Yazarlar naklinden Jenkins mikroskobu tesisinde Wyoming Üniversitesi için onların yardım ve üyeleri Bushmen lab, Kelly Roballo, Hayden doğru Wupu Osimanjiang ve harun Dhunghana, hayvan bakımı yardım için istiyorum. Bu yayın bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant # 2P20GM103432 altında mümkün yapıldı.

Yetişkin Sprague Dawley rat bu projede kullanılan ve tüm yordamları Wyoming Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi.
1. ameliyat ve Vivo sinir fiksasyon
Not: Tüm malzeme ve cihazları bu protokol için için satıcı bilgileri Malzemeler tablolistelenir.
Not: Vivo içinde sinir fiksasyon dokuyu korumak ve ölüm saati ve sinirleri topluluğu arasında oluşan yapısal bozulma azaltmak için kullanılır. Vivo doku fiksasyon histoloji, sinir sistemi doku hazırlanması için standart bir uygulama burada perfüzyon kez bu habercisi olmasıdır. Yerleşimi ve boyutu periferik sinirlerin yerinde fiksasyon için izin. Biz toplama ve ötenazi doku yıkımı olasılığı nedeniyle sonra doku fiksasyon önermiyoruz.
<ol><li>Fare için genel anestezi ile % 2-3 isoflurane, bir indüksiyon odasında koyarak hazırlamak sonra imzalat sıçan yüzükoyun üst kısmında bir diseksiyon mat yerleştirin ve isoflurane anestezik burun konisi üzerinden % 1-2 korumak. Yeterli anestezi derinliği sağlamak için hayvanlar arka ayak pedalı çekilmesi için sınav ve palpebral refleksleri gözleri, yokluğu için göz medial canthus dokunarak kontrol. Not: Ketamin mayi enjeksiyon inhale isoflurane yaygın olarak kullanılan bir alternatiftir.</li>
	<li>Siyatik sinir göstermek için hind limb(s) saç tıraş ve % 70 etanol ile traş alanları temiz. Bir neşter ya da makas ile hind bacak diz daha büyük trochanter kadar birlikte deride 2-3 cm kesi yapmak nereye belgili tanımlık kesme uygun konumunu sağlamak için steril neşter kullanarak femur palpasyonla. Uyluk kemiği sadece proksimal siyatik sinir en kolay bölümüne yer alır. Bu bir hayatta kalma ameliyat olsa bile, steril teknikleri korumak.</li>
	<li>Cilt kesi yaptıktan sonra pazı kemiği kas ve gluteus maksimus kas arasında uçak bulun ve mikrodiseksiyon makas kullanarak temel fasya ayrı ve 2-3 cm, alt çizgi siyatik sinir ortaya çıkarmak. Siyatik sinir net bir bölümünü göstermek için bir Retraktörü iki kas (Şekil 1A) arasındaki boşluğu genişletmek için kullanın. İyi forseps ve Iris makas ile dikkatli bir şekilde bağ dokusu, sıkıştırmak veya sinir kesmek için çok dikkat çekici çevre sinir ayırın.</li>
	<li>Yeterli Trump'ın sabitleştirici (%4 formaldehit, 1 x PBS (fosfat tamponlu tuz) ile NaH2PO4· 1.16 g %1 oxazolidin Ekle H2O 100 mL başına) maruz sinir sinir kapak ve 10 dakika oturup bekleyin içeren kavite içine. Gerekli, hind altında yer gazlı bez daha fazla sabitleştirici boşluğa eklenebilir açı geliştirmek için bacak. 10 dakika sonra sabitleştirici kaldırmak ve bu iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskop kullanarak genişletmek ya da siyatik sinir, çimdik emin ince diseksiyon makası kullanarak her iki taraftan sinir ve hemen Trump'ın sabitleştirici değişen bir hafta için 4 ° C'de içeren 15 mL tüpler sinir bölümlerde koydu sabitleştirici her 48 h.</li>
	<li>Hayvanlar, herhangi bir bölümünü cerrahi işlem sırasında sahipsiz bırakmayın. Sinir çıkarıldıktan sonra rahim ağzı çıkık iken anestezi altında tarafından hayvanlar ötenazi.</li>
</ol>2. osmiyum Tetroxide tedavi ve reçine katıştırma
<ol><li>Fiksasyon sonrası, dikkatle herhangi bir kalan yağ ve bağ dokusu sinir kaldırmak ve sinir bölümler 5 mm uzunluğunda (segmentlere ayrılmış ve etiketli farklı tüplerde sinir) yaklaşık halinde kesmek için keskin bir neşter kullanın. Taze % 2 osmiyum tetroxide Trump'ın sabitleştirici çözümde seyreltilmiş hazırlamak ve bir cam tüp içinde tutun. % 2 osmiyum tetroxide 2 h, plastik tüplerde kısa bu süre için olabilir için sinir segmentlerinde bırakın. Not: Bazı plastik tüpler osmiyum osmiyum tetroxide Plastik tüpler uzun süreli depolama tavsiye edilmez bu yüzden bir çözümü, karartma neden tetroxide ile tepki.</li>
	<li>Orta kiti gömme bir epoksi kullanarak, son katıştırma formül hazırlayın:<ol>
