İletişim kuralı ve algoritma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG grant SFB1009 A09 ve EB177/13-1) tarafından finanse edilen bir proje içinde geliştirilmiştir. Yazar Barbara Schedding ve teknik destek için Felix Schmalbein ve Dr. eleştirel makale okumak için Niland teşekkürler.

1. stok çözümleri
<ol><li>10 x TBS 100 mL pH 7.4 çözüm hazırlamak için 6,06 g TRIS ve NaCl 8,77 g 90 mL deiyonize su içinde dağıtılması, pH %7,4 37 HCl çözüm için ayarlamak, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 1 hazırlamak için M HEPES/NaOH, pH 7.4 çözüm, HEPES 23.83 g 90 mL deiyonize su içinde erimesi, pH 7.4 ile 1,5 M NaOH için ayarlamak, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 5 M NaCl çözeltisi hazırlamak için NaCl 29.2 g 90 mL deiyonize su içinde çözülür. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 1 M MgCl2 çözeltisi hazırlamak için çözülür 20.33 g MgCl2 · 6H2O 90 mL deiyonize su içinde. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>%5 ısı inaktive BSA su hazırlamak için BSA (kesir V, pH 7,0) 2.5 g 50 mL tüp içinde ağırlığında ve 45 mL deiyonize su geçiyoruz. Çözüm 50 ml deiyonize su ile doldurun ve 45 dk. bir buz banyosu içinde serin ve -20 ° C'de depolamak için bir su banyosu 68 ° C'de çözümde ısı</li>
	<li>Sulu % 25 oxazolidin çözüm hazırlamak. Dikkat: Oxazolidin zararlı olup olmadığını yuttu, toksik Solunduğunda ve burns neden olur. Koruyucu giysiler, eldiven, giyim ve göz/koruma yüz.</li>
	<li>Tavşan anti-serum yukarıda açıklanan19kaldırın. Anti-serum titresi standart protokolleri20göre belirlendi.</li>
	<li>Anti-tavşan immünglobulin-antikorlar ile alkalen fosfataz Birleşik keçi gelen hazır olun.</li>
	<li>100 mL 0.1 M glisin çözeltisi hazırlamak için glisin 90 ml deiyonize su, 0.75 g geçiyoruz. 1,5 M NaOH çözüm ile 10.4 için pH ayarlama, birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 0.5 M Zn (II) hazırlamak için-asetat çözüm, 10,98 g Zn (II) dağıtılması-asetat · 2H2O 90 mL deiyonize su içinde. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
	<li>100 mL 1,5 M NaOH çözeltisi hazırlamak için 90 mL deiyonize su 6.0 g NaOH geçiyoruz. Birimin 100 ml deiyonize su ile doldurun ve çözüm filtre.</li>
</ol>2. arabellekleri hazırlayın ve çalışma çözümleri
<ol><li>5 deiyonize mL 10 x TBS pH 7.4, 45 mL ile su sulandırmak ve bir 1 M MgCl2 hisse senedi çözeltinin 100 µL ekleyin. Oda sıcaklığında tutmak. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 çözüm için reseptör ve microtiter tabak yıkama immobilizasyon arasındadır.</li>
	<li>Isı inaktive BSA suda % 5 ve 10 x TBS, 5 mL pH 7.4 50 mL deiyonize su ile 10 mL seyreltik. 100 µL 1 M MgCl2 hisse senedi çözüm çözüm iyi ekleyip karıştırın. Buz üstünde tutmak ve -20 ° C'de daha fazla deneyler için saklayın Not % 1 BSA TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 içinde o 2.5 mL her titrasyon eğrisi için gereklidir.</li>
	<li>1 2.5 mL seyreltik M HEPES/NaOH, pH 7,4 ve 1.5 mL 5 M NaCl çözüm 50 ml deiyonize su ile 100 µL 1 M MgCl2 çözüm ekleyip karıştırın iyice 50 mL HBS, pH 7.4: 50 mM HEPES/NaOH hazırlamak için çözüm , 150 mM NaCl.</li>
	<li>1 M MgCl2 hisse senedi çözüm 5 µL ekleyip 2 µL 0,5 M Zn (II)-asetat hisse senedi çözüm 5 mL 0.1 M glisin çözüm, pH alkalen fosfataz (AP) arabellek (0.1 M glisin çözüm, pH 10.4, 1 mM MgCl2, 0.2 mM Zn(II)-acetate). hazırlamak için 10.4 için</li>
</ol>3. immobilizasyon bir Microtiter plakasına reseptör (Integrin α2A-etki alanı)
<ol><li>İntegrin α2A-etki alanında TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 5 µg/mL nihai bir konsantrasyon için hisse senedi çözüm sulandırmak. Not: 12 iyi satır yarım alan-microtiter plaka oluşan bir titrasyon eğrisi için 650 µL kaplama çözüm birimdir.</li>
	<li>Her şey yarım alan-microtiter tabakta bir satırın 50 µL/kuyu ile 5 µg/mL kaplama çözüm integrin α2A-etki alanı (vahşi-türü veya mutant) doldurun. Her titrasyon satır en az çoğaltmaları gerçekleştirin (Bu örnekte dördüz; olarak şekil 1' deki microtiter plaka yerleşimini bakın).</li>
	<li>Plaka folyo ile kapatın veya bir kapak ile kapatın. Plaka 4 ° C'de gece bırakın.</li>
</ol>4. yıkama Kuyu yapımı tabak iki kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 ile kaplı
<ol><li>Çözünür reseptör kaldırmak için plastik yüzey-değil var immobilize tarafından fiziksel adsorpsiyon, kaplama çözümü kaldırmak ve her doldurmak molekülleri MgCl2TBS, pH 7.4, 2 mM 50 µL ile iyi.</li>
