Name: maintaining biological cultures and measuring gene expression in aphis nerii: a non-model system for plant-insect interactions
Uploaded: 2018-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions at JoVE.com

Michelle Moon (Vanderbilt Üniversitesi) fotoğrafçılık hakkında yardım almak için teşekkür etmek istiyorum. PA ve SSLB Vanderbilt Üniversitesi sağlanan destek DGE-1445197 tarafından desteklenir.

1. bitki kültürü
<ol><li>Tohum ticari herhangi bir satıcıdan satın almanız veya alanında olgun bitkilerden toplamak. Not: Bu protokolü çoğu piyasada bulunan süt kardeş türler (Örneğin, Asclepias incarnata, A. syriaca, A. curassavica, Gomphocarpus physocarpus) için uygundur. Bazı tohum soğuk tabakalı olması gerekebilir ve tohum tedarikçiden talimatları kontrol edilmelidir.</li>
	<li>
İyi bir germinating toprak içinde (% 60-70 iyi torf yosun, perlit, vermikülit, kireçtaşı) bitki tohumları.
	<ol>
<li>Standart fide tepsisi ile çimlenme mix toprak doldurmak; toprak kuyuları üst ulaşır sağlanması. Her şey, toprak hakkında 3 cm derin bir delik oluşturmak için bir girinti olun.</li>
		<li>Öyle ki toprak tohum kapsar ve doymuş bir tohum her delik ve su ile sulama olabilir çok iyi yerleştirin.</li>
		<li>Bir sera içinde tohumları büyümeye (aşağıda, 1.5 koşullara bakınız). Düzenli olarak her gün her diğer-gün için su; makul ses seviyelerinde için toprak nemi korumak için yeterli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ne zaman fide onların ilk koymak-in tam yapraklar büyüdü, bir genel çömlekçilik içinde yeniden pot fidan (50-%60 torf yosun, ağaç kabuğu ve kireç taşı) mix (Şekil 1A).
	<ol>
<li>Kupası kafesleri ile sıkı bir mühür ile uygun 4-inç yuvarlak tencere kullanın. Jant altında yaklaşık 5 cm kadar genel Çömlekçilik toprak ile doldurun.</li>
		<li>Toprak derin bir delik oluşturmak potun alt ulaşmak yeterli.</li>
		<li>El ile yavaşça onun kuyudan olgun fide kepçe ve yerleştirin delik 4 inç tencerede içten içe. Fide toprak ile kapak. Su çok iyi.</li>
		<li>Bitkiler sera ve su düzenli olarak her gün için her geçen gün büyümek; Orta toprak nemi korumak için yeterli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sera koşulları.
	<ol>
<li>18-28 ° C ve üreticinin yönergelerini kullanarak 16-22 ° C arasında gece sıcaklıklar arasında gündüz sıcaklığı korumak için sera termostatlar ayarlayın.</li>
		<li>Ne zaman gün kısadır kış aylarında gün ışığı 600 W yüksek basınçlı sodyum ampuller (12 h, 8 am – 20: 00) ile ek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İstenmeyen zararlıları (Örneğin, thrips, yaprak bitleri) yaprak organik sabun çözüm ile ancak kontrol, bu ürünleri kullanırken dikkatli olun.
	<ol>
<li>Sabun çözüm üreticinin tavsiye göre yapmak ve püskürtülen ilaç şişe kullanarak uygulayın.</li>
		<li>Sabun bitkiler üzerinde 4-24 h. yavaşça durulama için sabun 4-24 h sonrası uygulama kaldırmak ve onlarla durulama su ile bitkiler su laboratuvar yaprak biti kültürlerle kullanmadan ikinci bir saat önce bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültür en az 3-4 setleri tam yaprak büyüdü ve en az 10 cm boyunda (Şekil 1B) bitkiler üzerinde ortalama yaprak biti nüfus.</li>
</ol>2. yaprak biti kültürler
<ol><li>
Laboratuvar yaprak biti nüfus varolan bir laboratuar isoclonal popülasyon başlatın veya aşağıdaki yönergeleri takip alan toplanan yaprak biti--dan başlamak.
	<ol>
<li>Bir laboratuvar nüfus varolan bir laboratuar isoclonal nüfus başlatırken, yaprak bitleri 2.3.1–2.3.3 içinde açıklandığı gibi aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ne zaman yeni isoclonal, alanda toplanan yaprak biti nüfus başlayarak ve bir tek, üreyen, Yetişkin yaprak biti adım 1,6 olarak belirtildiği gibi uygun ana bitki yerleştirin. Not: Nüfus Başlatan üzerinden (gece) kanatlı veya unwinged (apterous) Yetişkin.<ol>
<li>El ile istenmeyen zararlıları önce laboratuvar yaprak bitleri ile kullanmak için sera bitkilerden inceleyin. Herhangi bir bitki istenmeyen yaprak bitleri ile dondur. İsterseniz, bir etanol vakum flask thrips veya diğer zararlıları kaldırmak için kullanın. Not: tedavi edilmiştir bitkiler 1.5.2 adımda anlatıldığı gibi kullanmadan önce sabun ile yıkayın emin olun.</li>
		<li>Bir tek yetişkin yaprak biti bir fırça veya kimliği 3/16" x 1/4" OD plastik boru, 1.000 µL pipet ucu ve 2,00 µL pipet ucu (Şekil 2A) ile oluşturulan bir ağız pipet kullanarak güvenli biçimde aktarma.</li>
		<li>Güvenli bir şekilde bitki yaprak bitleri ile ben, cut off top ile plastik bir kap ile oluşturulan bir fincan kafes iyi bir mesh ile kaplı ve bant ile (Şekil 2B) güvenli kapak.</li>
		<li>Bitkilerin yaprak biti kaynayan bir tepsisine yerleştirin ve kontrollü bir çevre odası (16 L: 8D, 22 ° C, % 70 nem) tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hisse senedi nüfusu korumak için taze, yeni bitkiler için haftalık (2.2.1–2.2.3) yaprak bitleri aktarın.
	<ol>
<li>1-3 2nd güvenli biçimde aktarma veya 3rd biçim perileri ve ağzını pipet (Şekil 2A, 3) kullanarak 1 Yetişkin yaşlı yaprak biti. Not: Hisse senetleri unwinged bireyler aktararak en iyi korunur.</li>
		<li>Güvenli bir şekilde yaprak biti musallat bitkiler, cut off top ile plastik bir kap ile oluşturulan bir fincan kafes iyi bir mesh ile kaplı ve bant ile güvenli kapak.</li>
