tedavi etmek için, şırınga meme ve hücrelerin ilk kuyu arasındaki mesafeyi ayarlamak 15 milimetre. Nöral kök hücre kültürlerinde supernatants taze farklılaşma ortamı 800 mikrolitre değiştirin.
Ve tabağı plazma jetlerin altına yerleştirin. Şırınga nozulunun her kuyunun ortasına sabitolduğundan emin olun. Tedavi başına 60 saniye plazma ile üç kuyu ve tedavi başına 60 saniye için yüzde helyum ve oksijen gazı ile üç kuyu oluşturun.
Kontrol olarak üç kuyuyu tedavi edilmezse bırakmak. Daha sonra süpernatantları bir mililitre taze farklılaşma ortamıile değiştirin. Ve hücreleri altı gün boyunca kuvöze geri ver.
Ters faz kontrast ışık mikroskobu altında, her gün farklı grupların farklılaşma durumunu kontrol edin. Tedaviden sonra, hücrelerin taze farklılaşma ortamı ile supernatant değiştirmeden önce yaklaşık bir saat boyunca durum orta tam olarak dengelemek için izin verin. İmmünofloresan analizi için, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca her kuyu başına %4 paraformaldehitin 500 mikrolitresi ile kültürleri düzeltin.
Ardından yıkama başına bir mililitre PBS ile üç hafif beş dakikalık durulama. Daha sonra, sabit numuneleri PBS'de yüzde 2 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 10 dakika geçirin. Gösterildiği gibi nazik durulama izledi.
Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca pbs başına pbs yüzde 10 keçi serumu bir mililitre ile herhangi bir nonspesifik bağlama blok. Kuluçka sonunda, her kuyudaki hücreleri bir gecede 4 derece lik bir ilgi antikorunun 300 mikrolitresiyle etiketle. PBS'de gösterildiği gibi üç yıkıntı takip etti.
Son yıkamadan sonra, hücreleri uygun ikincil antikorların 300 mikrolitresi ile etiketlendirin. Oda sıcaklığında iki saat kuluçka, ışıktan korunmaktadır. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında on dakika boyunca her kuyubaşına bir mililitre PBS ile hafifçe durulayın.
Uygun filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobundaki hücreleri görüntüleyin. Plazma da tedavi edilen nöral kök hücreler, işlenmemiş kontrole ve gaz akışına göre hızlandırılmış bir farklılaşma hızı ve daha yüksek bir farklılaşma oranı sergilerler. Plazma tedavisinden sonra Nestin azalır.
Beta-Tubulin III önemli ölçüde artar. Ve O4 biraz artar, kontrol tedavi ve gaz akışı tedavi kök hücreleri ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, plazma tedavisi nin 60 saniye sonra, olgun nöron sağlam bir ifade, kolinerjik nöron, ve motor nöron belirteçleri gözlenir.
Çok az GABAerjik ve serotonerjik nöronlar ile, ve hiçbir dopaminerjik nöronlar tespit. Uzun ve yoğun bir plazma tedavi süresi hücre apoptosis veya nekroz neden olur, çünkü bu prosedürleri çalışırken, hatırlamak önemlidir, uygun plazma dozu ile hücreleri tedavi. Ayrıca downstream uygulamadan önce hücre canlılığını önceden test etmeyi unutmayın.