	<li>Yıkama çözüm kaldırın. Kuyuları kuru olmazlar sağlamak. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.</li>
	<li>Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.</li>
</ol>5. nonspesifik bağlama sitelerini engelleme
<ol><li>TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 her şey için 50 µL % 1 BSA çözüm ekleyin.</li>
	<li>Wells folyo ile yeniden mühürlemek veya bir kapak ile kapatın.</li>
	<li>Wells, oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Not: Bu protokol kuluçka adımlardan herhangi birini bir sallanan veya sallayarak platform üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, bu gerekli değildir ve denemenin sonucu değiştirmez.</li>
</ol>6. Rhodocetin Ligand bir seri seyreltme satırı hazırlanması
<ol><li>Rhodocetin başlangıç konsantrasyonu ve seri seyreltme ligand konsantrasyonu uygun bir dizi elde etmek için ve bir minimum ve maksimum sinyal ile tam titrasyon eğrisi kaydetmek için seyreltme faktörü değişir. Bu deneyde, 243 nM rhodocetin bir başlangıç konsantrasyonu ve 2.3 bir seyreltme faktörü istihdam. Rhodocetin hisse senedi çözüm seri seyreltme satır en yüksek ligand konsantrasyonu sulandırmak. 2.3 bir seyreltme faktörü ile her titrasyon eğrisi için 243 nM (Yani, 15,2 µg/mL) rhodocetin çözüm %1 115 µL hazırlamak BSA/TBS, pH 7.4, deney tüpü #1 2 mM MgCl2 .</li>
	<li>65 µL % 1 BSA çözüm TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 #2-#11 etiketli 10 test tüpleri doldurun.</li>
	<li>#1 için tüp rhodocetin seyreltme 50 µL aktarmak tüp #2, her iki çözüm mix (Toplam birim: 115 µL; seyreltme faktörü: 1:2. 3) toz ve ardından test tube #3, vb bu karışım üzerinden transfer 50 µL
</li>
	<li>Bu seri seyreltme test tüpü #11 kadar devam edin. Not: 6.1 6.4 adımda verilen birimleri bir titrasyon eğrisi için yeterlidir. Bu birimler çoğaltır sayısı ile çarpın. Bu durumda, sekiz titrasyon eğrileri (iki α2A etki alanı form dördüz) gerçekleştirmek ve aşağıdaki birimler hazır olun: rhodocetin çözüm test tüpü #1; en yüksek konsantrasyon, 920 µL TBS, pH 7.4 her test tüpleri #2 #11 içinde doldurmak için 2 mM MgCl%2 1 BSA 520 µL; ve bir tüp transferi birimden diğerine 400 µL.</li>
</ol>7. bağlama Ligand (Rhodocetin) için farklı konsantrasyonlarda immobilize reseptör (Integrin α2A-etki alanı)
<ol><li>Engelleme çözüm microtiter plaka kuyulardan vakum bir çizgiyle kaldırın.</li>
	<li>Hemen rhodocetin çözüm %1 50 µL eklemek BSA/TBS, pH 7.4/MgCl2 çözüm test tüpüne wells sütun 1, deney tüpü #2 sütun 2,vb ekle 50 µL TBS, pH %7,4 1 BSA, kuyu için çözüm #1 , 2 mM MgCl2 (arabellek engelleme ve seyreltme) ligand-Alerjik denetimi olarak sütun (bkz: microtiter plaka, şekil 1yerleşimini) 12 kuyu için.</li>
	<li>Wells folyo ile yeniden mühürlemek veya bir kapak ile kapatın.</li>
	<li>Wells, oda sıcaklığında (20-22 ° C civarında) 1,5 saat için kuluçkaya.</li>
</ol>8. yıkama Wells, plaka iki kez HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 ile
<ol><li>Bağlı olmayan ligand molekülleri kaldırmak için bağlama çözüm kaldırın ve her doldurmak HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL ile iyi. Sonra yıkama çözüm kaldırın.</li>
	<li>Kendine iyi bak kuyuları kuru olmazlar. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.</li>
	<li>Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.</li>
</ol>9. reseptör bağlı Ligand %2.5 ile düzeltmek HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 oxazolidin
<ol><li>Bir taze % 2.5 oxazolidin çözüm %1 25 oxazolidin çözümün parçası ve HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl29 bölümlerini karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>Her şey microtiter plaka HBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%22.5 oxazolidin çözümünde 50 µL ile doldurun. Oda sıcaklığında 10 dk microtiter plaka kuluçkaya.</li>
</ol>10. plaka üç kez yıkama Wells'le TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2 50 µL/kuyu
<ol><li>-E doğru çıkarmak ve aşırı oxazolidin devre dışı bırakabilirsiniz, fiksasyon çözümü kaldırmak ve her doldurmak TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL ile iyi. Yıkama çözüm kaldır. Not: microtiter plaka oxazolidin içeren fiksasyon çözüm bir tabak içine dökün ve sonra bu TBS, pH 7.4 eşit bir birimi tarafından inaktive fiksasyon çözüm atın.</li>
	<li>Kendine iyi bak kuyuları kuru olmazlar. Bu nedenle, kalan sıvı kaldırmak için bir doku bez microtiter tabağa dokunun değil. Multistep bir pipet veya çok kanallı pipet kuyuları hızlı bir şekilde doldurmak için kullanın.</li>