		<li>Bitkiler bir tepsisine yerleştirin ve bir çevre odası (16 L: 8D, 22 ° C, % 70 nem) yaprak bitleri tutun.</li>
		<li>Alternatif olarak, istenen ve ana bitki iyi kalitesi ise, yalnızca bir üreyen yetişkin bırakarak nüfus azaltmak için bir etanol vakum flask kullanıyorsanız ve 2-3 2 veya 3 perileri biçim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kullanımı için aynı yaş nüfus deneylerde oluşturmak için yeni bir ana bitki üzerine hisse senedi popülasyondan en fazla 5 Yetişkin (tercihen unwinged) yerleştirin.
	<ol>
<li>Yetişkin 24 saat sonra kaldırın.</li>
		<li>F1 çoluk çocuk yetişkinlik için olgunlaştı bir kez yaklaşık 5-7 gün sonra yeni bir ana bitki üzerinde 5 unwinged F1 yetişkin yer. Yetişkin 24 saat sonra kaldırın.</li>
		<li>Bir kez F2 nüfus yetişkinliğe olgunlaştı, bu nüfus deneylerde kullanılmak üzere hazırdır. Not: Bu işlem deneysel Nüfus kabaca aynı yaş ve kabaca aynı yaş anneleri doğarlar sağlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microsatellite Genotipleme (Bölüm 3 & 4 aşağıda açıklanmıştır) kullanarak alan yakaladı isoclonal satırları arasında genotypic farklar onaylayın.</li>
</ol>3. DNA ekstraksiyon
<ol><li>
Hazırlık
	<ol>
<li>1 L lizis arabellek (0.1 M NaCl, 0.2 M sukroz, 0.1 M Tris (pH 9.1), 0,05 M EDTA, % 0.05 SDS) hazırlamak için steril tekniklerini kullanın.</li>
		<li>Isıtma blok sıcak veya su banyosu ile 65 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku homojenizasyon ve lizis
	<ol>
<li>Yaprak biti alt kısmındaki bir steril, 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin.</li>
		<li>Yaprak biti ile tüp steril havaneli yerleştirin ve sıvı azot tüpü dibine sokmak. Not: yaprak biti havaneli ve tüp tarafı arasında konumlandırıldığında en uygun doku parçalanma sonucu elde edilir.</li>
		<li>Yaprak biti başlangıçta hücreleri parçalayıcı için havaneli ile eziyet.</li>
		<li>Bir tek yetişkin yaprak biti için 200 µL lizis arabelleği (2 x 100 µL aliquots split) kullanın. Eziyet ve örnek gözle görülür dağıldı kadar ezilmiş yaprak biti resuspend ilk aliquot ekleyin, sonra ikinci aliquot havaneli yıkamak için kullanın.</li>
		<li>Ezilmiş yaprak biti 30 dk su banyosu veya sıcak bir blok içinde 65 ° C'de lizis arabellekte kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA yağış
	<ol>
<li>Tüp sıcakken 8 M KOAc 14 µL ekleyin. Karıştırmak için tüp tersine çevirin. Örnek buz 30 dk için mağaza. Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.</li>
		<li>13.000 x g 15 dakika oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi. Süpernatant yeni 1,5 mL tüp bir pipet ile aktarın. Herhangi bir pelleted enkaz kaldırmak değil dikkatli olun.</li>
		<li>DNA Pelet görselleştirme geliştirmek 2 µL glikojen (20 µg/mL) süpernatant için ekleyin. Örnek boyutu yeterince büyük ise, bu adımı atlayın.</li>
		<li>Soğuk % 100 moleküler düzeyde etanol 200 µL süpernatant için ekleyin. Mix ve en az 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya tüpler tersine çevirin. Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.</li>
		<li>13.000 x g 15 dakika oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi. Etanol pipetting tarafından kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA yıkama ve elüsyon
	<ol>
<li>Soğuk % 70 moleküler düzeyde etanol 200 µL ekleyin. Sonra resuspend ve Pelet yıkamak için tüp hafifçe vur.</li>
		<li>5 min için 13.000 x g , santrifüj. Pelet görüntülenmesi, süre dikkatle etanol pipetting tarafından kaldırın ve soğuk % 100 moleküler düzeyde etanol 200 µL ekleyin.</li>
		<li>5 min için 13.000 x g , santrifüj. Pelet görüntülenmesi sırasında dikkatli bir şekilde etanol pipetting tarafından çıkarın. Not: Tekrar 100-70-100 etanol yıkama gerekirse.</li>
		<li>Hava Kuru granül için 5-10 dk boru döşeme ile doku kağıt üzerinde yatay olarak açık.</li>
		<li>DNA Pelet düşük TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA) 80 µL içinde resuspend.</li>
		<li>Bir spektrofotometre kullanarak resuspended DNA ölçmek.</li>
		<li>4 ° C'de mağaza</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microsatellite PCR ve sıralamanın yaprak biti Genotipleme için
<ol><li>Microsatellite (Tablo 120) sıralama için uygun F ve R astar sipariş. Not: Geriye doğru astar dizileri microsatellite sıralama için çoğaltılmış örnekler için izin vermek için 5'-6-FAM veya 5'-5-HEX floresan etiketleri ile değiştirilmesi gerekir.</li>
	<li>
PCR tek yaprak biti DNA örnekleri (Bölüm 3'te açıklanan) ve fluorescently etiketli microsatellite astar ile gerçekleştirin.
	<ol>
<li>PCR reaksiyonları üreticinin iletişim kuralı (0.2 µM F/R astar, 2.5 mM MgCl2, 50-200 ng DNA şablon) göre karıştırın.</li>
		<li>Aşağıdaki thermocycler ayarları kullanın: ilk denatürasyon 4 dk, 94 ° C'de 35 94 ° C devredir 30 s, 58 ° C için 35 s, 72 ° C 45 için s ve bir final uzama adım 10 dk 72 ° C'de.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR örnekleri sıralı örneklerin sayısını azaltmak ve genotipleme tesisinde microsatellite örnekleri sıra farklı floresan etiketlerle birleştirmek.</li>
	<li>Microsatellite analiz yazılımı kullanarak .fsa ham örnek dosyaları analiz.</li>
</ol>5. RNA çıkarma