<li>Orta DDSA çözüm (dodecenylsuccinic anhidrit; karışım A) katıştırma epoksi mix ve orta NMA çözüm (methylnadic anhidrit; karışım B) katıştırma epoksi karışımı. A ve B en az 20 dakika karıştırarak mıknatıslı bir karıştırıcı ile tarafından karıştırın her iki karışımları izin.</li>
		<li>Hemen kullanmadan karışım A ve B mix ve Hızlandırıcı DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) karışımı toplam hacminin 1.5-%2.0 oranındaki. ekleyin DPM-30 çözüm tam blok koyu renkli ve kırılgan olmasını önlemek için ölçülmelidir unutmayın. Tüm reçine kimyasal toksik maddelerdir; Ciltle temas veya inhalasyon önlemek için ekstra dikkat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 mL tüpler kullanarak, yıkama PBS olan sinir kesimi ve farklı aseton/distile su pasajlar sinir kesimleri yerleştirerek dehidratasyon işlemini başlatmak: % 30, % 60, %90, konsantrasyonları 10 dk sonra 10 dakika için 3 kez %100 aseton.  Not Bu etanol aseton yerine kullanılabilir.</li>
	<li>1 yarı final gömme karışımı karışımı sinir segmentlerinde ve 1 Bölüm % 100 aseton 30 dk sonra son katıştırma karışımı 2 bölümden oluşan bir karışım ve 1 Bölüm % 100 aseton 30 dk içinde için reçine infiltrasyon için yer , ve sonunda sinir kesimleri finalde yer katıştırma karışımı 30 dk için.</li>
	<li>Sinir kesimleri silikon kauçuk kalıpları katıştırma koymak (biz 106 mm Uzunluk x 71 mm genişlik x 7 mm derinlik kullandık; blok boyutu 11 mm Uzunluk x 6 mm genişlik x 3 mm derinlik). Yavaşça bütün sinir segmentleri kapsayacak ve hava kabarcıkları yapmaktan kaçınmak emin sinirler üzerine reçine ekleyin. 60 ° C'de gecede polimerize reçine olan sinir kesimi içeren kalıp bırakın.</li>
</ol>3. kesit Ultramicrotome tarafından
<ol><li>Cam bıçak cam bıçak maker (Şekil 1B) kullanarak hazırlamak ve sinir bölümleri distile su üzerinde yüzen toplamak için kullanılan tekneler (Şekil 1 c), bıçaklarla cam yapmak.</li>
	<li>Gömülü reçine sinir blokları ultramicrotome yuvasına trapez yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ultramicrotome kapsamı kullanarak, herhangi bir fazla reçine sinir dokusu çevreleyen trim ve yamuk şekli yüz blok yapmak ve sinir jilet gibi tek taraflı bir bıçak kullanarak mümkün olduğunca boyuna yüzeyine yakın. Osmiyum tetroxide tarafından karanlık onun boyama tarafından algılanabilmesini sinir segmentin boyuna yüzeye nüfuz değil. Not: Aşırı reçine kesme kesitli ve bıçak performans ve kesme sonraki adımda geliştirmek için reçine alanı azaltmak.</li>
	<li>Ultramicrotome kullanarak, birden çok kesit düzgün kesit yüzeyi düz cam bıçak kullanarak sinir dokusunun ortaya çıkarmak yeterli olun. Bu yapıldıktan sonra tekne kimin oda sıcaklığında distile su ile dolu bir cam bıçak geçin ve ultramicrotome ince kesitler kesmek için 1-2 mikron için ayarlayın.</li>
	<li>Kayan ince kesitler cam bıçak tekne metal döngü (Şekil 1 d) kullanarak cam slayt üzerinde bir damla deiyonize su aktarın. Bölüm bölümleri ısınmasına emin bir kaç saniyeliğine bir alev üzerinde birkaç kez geçirerek içeren slaytlar kuru. Kurutulmuş bölümlerle hemen toluidin mavi leke veya boyama önce birkaç gün boyunca oda sıcaklığında saklayın. Not: Bölümler de sıcak bir tabak 60 ° C'de 15 dakikadır kullanarak kurumuş. Yavaş bir kurutma işlemi bölümler pürüzsüz yapar.</li>
</ol>4. toluidin Blue boyama
<ol><li>Toluidin blue çözümünün %1 100 mL deiyonize su, sodyum borat, 2 g çözülerek hazırlamak sonra toluidin mavi 1 g ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Filtre kağıdı kullanarak çözüm filtre (gözenek boyutu: 11 µm) ve çözüm opak bir şişenin içine oda sıcaklığında iki haftaya kadar tutun.</li>
	<li>Bir plastik pipet veya mikro pipettor kullanarak, sinir bölümleri üst toluidin blue çözüm bir damla ekleyin ve 20-30 s için bırakın.</li>
	<li>Yavaşça slaytlar deiyonize su kavanoza daldırma tarafından tüm toluidin blue çözüm aşırı durulama ve bölümler berraklaşana kadar 3 - 4 kez tekrarlayın. Slaytlar en az 15 dk 60 ° c veya gecede oda sıcaklığında kuru ve sonra bölümleri düzenli montaj orta kullanarak bir coverslip ile kapağı. Bağlı slayt hemen incelemek veya oda sıcaklığında saklayın.</li>
	<li>Işık mikroskop altında incelemek. Bir 100 X yağı daldırma lens g-oranları hesaplamak için kullanılan detaylı görüntüler için önerilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