	<li>İki kez bu çamaşır tekrarlayın.</li>
</ol>11. reseptör bağlı Ligand tarafından ELISA miktar
<ol><li>TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA 50 µL/iyi birincil antikor çözüm ekleyin. Birincil antikor bir tavşan anti-serum rhodocetin19karşı kaldırdı, 1:2,000 TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA içinde seyreltilmiş çözümdür.</li>
	<li>75-90 dk oda sıcaklığında plaka kuluçkaya. Plaka bütün wells üç kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl250 µL/kuyu ile yıkayın. Adımları yıkama, microtiter plaka üzerine bir doku dokunarak üç sırasında bez gerekli değildir.</li>
	<li>TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA 50 µL/iyi ikincil antikor çözüm ekleyin. Bu amaçla, ikincil antikor, keçi antikorlar immünglobulin hedefleme tavşan TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl%21 BSA içinde 1:2,000 için alkalen fosfataz ile Birleşik oranında seyreltin. 75-90 dk oda sıcaklığında plaka kuluçkaya.</li>
	<li>4-nitrophenyl fosfat disodyum tuzu hekzahidrat (fosfataz substrat) AP arabellek (0.1 M glisin çözüm, 1 mM MgCl2 ve 0.2 mM Zn(II)-acetate) içeren pH 10.4,. 5 ml içeren bir 5 mg tablet çözülerek AP tespit edici çözüm hazırlamak</li>
	<li>Plaka bütün wells üç kez TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl2, hemen sonraki adım gerçekleştirmeden önce 50 µL/kuyu ile yıkayın. Bir doku bez microtiter tabağa son yıkama adımdan sonra sıvı tüm izlerini kaldırmak için dokunun.</li>
	<li>50 µL/iyi AP tespit edici çözüm microtiter plaka wells için ekleyin. AP tespit edici çözüm derhal mümkün olduğunca aynı anda enzimatik dönüşüm başlatmak için bütün wells ekleyin. Bu nedenle, bir çok kanallı pipet kullanın.</li>
	<li>En yüksek ligand konsantrasyonu Wells'le çözümde çevirmek kadar sarı oda sıcaklığında plaka kuluçkaya. Not: Kuluçka süresi 5 min ve sinyal şiddeti bağlı olarak 1 saat arasında değişebilir.</li>
	<li>Fosfataz substrat çevrimi 50 µL/iyi 1.5 M NaOH çözüm ekleyerek durdurmak. Her iki çözüm de çizgi-Alerjik karıştırma sağlamak birkaç dakika için plaka ayakta bırakın. Aynı kuluçka dönemi bütün wells emri için bir çok kanallı pipet kullanın ve kuyu Bu adımda 11,8 AP tespit edici substrat olarak eklenen aynı sırada 1.5 M NaOH ekleyin.</li>
	<li>Optik yoğunluk (OD) ölçmek 405 nm her iyi bir ELISA okuyucu tarafından.</li>
</ol>12. titrasyon sinyalleri değerlendirilmesi
<ol><li>Ham veri, OD405nm değerleri tablo Excel ile açın. Titrasyon eğrileri bu sinyal değerleri satırları okurken, değerleri bir sütun ve başka bir sütun eklenen ligand konsantrasyonları ile etiket işlemi tersine çevir.</li>
	<li>Graphpad prizma 5 (sürüm 5.0) açın. Ana menüde yeni bir proje dosyasını açın. Yeni veri ve grafikaltında XY biçimini seçin. Y ekseni için Enter ve arsa her değer için tek bir noktadan seçeneğini seçin.</li>
	<li>İki sütun, eklenen ligand konsantrasyonu kopyalayın ve değerleri (OD405nm ) Excel dosyası ve GraphPad prizma veri sayfası yapıştırın sinyal X ve Y değerleri, sırasıyla.</li>
	<li>GraphPad prizma 5 analiz alt programı açın ve Non-linear regresyon XY-analizaltında seçeneğini seçin. Kullanıcı tanımlı denklemi seçin ve yeni bir denklemi oluşturmak için Yeni düğmesine basın.</li>
	<li>Titrasyon eğrisi denklem şeklinde yazın: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) + Smin + B * X Y S, sinyal değeri eklenen ligand L konsantrasyonu varlık ile yeni açılan şablon sayfasına , Konsantrasyonu olmak R immobilize reseptör, ayrışma sabiti olan K ve B arka olmak inişli. K gibi uygun kısıtlamaları tanımlamak > 0 ve R > 0. Not: Bu denklem Denklem 9 farklı bir formu aynı denklemdir.</li>
	<li>Veri sayfasının değerleri yeni oluşturulan kullanıcı tanımlı denklem seçerek analiz. Tablo hesaplanan yaklaşım değerleri ile açın (K, Rt, Smax, Sminve B) hangi yazılım ekranın sol tarafında sonuç bölümü altında gösterilir. Not: Yazılım titrasyon eğrisi en az 5 veri noktalarından oluşuyorsa yinelemeli doğrusal olmayan regresyon yaklaştırarak 5 parametreleri belirler.</li>