<ol><li>Yaprak bitleri örnekleri 1,5 ml RNase RNA çıkarılması için toplamak / DNaz ücretsiz tüpler ve sıvı azot hemen donma. Not: aşağıdaki adımları hemen gerçekleştirilmez, örnekleri-80 ° C'de saklanabilir</li>
	<li>
Doku homojenizasyon
	<ol>
<li>Yaprak biti ile tüp steril havaneli ile sıvı azot örnek dur cızırtılı kadar 10-15 saniye, dondur. Yaprak biti de havaneli ile 3.2 adımda anlatıldığı gibi ezmek. Not: yaprak biti havaneli ve tüp tarafı arasında konumlandırıldığında en uygun doku parçalanma sonucu elde edilir.</li>
		<li>Duman başlık, guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform ayıklama reaktif 800 µL örnek (1 – 5 Yetişkin yaprak biti) ekleyin. Örnekleri havaneli ve havaneli atmayın lunaparkçı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faz ayrımı Not: Tüm adımları bir duman mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor.<ol>
<li>Homojenize örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Kloroform 160 µL örneğine ekleyin. Shake şiddetle elle 15 s.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 2-3 dakika için kuluçkaya. Santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika Not: Santrifüjü, karışım ayıran 3 katmanlara: alt, kırmızı fenol kloroform faz, bir interfaz ve renksiz bir üst sulu faz. RNA sulu aşamasında sadece kalır. Sulu hacmi ~ 480 µL olacak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA yağış
	<ol>
<li>Bir duman başlık, sulu faz için taze, RNase free tube aktarın. Ara faz rahatsız etmeyin.</li>
		<li>RNA isopropanol 400 µL ekleyerek çökelti ve örnek-20 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya. Not: Protokol burada duraklatıldı ve örnekleri-20 ° c 24 s kadar saklanabilir.</li>
		<li>Örnek için 12.000 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA yıkama ve elüsyon
	<ol>
<li>Süpernatant kaldır; RNA Pelet gözlemek.</li>
		<li>RNA pelet 1 mL % 75 etanol DEPC tedavi su ile yıkayın. Tarafından yavaş vortexing karıştırın. Santrifüj 7,500 x g 4 ° C'de, 5 min için</li>
		<li>Adımları 5.5.1–5.5.2 fenol kirletici kaldırmak için yineleyin.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve hava kuru Pelet 5-10 dk boru döşeme ile steril bir bankta yatay olarak açık. Tamamen kurumasını RNA Pelet izin vermeyin.</li>
		<li>RNA Pelet 30 µL RNase free veya DEPC tedavi su içinde çözülür. Yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için pipet. 55-60 ° C'de 10-15 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. RNAseq De Novo Transcriptome derleme, ek açıklama ve fark ifade Analizi
<ol><li>
RNA örnek konsantrasyon ve Kapiler elektroforetik sistem çip tabanlı kullanarak kalitesini analiz. Not: Tercih yönteminin seçimi RNA konsantrasyon ve kalite daha doğru ve hassas bir ölçüsü sağlar çünkü bir Spektrofotometre ile analiz daha bir kapiler Elektroforez çip tabanlı sistemdir.<ol>
<li>Uygun kalitesini (≥ 250 ng, toplam RIN (RNA bütünlük numarası) ≥ 5) olduğu, RNA sıralama gerçekleştirin. Not: Bu sıralama veri-ecek var olmak kullanılmış her iki ifade profil oluşturma ve de novo transcriptome derlemesi için çünkü önemlisi, derinlik içinde daha yüksek bir kalite transcriptome neden olur devamı. Illumina sıralaması teknolojisiyle, 100-200 milyon 100 bp, oldukça kapsamlı bir derleme için eşleştirilmiş son okuma önerilen bir başlangıç noktası olur. Toplam mRNA Kütüphane hazırlık ve RNA sıralama sıralama aracı tarafından yapıldı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hızlı QC22kullanarak okuma kalitesini kontrol edin.</li>
	<li>Tüm örnek okuma birleştirmek ve Trinity23,24 (Trimmomatic kalitesi etkin filtreleme) kullanarak transcriptome de novo araya.</li>
	<li>
Derleme rafine
	<ol>
<li>Transdecoder25 en az 100 amino asit uzunluğunda açık okuma çerçevesi (ORFs) tanımlamak için kullanın.</li>
		<li>Pfam26 ve BLASTP28 ve HMMER29, sırasıyla kullanarak UniProt27 veritabanları karşı çevrilen ORFs arar Homoloji gerçekleştirin.</li>
		<li>Bakteriyel transkript (bakteriyel bir gen 300'ün üzerinde bir bit puan ve en az amino asit dizisi kimlik % 50 ile çevrilmiş herhangi bir sıra olan en iyi patlama vurmak oldu) kaldırın.</li>
		<li>En az % 99 özdeş, CD-HIT30kullanılarak amino asit düzeyinde olan eksiksiz, tercüme ORFs daraltın.</li>
		<li>En az % 95 aynı CD-HIT30kullanarak nükleotit düzeyinde kalan, eksik ORFs daraltın.</li>
		<li>Kalan nükleotit dizileri ile benzersiz, species-specific tanımlayıcıları (Örneğin, APHNE 0001) atayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BUSCO (http://busco.ezlab.org/) ve Arthropoda gen veri kümesi31kullanarak rafine derleme completeness değerlendirmek.</li>
	<li>
Transcriptome ek açıklama
	<ol>
<li>İlk olarak, HMMER karşı Pfam veritabanı26,29kullanarak rafine transcriptome açıklama ekleyin.</li>
		<li>İkinci olarak, BLASTP karşı UniProt veritabanı27,28kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.</li>
		<li>Üçüncü olarak, seçili böcekler yayımlanmış, ek açıklama eklenen genleri ile kodlama dizisi karşı BLASTP kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.</li>
		<li>Son, bezelye yaprak biti protein yalnızca veritabanı karşı BLASTP kullanarak transcriptome açıklama ekleyin.</li>
		<li>Trinotate UniProt katılımların git ek açıklamaları oluşturmak için kullanın.</li>
