Terapötik anti-Tau antikorlarının Alzheimer hastalığında patolojiyi azaltması önerilen mekanizmalardan biri de mikroglia ile patolojik biraraya gelen eski Tau'nun temizlenmesidir. Burada, tau alımını mikroglia ile değerlendirmek için hücre tabanı değerlendirmesini sıyoruz. Bu tetki daha iyi anti-Tau antikorların eylem mekanizması nı karakterize etmek için yararlı bir araştırma aracı temsil eder.
Deneyin ilk gününde, bv-2 hücrelerini ilk olarak kültürlendikleri şişede 1x PBS ile yıkayarak hazırlayın. Daha sonra 37 santigrat derece ve 5% C02 de şişeden ayırmak kadar% 05 tripsin EDTA ile kuluçka. Kültür ortamındaki hücreleri üç ila beş kez yukarı ve aşağı borulandırarak yeniden askıya alın.
Hücreleri sayın ve mililitre heparin başına 200 mikrogram içeren kültür ortamında mililitre başına 100, 000 hücrelik son konsantrasyona sahip bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Bir 96 iyi doku kültürü düz alt plaka iyi başına bu hücre süspansiyon 250 mikrolitre ekleyin. Plakayı bir gecede %5 C02 ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Buz üzerinde daha önce hazırlanmış pH boya-Tau agregaları çözüldükten sonra, 500 nanomolar çözelti yapmak için, serum serbest orta durumu başına 65 mikrolitre onları seyreltin. İstenilen konsantrasyonu iki katına çıkarmak için 65 mikrolitre serum serbest ortamda seyreltin antikorlar. 96 iyi U-alt plaka pH boya-Tau agregalar ve antikorlar karıştırın.
Bu seyreltme plakası mühür ve 37 santigrat derece gecede kuluçka. Ertesi gün BV-2 hücreleri ile 96 iyi plaka orta kaldırın. Oda sıcaklığında 1x PBS 100 mikrolitre ile her kuyuda hücreleri yıkayın.
PBS'yi BV-2 hücre plakasından çıkarın. Seyreltme plakasından 96 kuyulu BV-2 hücre plakasının her kuyusuna 125 mikrolitre amino kompleks aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve %5 CO2 ile 37 derecede iki saat kuluçkaya yatın. Kuluçka dan sonra hücrelerden amino kompleksleri kaldırmak ve oda sıcaklığında 1x PBS 100 mikrolitre ile her kuyuda hücreleri yıkayın.
1x PBS çıkardıktan sonra% 25 tripsin EDTA 50 mikrolitre ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 santigrat derecede 20 dakika kuluçka. Bundan sonra, 200 mikrolitre kültürlendirme ortamı ekleyin ve hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı borular oluşturarak kuyuyu yeniden askıya alın. Hücreleri 96 iyi u-alt plakasına aktarın ve 400 x g'de 4 derecede 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüj edin.
Plakayı buzüzerine yerleştirin ve ortayı çıkarın. 150 mikrolitre buz soğuğu 1x PBS ve santrifüjü 4 000 g'da 4 santigrat derecede 5 dakika ekleyin. Daha önce eklenen 1x PBS'yi çıkararak ve her kuyubaşına 150 mikrolitre buz gibi pBS ekleyerek plakayı buza yerleştirin ve tekrar yıkayın.
Santrifüj yine aynı koşullar altında. Plakayı buza yerleştirin ve daha önce eklenen PBS'yi çıkararak ve kuyu başına 150 mikrolitre FACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. Santrifüj tekrar 400 g 4 santigrat derecede 5 dakika.
Plakayı buza yerleştirin ve daha önce eklenen FACS tamponunu çıkarın ve her kuyu başına 200 mikrolitre FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Canlı hücre kapısında 20.000 olay elde etmek için hemen FACS tarafından analiz edin. FACS analizi için, enkaz ve ölü hücreler gibi daha düşük ileri dağılım düzeylerine sahip olayları hariç tutarak canlı hücrelere geçit vermek için ön dağılım alanını veya FSCA'yı yan dağılım alanına karşı veya SSCA yoğunluk çizimini kullanın.
Daha sonra canlı hücre popülasyonu içinde fsca karşı ileri dağılım yüksekliği veya FSCH tek bir kapı oluşturmak ve hücre doublets ve agregaları hariç kullanın. Daha sonra bir pH boya tek parametre histogram oluşturmak için singlet kapıdaki olayları kullanın. İlk ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için oluşturulan histogram kullanın.
Bundan sonra bv-2'nin tek kontrolü kullanılarak belirlenen negatif hücreleri dışlayarak pH boya-Tau pozitif hücrelerinin yüzdesini belirleyin. CBTau-28.1 antikorları, akış sitometrisi tarafından gösterildiği gibi doza bağımlı bir şekilde BV-2 hücrelerinde Tau alımını teşvik eder. Yüksek afinite çift mutant CBTau-28.1 antikor vahşi tip antikor daha yüksek bir ölçüde BV-2 hücrelerinde Tau alımı aracılık.
CBTau-28.1 Fab parçaları, FC reseptör aracılı içselleştirme mekanizmasını gösteren bazal Tau alımını artırmadı. Konfokal mikroskopi, Tau alımında antikor aracılı artış olduğunu doğruladı. Yeşil pH boya etiketli Tau agregalar genellikle lysotracker kırmızı boya lekeli asidik organeller ile birlikte lokalize böylece bir endolysomal bölmesi Tau agregalarının varlığını düşündürmektedir.
CBTau-28.1 Fab parçaları tekrar alımı gerçekten FC aracılık olduğunu belirten Tau alımını artırmadı. Az önce açıkladığımız analiz, mikroglia ile tau'ya aracılık eden antikor alımını özellikle tutarlı bir şekilde ölçmemizi sağlıyor. Bu tetkik ile oluşturulan veriler, anti-Tau antikorlarının etki mekanizmasının açıklığa kavuşturulmasını sağlayarak, potansiyel AD tedavisi olarak gelişimlerinde daha fazla adım atmak için anti-Tau antikorlarını ilerletmek için yararlı bir aracı temsil edebilir.