Yazarlar onlar hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Periferik sinir hasarı ve rejenerasyon morfolojik yapılarının imtihanlarını çalışma13sık konularıdır. Bu protokol için reçine bloklar halinde gömülü ve toluidin blue ile lekeli sıçan siyatik sinir dokusu kullanarak histolojik veri quantifications için yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için gereken adımları açıklar. Bu tekniğin sinir morfoloji içinde sinir rejenerasyon akson sayısı, myelination, infiltrative fibrotik doku varlığı ve sağlığı sinirler ölç...

Periferik sinirler hedef dokulara motor ya da duyusal aksonlar1ile innerve vücut boyunca uzanır. Tarafından tıbbi bozukluklar periferik sinirleri hataları neden ve travma büyük kamu sağlık kaygı temsil ve büyük ekonomik etkileri2,3. Periferik sinir yaralanmaları sonuçlarını değerlendirmek ve sinir rejenerasyon anlama gelişmeler rağmen sinir Histoloji ve teknikleri boyama gibi geleneksel yöntemleri nitelik ve nicelik sinir sağlık değerlendirmek için gerekli araçları vardır. bir terminal sonucu ölçüyü hayvan modelleri veya eksize insan dokusu. Bu kez neden işlevsel sinir rejenerasyon mi ya da olmamış nerede morfometri ortaya çıkarabilir periferik sinir fonksiyonu, elektrofizyolojik ölçümleri ile eşleştirilmiş olan.
Toluidin blue gömülü reçine periferik sinirleri yarı ince bölümlerini boyama myelinated sinir lifleri, yüksek kalite sağlayan görüntüleme için özel bir yöntemdir ve sinir yapıları4,5,6 detaylı görüntülerini temizlemek . Toluidin blue 18567' de, William Henry Perkin tarafından keşfedilen bir acidophilic metakromatik leke ve çeşitli tıbbi uygulamalar8' kullanılır. Toluidin periferik sinirleri mavi lekeli bölümleri reçine gömülü sinir kesimleri elde sinir yapıları net görselleştirme için sağlar. Görselleştirme miyelin kılıf yapısının osmiyum tetroxide sonrası fiksasyon4,9kullanımı ile gelişmiş olabilir. Osmiyum tetroxide starkly tanımlanmış lipid zengini miyelin kılıf10dakika sonra sonuçlanan lipidler, Çift bonolarını ile etkileşimde bulunan bir toksik oksidan ve lipid sabitleştirici ajandır. Ancak, osmiyum tetroxide toksik, pahalı, sinir segmentlerinin uzun bir kuluçka için ve her zaman kullanılmaz.
İşleme ve boyama alternatif yöntemler periferik sinirleri morfoloji görselleştirme için geliştirilmiştir; Boya çözüm periferik sinirleri rejenerasyon 11,12 morfolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan veya parafin, kriyojenik kesit ve epoksi reçine gömülü sinir kesit toluidin blue ile boyama tarafından takip . Bu yöntemler her aksonlar, miyelin kalınlığı, akson çapı ve akson çapı myelinated lif çapı (g-oran) 11,13,14,15 sayısı avantaj ve verim temel veri var .
Birincil reçine-bu iletişim kuralı içinde katıştırma o sinir histolojik özellikleri korunarak reçine sertliği nedeniyle 1-2 mikron kalınlık kesit alma kolaylaştırır ayrımdır. Bu ince kesitler, gömme, parafin elde 4-5 mikron kalınlığı bölümleri aksine periferik sinir bölümlerde axon myelination, g-oranı, olamaz gibi daha doğru bir miktar için izin veren yüksek çözünürlüklü daha kalın kesitler16' dan elde. Kriyojenik kesit 1-2 µm bölümler elde etmek için kullanılan iken, bizim deneyim daha bölümlerde çok sayıda büyük çatlak olmadan elde etmek zor oldu. Kırık tür bölümleri akson sayısı ve myelination yönleri yanlış sayım neden olabilir.
Toluidin blue yanı sıra17boyama yöntemi18 ve Masson'ın trichrome boyama4 boyama bir gümüş de sinir aksonlar göstermek için kullanılabilir. Oysa toluidin blue boyama açık miyelin kılıf görüntü gösterdi ve -ebilmek kolayca Ancak, reçine sıçan medyan sinir bölümlerini katıştırma kullanarak ya Hematoksilen ve eozin veya Masson'ın trichrome gösterdi zayıf miyelin kılıf ve tanınmayan yapıları ile lekeli quantified4yaşında. Bazı sınırlamaları rağmen toluidin gömülü reçine periferik boyama mavi sinir sinir morfolojisi yüksek çözünürlüklü görüntüleri gerekli olduğunda kullanılabilecek değerli bir teknik var.