		<li>SQLite veritabanına tüm ek açıklama sonuçlarını düzenlemek ve bir ek açıklama raporu oluşturmak için Trinotate kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fark ifade Analizi Not: rafine transcriptome referans olarak kullanarak, hizalama ve ayrı ayrı her kitaplık ölçmek.<ol>
<li>Kullanım Trimmomatic kalite-filtre ve trim için orijinal dosyalar32okuyun. Not: Trinity derleme sonra bu adımı gerçekleştirmek gerekiyorsa, bir o adımı Trimmomatic çıktısı kullanın.</li>
		<li>Yerel hizalamaları Bowtie233kullanarak her örnek için gerçekleştirin.</li>
		<li>Okuma sayıları kullanarak tek tek SAMtools34her örnekten ayıklayın.</li>
		<li>Örnek ilgi DESeq2 varsayılan parametreleriyle kullanma arasındaki fark ifade hesaplamak ve parametrik bir35uygun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. qPCR doğrulama Differentially ifade gen
Not: kullanıcılar kendi RNAseq deneyler differentially ifade genler ilgileniyorsanız aşağıdaki protokol desenleri farklı ifade doğrulamak için kullanılabilir.
<ol><li>RNA örnekleri (5 adım) açıklandığı gibi oluşturun.</li>
	<li>RNA çekimi için kalite kontrol ve konsantrasyonu elde etmek için bir spektrofotometre kullanarak quantitate.</li>
	<li>Üreticinin tavsiye başı olarak piyasada bulunan bir seti kullanarak cDNA örnekleri sentez.</li>
	<li>
Genler doğru iki kat PCR güçlendirme sağlamak ilgi için astar verimliliği belirlemek.
	<ol>
<li>Özgün RNA konsantrasyonları üzerinde bağlı olarak, seri dilutions gerçekleştirmek (101) 3 cDNA konsantrasyonları elde etmek için.</li>
		<li>Kantitatif PCR ana karışımını kullanarak, mix onaylatılacak qPCR tepkiler göre üç astar konsantrasyonları üreticinin iletişim kuralı'nı (Örneğin, 100 nM, 200 nM, 300 nM) ile üç seri olarak seyreltilmiş cDNA konsantrasyonları (Örneğin, 0.1 ng/µL, 10 NG/µL, 100 ng/µL).</li>
		<li>Her hedef gen için Ortalama Ct değerlerini her örnek için bağımlı değişkenler ve günlük (cDNA konsantrasyon) bağımsız değişkenler (üç puan toplam) olarak kullanılarak oluşturulan çizgisinin eğimini (m) hesaplar.</li>
		<li>Burada m 7.4.3 içinde hesaplanan yamaç ise astar verimliliği (E) hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: E 10^(-1/m) = Not: Astar verimliliği % 90-110 arasında analizleri için uygundur. Bu işlem tüm genler hesaplamalara dahil eşit amplifikasyon sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faiz36genler için ifade fark ölçmek için bir temizlik gen ile ΔΔCt yöntemini kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brisson, J. A., Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pea+aphid,+Acyrthosiphon+pisum.:+an+emerging+genomic+model+system+for+ecological,+developmental+and+evolutionary+studies.">The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies.</a> BioEssays. 28, 747-755 (2006).</li><li>Dixon, A. F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aphid Ecology: An Optimization Approach. , (1985).</li><li>Consortium, T. I. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Sequence+of+the+Pea+Aphid+Acyrthosiphon+pisum.">Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum.</a> PLoS Biology. , 1000313 (2010).</li><li>Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aphids:+A+Model+for+Polyphenism+and+Epigenetics.">Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics.</a> Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).</li><li>Wenger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequence+of+the+soybean+aphid,+Aphis+glycines.">Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines.</a> Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).</li><li>Li, Z. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+adaption+analysis+of+the+cotton+aphid+(Aphis+gossypii)+in+different+phenotypes+by+transcriptome+comparison.">Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison.</a> PLoS ONE. 8, 83180 (2013).</li><li>Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomic+analyses+revealed+divergences+of+two+agriculturally+important+aphid+species.">Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+characterization+of+the+pine+aphid+Cinara+pinitabulaeformis+Zhang+et+Zhang+transcriptome+and+analysis+of+genes+relevant+to+pesticides.">De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides.</a> PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).</li><li>Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profile+and+differential+fitness+in+a+specialist+milkweed+insect+across+host+plants+varying+in+toxicity.">Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity.</a> Molecular Ecology. , (2017).</li><li>Dixon, A. F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Herbivore-Host Dynamics. , (2005).</li><li>Goggin, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-aphid+interactions:+molecular+and+ecological+perspectives.">Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives.</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).</li><li>Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+phloem-feeding+insects+face+the+challenge+of+phloem-located+defenses.">How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).</li><li>Webster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+olfaction+in+aphid+host+location.">The role of olfaction in aphid host location.</a> Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).</li><li>Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+cardenolides:+chemical+ecology+and+coevolution+of+specialized+plant-herbivore+interactions.">Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions.</a> New Phytologist. 194, 28-45 (2012).</li><li>Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+toxic+plant+compounds-+the+insect's+perspective+on+iridoid+glycosides+and+cardenolides.">Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides.</a> Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).</li><li>Opitz, S. E. W., M&#252;ller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+chemistry+and+insect+sequestration.">Plant chemistry and insect sequestration.</a> Chemoecology. 19, 117-154 (2009).</li><li>Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+adaptations+toward+plant+toxins+in+milkweed-herbivores+systems+-+a+review.">Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).</li><li>Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+glycosides+in+the+oleander+aphid,+Aphis+nerii.">Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii.</a> Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).</li><li>Harrison, J. S., Mondor, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+invasive+aphid+'superclone':+extremely+low+genetic+diversity+in+oleander+aphid+(Aphis+nerii)+populations+in+the+southern+United+States.">Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States.</a> PLoS ONE. 6, 17524 (2011).</li><li>Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+trade-offs+in+plants+mediate+the+strength+of+trophic+cascades.">Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades.</a> Science. 327, 1642-1644 (2010).</li><li>Grabherr, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+transcriptome+assembly+from+RNA-Seq+data+without+a+reference+genome.">Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome.</a> Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+transcript+sequence+reconstruction+from+RNA-seq+using+the+Trinity+platform+for+reference+generation+and+analysis.">De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis.</a> Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).</li><li>Finn, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pfam+protein+families+database:+towards+a+more+sustainable+future.">The Pfam protein families database: towards a more sustainable future.</a> Nucleic Acids Research. 44, 279-285 (2016).</li><li>The UniProt Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniProt:+the+universal+protein+knowledgebase.">UniProt: the universal protein knowledgebase.</a> Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).</li><li>Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NCBI+BLAST:+a+better+web+interface.">NCBI BLAST: a better web interface.</a> Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).</li><li>Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD-HIT:+accelerated+for+clustering+the+next+generation+sequencing+data.">CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).</li><li>Sim&#227;o, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BUSCO:+assessing+genome+assembly+and+annotation+completeness+with+single-copy+orthologs.">BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs.</a> Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 31 (2014).</li><li>Rieu, I., Powers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+RT-PCR:+design,+calculations,+and+statistics.">Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics.</a> Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).</li><li>Malcolm, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+defence+in+chewing+and+sucking+insect+herbivores:+plant-derived+cardenolides+in+the+monarch+butterfly+and+oleander+aphid.">Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid.</a> Chemoecology. 1, 12-21 (1990).</li><li>Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspecific+variation+in+the+strength+of+density+dependence+in+aphid+populations.">Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations.</a> Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).</li><li>Zehnder, C. B., Hunter, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+maternal+effects+and+current+environment+on+vital+rates+of+Aphis+nerii,+the+milkweed-oleander+aphid.">A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid.</a> Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).</li><li>Hartbauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+defense+of+Aphis+nerii+and+Uroleucon+hypochoeridis+(Homoptera,+Aphididae)+against+natural+enemies.">Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies.</a> PLoS ONE. 5, 10417 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu uzun aposematic A. nerii desen ve bitki savunma ve özellikle kimyasal haciz18,37direnç mekanizmaları sağlayabilir tanınmış oldu. Genomik kaynak A. nerii10 A. nerii bir model olarak kullanmak ekolojik ve fonksiyonel genomik çalışmalar için yeni fırsatlar sunan, son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Yaprak biti ve bitki kültürü ve bu türler üzerinde yapılacak çalışmalar muhtemelen genomik ve...