Reçine katıştırma için birincil dezavantajı bu zaman alan ve parafin ve donmuş gömülü bölümleri teknikleri ile karşılaştırıldığında antijen alma zorluğu nedeniyle aynı doku immunostaining için izin vermez olduğunu. Bu nedenle, reçine-toluidin blue boyama için katıştırma üzerinden işlenir immunostaining için aynı doku kullanmak genellikle mümkün değildir. Her ne kadar değil immünhistokimya isteniyorsa burada, kullanılan reçine katıştırılmış kesitler, glikol metakrilat reçineleri katıştırma kullanımı verir için doku bölümler üzerinde gerçekleştirilecek immünhistokimya; nispeten pahalı19yaşında Bu biraz periferik sinirleri ayrı kesimleri, bazı reçine katıştırma için ve diğerleri için immunostaining içine doğrudan fiksasyon sonra kesim tarafından azaltılabilir.
Toluidin blue reçine boyama işlemi en histopatolojik analizi ile fiksasyon, su kaybı da dahil olmak üzere, gömme, kesit ve20boyama beş aşamada bölünmüştür gibi periferik sinirler, katıştırılmış. Biz burada katıştırılmış sıçan siyatik sinir bölümleri lekeli reçine toluidin elde etmek için mavi yüksek kaliteli görüntüler ile kullanmak için bir iletişim kuralı ve pratik kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffer Saline</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Tetraborate Decahydrate</td><td>Acros Organics</td><td>205950010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Embedding Medium Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45359</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>To adjust Trump&#039;s fixative pH</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Chemical</td><td>170942</td><td></td></tr><tr><td>Osmium Tetroxide Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td></td></tr><tr><td>Pelco Embedding Cast</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9671811</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Maker</td><td>RMC Products</td><td>GKM-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC Products</td><td>MT-XL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>ISO 9001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>4 mL Glass Vial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>For trimming resin block</td></tr><tr><td>Perfect Loop</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td>For picking up thin resin sections</td></tr><tr><td>Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>100 Watt Oven</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>6350115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filter Paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr><tr><td>3 mL plastic pipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z331740</td><td></td></tr><tr><td>Micro-surgical Kit</td><td>World precision instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td></tr></tbody></table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Periferik sinirler hedef dokulara motor ya da duyusal aksonlar ile innerve vücut boyunca uzanır. Yaygın dağıtım nedeniyle periferik sinirler sık travma veya hastalık nedeniyle zarar görmüş. Periferik sinir yaralanma hayvan modellerinde, işlev ve rejenerasyon, değerlendirmek için geliştirilmiştir yöntemleri ve stratejileri gibi periferik sinirleri morfometri analiz bir temel terminal sonuç ölçü haline gelmiştir. Toluidin sinir çapraz boyama Mavi bölümler gömülü reçine sinir bölümlerden elde edilen nitel ve nicel değerlendirmeler periferik sinir, görselleştirme akson sayısı Morfoloji ve derecesi etkinleştirme için tekrarlanabilir bir yöntemdir myelination. Bu teknik yöntemlerle birçok diğer histolojik olarak öğrenmek ve standart yazılı protokolleri kullanarak master zor olabilir. Bu yayının amacı bu nedenle toluidin videografisi siyatik sinirleri sıçanlarından emir hasat kullanarak yöntemi ile periferik sinirleri boyama mavi yazılı protokollerde vurgulamak için. Bu protokol için in vivo periferik sinirleri fiksasyon ve doku ve sonrası fiksasyon ile % 2 osmiyum tetroxide, topluluğu tarif epoksi reçine ve ultramicrotome sinir için 1-2μm kalınlık kesit sinirleri katıştırma. Sinir bölümleri bir cam slayt transfer ve sonra onlar nicelik ve nitelik değerlendirilir toluidin blue ile lekeli. En sık görülen sorunlar örnekleri yanı sıra bu sorunları azaltıcı adımlar gösterilmiştir.