Yaprak biti dünya çapında çeşitli bitki aileler kolonize küçük, hemimetabolous böcekler var. Özellikle onların karmaşık döngüsel eşeysiz üreme ve ayrı polyphenisms ve onların zorunlu beslenme symbioses eksik besin kaynağı bakteriyel veya Maya endosymbionts ile ilgili ömürleri en çeşitli özellikler için kendine özgü onların yiyecek bitki sap1. Çoğu yaprak biti ana bitki uzmanları olmakla birlikte, bazı kültürlü türler önemli ürün zararlıları inflicting önemli ekonomik zarar bitkileri de bir doğrudan, ya da patojenler ve virüs yolu ile2vektör. Böceğin ilgili adresleme sorular için genomik kaynakları sağlanan çünkü ilk yaprak biti genom bezelye yaprak biti Acyrthosiphon pisum3, 2010, yılında yayınlanması yaprak biti biyoloji çalışma önemli bir kilometre taşı olarak işaretlenmiş uyarlamalar otçul tarzları bir daha iyi kontrol stratejileri4' e neden olabilir de dahil olmak üzere için. O zamandan beri ek genomik kaynaklar yayın halka açık tüm genom kaynak için başka bir üç yaprak biti türler (Myzus ve soya yaprak biti Aphis glycines5için bir ek açıklama eklenen genom birikmiş var Cerasi (siyah kiraz yaprak biti), Myzus persicae (şeftali-patates yaprak biti), Rhopalosiphum PADI (kuş kiraz-yulaf yaprak biti)6. Değerli de novo transcriptomic kaynakları birkaç diğer yaprak biti türler için de mevcuttur (e.g.,Aphis gossypii (pamuk yaprak biti)7, Sitobion avenae (tahıl yaprak biti)8, Cinara pinitabulaeformis (çam yaprak biti)9, Aphis nerii (süt kardeş-zakkum yaprak biti)10).
Yaprak biti da bitkiler11tarihinde bitki böcek etkileşimleri ve hayatı ekolojisi anlayışımız kalıcı katkılarda yaptık. Bir alan nerede yaprak biti özellikle önemli katkılar yapmış anlayışımız ana bitki etkileşimleri Kimya ekolojisi olduğunu. Üstesinden bitki savunma ve bazı bile bitki savunma kendi için Co-e yeğlemek için otçul böceklerin ifade çeşitli uyarlamalar12,13,14yarar. Örneğin, süt kardeş-zakkum yaprak biti, Aphis nerii, bu süt kardeş Aile (Apocynaceae) bitkiler üzerinde colonizes ılıman ve tropikal bölgeler içinde dünya çapında bulundu bir parlak sarı, invaziv yaprak biti olur. Apocynaceae ailesindeki santralleri sütlü lateks ve kardiyak glikosidler katyon taşıyıcı Na, K-ATPaz bağlamak ve etkili caydırmak için kültürlü otobur15, cardenolides bilinen dahil olmak üzere çeşitli kimyasal savunma geliştiğini 16. süt kardeş uzmanları cardenolides direnç çeşitli modları hızlı ve bazı seçerek veya pasif birikir veya değiştirmek onların dokularda cardenolides avlanma caydırmak için bir araç olarak veya diğer yararları17. Her ne kadar işlevsel faydaları ve mekanizmaları belirsiz10,18kalır A. nerii cardenolides bu şekilde çekilmek düşünülmektedir.
Genomik kaynakları el altında göz önüne alındığında, A. nerii mükemmel deneysel modeli moleküler ve genetik mekanizmaları toksik ana bitkiler ve onların uzman arasında kemoterapi ekolojik etkileşimleri dahil incelenmesi için otobur sağlar. Cardenolides19, tutma o zamandan beri üzerinde duruldu A. nerii en erken çalışmaların bazıları ise A. nerii çalışmaların geniş bir dizi evrimsel ve ekolojik soru anlayışlar hazırladık, fazlalaştı, invaziv böcekler20 ve otobur yoğunluğu21alttan üste ve üstten alta regülasyonu arasındaki etkileşimi genetik yapısı dahil olmak üzere. A. nerii böylece böcek-bitki etkileşimleri çalışmaların özellikle geniş bir dizi için deneysel bir model olarak iyi bir aday var. A. nerii ile herhangi bir çalışma başarısı için yaprak biti dikkatli kültürü kültür yaprak biti bağlı hangi bitkilerin içeren nüfus, hem de yüksek kalite - omic verileri verimli bir nesil çok önemlidir. Amacımız okuyucu iki rehber olmaktır. Aşağıda özetlenen üretimi ve sera ve laboratuvar, DNA ve RNA çekimi, microsatellite analiz, de novo transcriptome montaj ve ek açıklama, transcriptome bitki ve yaprak biti kültürler için yöntem vardır fark ifade analizi ve qPCR doğrulanması differentially genler dile getirdi. Süre bu yöntemler yazılı A. nerii, genel kültür, ayıklama için ve analiz yöntemleri yaprak biti türlerin çeşitli için genişletebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>Sun Gro Fafard Germination Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0952-2</td><td></td></tr><tr><td>Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix</td><td>Hummert International</td><td>10-0951-2</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; x 4&quot; Round Standard Pot</td><td>Anderson Pots</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0701</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;reg; III First-Strand Synthesis kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4367659</td><td></td></tr></tbody></table>

maintaining biological cultures and measuring gene expression in aphis nerii: a non-model system for plant-insect interactions

Yaprak biti biyolojik soru onların ana tesisleri ile böceğin etkileşimleri çevreleyen sorulara symbioses evrimi ve polyphenisms gelişimi arasında değişen çeşitli için mükemmel deneysel modellerdir. Genomik kaynaklar birkaç yaprak biti türler için kullanılabilir ve yeni nesil nasıl yapılacağını gelişmeler ile transcriptomic çalışmalar genleri eksikliği olmayan model organizmalar için genişletilmiş. Ayrıca, yaprak biti kültür alanında toplanan ve kullanılmak üzere ekolojik ve genetik çalışmalar arasında köprü organizmalar ve moleküler deneyler laboratuvarda yetiştirilen. Son olarak, pek çok yaprak biti onların tercih edilen ana bitkiler üzerinde laboratuvarda sürekli, parthenogenic genotip eşeysiz üreyen karşılaştırmaların yapılmasına olanak ömürleri içinde muhafaza edilebilir. Aphis nerii, süt kardeş-zakkum yaprak biti, böyle bir model organizma ve moleküler deneyler kullanarak zehirli bitkiler ile böcek etkileşimleri çalışmaya sağlar. Yöntemleri üretimi ve sera ve laboratuvar, DNA ve RNA çekimi, microsatellite analiz, de novo transcriptome montaj ve ek açıklama, transcriptome fark ifade bitki ve yaprak biti kültürler için analiz ve qPCR doğrulama differentially ifade genlerin özetlenen ve burada tartışılan.