Reçine periferik sinirleri toluidin ile mavi lekeli bölümleri doğru histolojik veri quantifications için izin gömülü. Yordamı genel bakış (Şekil 2' de) gösterilir. Siyatik sinir bölümleri reçine ortamda gömülü ve toluidin mavi net gösterdi görüntüleri en iyi çözünürlük (Şekil 3) ile lekeli. Sinir hasarı pek çok değişiklik sinir morfolojik yapıları, örneğin, sinir lifi, akson çapı ve miyelin kılıf kalı...

Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Burada güzel yapıları periferik sinir alma ve 1-2 µm bölümlerle toluidin blue boyama görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut

Toluidin Blue reçine gömülü bölümlerini periferik sinirleri morfoloji değerlendirme için boyama

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.8K Görüntüleme.  University of Wyoming. Burada güzel yapıları periferik sinir alma ve 1-2 µm bölümlerle toluidin blue boyama görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut

Video: Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Nörobilim

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Lokalize histopatolojik analizi için bir Retina Protez ile implant İşleme Gözler Teknikleri

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Tıp

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Gelişim Biyolojisi

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Lisolesitin Odak Enjeksiyon Deneysel Demyelizasyon ve Kemirgen Omurilik remiyelinizasyon

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to degeneration and injury of small-diameter sensory neurons, referred to as small fiber neuropathy. Present animal models of small fiber neuropathy affect both large- and small-diameter sensory fibers and thus create a neuropathology too complex to properly assess the effects of injured small-diameter sensory fibers. Therefore, it is necessary to develop an experimental model of pure small fiber neuropathy to adequately examine these issues. This protocol describes an experimental model of small fiber neuropathy specifically affecting small-diameter sensory nerves with resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent agonist of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), through a single dose of intraperitoneal injection, referred to as RTX neuropathy. This RTX neuropathy showed pathological manifestations and behavioral abnormalities that mimic the clinical characteristics of patients with small fiber neuropathy, including intraepidermal nerve fiber (IENF) degeneration, specifically injury in small-diameter neurons, and induction of thermal hypoalgesia and mechanical allodynia. This protocol tested three doses of RTX (200, 50, and 10 &#181;g/kg, respectively) and concluded that a critical dose of RTX (50 &#181;g/kg) is required for the development of typical small fiber neuropathy manifestations, and prepared a modified immunostaining procedure to investigate IENF degeneration and neuronal soma injury. The modified procedure is fast, systematic, and economic. Behavioral evaluation of neuropathic pain is critical to reveal the function of small-diameter sensory nerves. The evaluation of mechanical thresholds in experimental rodents is particularly challenging and this protocol describes a customized metal mesh that is suitable for this type of assessment in rodents. In summary, RTX neuropathy is a new and easily established experimental model to evaluate the molecular significance and intervention underlying neuropathic pain for the development of therapeutic agents.

This study establishes an experimental model of pure small fiber neuropathy with resiniferatoxin (RTX). A unique dose of RTX (50 &#181;g/kg) is optimal for developing a small fiber neuropathy model that mimics patient characteristics and could help investigate the nociceptive molecular significance underlying neuropathic pain.

Saf küçük Fiber nöropati bir fare modeli ile geçici reseptör potansiyel Vanilloid tip 1 Ultrapotent Agonist kurulması

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...