Bitki kültürler: Tohum mevsime bağlı olarak yaklaşık 2-4 hafta sürer, büyük büyümeye olacak kadar (Şekil 1A) yeniden saksı. Yeniden saksı fidan yaprak biti kültürler (Şekil 1B) için en uygun bir boyuta büyümek için başka bir 2-4 hafta sürer.
Yaprak biti kültürler: Yetişkin ...

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions at JoVE.com

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Yaprak biti Aphis nerii son derece savundu bitkilerde dogbane aile (Apocyanaceae) üzerinde colonizes ve bitki böcek etkileşimleri eğitim için sayısız fırsat sağlar. Burada, kültür ve üretimi ve moleküler Analizi bir dizi protokol bitki ve yaprak biti bakımı için mevcut ve A. neriiiçin - omic veri.

Biyolojik kültür ve gen ifadesinde ölçme Aphis neriiBakımı: bitki böcek etkileşimleri için bir sigara-model sistemi

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

maintaining-biological-cultures-measuring-gene-expression-aphis-nerii

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

7.5K Görüntüleme.  Vanderbilt University. Yaprak biti Aphis nerii son derece savundu bitkilerde dogbane aile (Apocyanaceae) üzerinde colonizes ve bitki böcek etkileşimleri eğitim için sayısız fırsat sağlar. Burada, kültür ve üretimi ve moleküler Analizi bir dizi protokol bitki ve yaprak biti bakımı için mevcut ve A. neriiiçin - omic veri.

Video: Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Genetik

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Gelişim Biyolojisi

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Mikroenjeksiyon kullanarak Yaprak bitleri Viral İletim Fizyolojik Engelleri Test

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Biyoloji

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Yapay Diyet Deney kullanarak Yaprak bitleri Nikotin Tolerans Testi

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Müstakil yaprak özendirme, Çiğneme böcek Manduca Sexta tarafından Infestation sırasında patates gen Ifade çalışmaları basitleştirmek için

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Çevre

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Nörobilim

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain into an axenic insect is a powerful method to verify gut microbial function and elucidate the mechanisms underlying gut microbe-host interactions. Administering antibiotics or sterilizing egg surfaces are two commonly used methods to remove gut bacteria from insects. However, in addition to the potential adverse effects of antibiotics on insects, previous studies indicated that feeding antibiotics could not eliminate gut bacteria. Thus, germ-free artificial diets are generally employed to maintain axenic insects, which is a tedious and labor-intensive process that cannot fully resemble nutritional components in natural food. Described here is an efficient and simple protocol to prepare and maintain axenic larvae of a leaf beetle&#160;(Plagiodera versicolora). Specifically, surfaces of the beetle eggs were sterilized, following which germ-free poplar leaves were used to rear axenic larvae. The axenic status of the insects was further confirmed via culture-dependent and culture-independent assays. Collectively, by combining egg disinfection and germ-free cultivation, an efficient and convenient method was developed to obtain axenic P. versicolora, providing a readily transferable tool for other leaf-eating insects.

To obtain an axenic insect, its egg surface is sterilized, and the hatched larva is subsequently reared using axenic leaves. This method provides an efficient way for axenic insect preparation without administering antibiotics or developing an artificial diet, which can also be applied to other leaf-eating insects.

Yaprak Böceğinin Host-Gut Mikrobiyota Etkileşim Çalışmaları için Doku Kültürlü Fidanlarla Aksenik Böceklerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Maintaining Laboratory Cultures of Gryllus bimaculatus, a Versatile Orthopteran Model for Insect Agriculture and Invertebrate Physiology

Gryllus bimaculatus (De Geer)&#160;is a large-bodied cricket distributed throughout Africa and Southern Eurasia where it is often wild-harvested as human food. Outside its native range, culturing G. bimaculatus is feasible due to its dietary plasticity, rapid reproductive cycle, lack of diapause requirement, tolerance for high-density rearing, and robustness against pathogens. Thus, G. bimaculatus can be&#160;a versatile model for studies of insect physiology, behavior, embryology, or genetics.
Cultural parameters, such as stocking density, within-cage refugia, photoperiod, temperature, relative humidity, and diet, all impact cricket growth, behavior, and gene expression and should be standardized. In the burgeoning literature on farming insects for human consumption, these crickets are frequently employed to evaluate candidate feed admixtures derived from crop residues, food-processing byproducts, and other low-cost waste streams.
To support ongoing experiments evaluating G. bimaculatus growth performance and nutritional quality in response to variable feed substrates, a comprehensive set of standard protocols for breeding, upkeep, handling, measurement, and euthanasia in the laboratory was developed and is presented here. An industry-standard cricket feed has proven nutritionally adequate and functionally appropriate for the long-term maintenance of cricket breeding stocks, as well as for use as an experimental control feed. Rearing these crickets at a density of 0.005 crickets/cm3 in screen-topped 29.3 L polyethylene cages at an average temperature of 27 &#176;C on a 12 light (L)/12 dark (D) photoperiod, with moistened coconut coir serving both as hydration source and oviposition medium has successfully sustained healthy crickets over a 2-year span. Following these methods, crickets in a controlled experiment yielded an average mass of 0.724 g 0.190 g at harvest, with 89% survivorship and 68.2% sexual maturation between stocking (22 days) and harvest (65 days).

Maintaining Laboratory Cultures of Gryllus bimaculatus, a Versatile Orthopteran Model for Insect Agriculture and Invertebrate Physiology

This paper outlines basic methods to standardize important factors such as density, feed availability, hydration source, and environmental controls for the long-term rearing of laboratory cultures of the edible cricket, Gryllus bimaculatus.

Gryllus bimaculatus'un Laboratuvar Kültürlerinin Sürdürülmesi, Böcek Tarımı ve Omurgasız Fizyolojisi için Çok Yönlü Bir Ortopteran Model

Gryllus bimaculatus (De Geer)&#160;is a large-bodied cricket distributed throughout Africa and Southern Eurasia where it is often wild-harvested as human ...