	<li>Parametreleri K, Rt, Smax, Sminve B titrasyon eğrileri her grup için istatistiksel olarak değerlendirmek ve parametreleri (mutasyona uğramış veya kimyasal olarak değişikliğin ligand veya reseptör) grup belirli özelliği ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Klotz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+law+of+mass+action+to+binding+by+proteins;+interactions+with+calcium.">The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium.</a> Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).</li><li>Klotz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-receptor+complexes:+origin+and+development+of+the+concept.">Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept.</a> J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).</li><li>Bisswanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+1:+Multiple+Equilibria,+Principles+and+Derivations.">Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations.</a> Enzyme Kinetics: Principles and Methods. , 1-26 (2017).</li><li>Shimura, K., Kasai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+gel+titration:+quantitative+analysis+of+the+binding+equilibrium+between+immobilized+protein+and+free+ligand+by+a+continuous+titration+procedure.">Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure.</a> Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).</li><li>Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-aptamer+binding+studies+using+microchip+affinity+capillary+electrophoresis.">Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis.</a> Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).</li><li>Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+binding+affinities+by+pulse+proteolysis:+application+to+TEM-1/BLIP+protein+complexes.">Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes.</a> Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).</li><li>Latour, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Langmuir+isotherm:+a+commonly+applied+but+misleading+approach+for+the+analysis+of+protein+adsorption+behavior.">The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior.</a> J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).</li><li>Stockell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binding+of+diphosphopyridine+nucleotide+by+yeast+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase.">The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.</a> J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).</li><li>Heyn, M. P., Weischet, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+and+fluorescence+studies+on+the+binding+of+ligands+to+the+&#945;+subunit+of+tryptophan+synthase.">Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the &#945; subunit of tryptophan synthase.</a> Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).</li><li>Campbell, I. D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+structure,+activation,+and+interactions.">Integrin structure, activation, and interactions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).</li><li>Zeltz, C., Gullberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin-collagen+connection--a+glue+for+tissue+repair?.">The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair?.</a> J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).</li><li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions.">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).</li><li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+integrin+regulation+and+signaling.">Structural basis of integrin regulation and signaling.</a> Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).</li><li>Luo, B. H., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+structures+and+conformational+signaling.">Integrin structures and conformational signaling.</a> Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).</li><li>Ricard-Blum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collagen+family.">The collagen family.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978 (2011).</li><li>Eble, J. A., Tuckwell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;2&#946;1+integrin+inhibitor+rhodocetin+binds+to+the+A-domain+of+the+integrin+&#945;2+subunit+proximal+to+the+collagen-binding+site.">The &#945;2&#946;1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin &#945;2 subunit proximal to the collagen-binding site.</a> Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).</li><li>Eble, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;2&#946;1+integrin-specific+antagonist+rhodocetin+is+a+cruciform,+heterotetrameric+molecule.">The &#945;2&#946;1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule.</a> FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).</li><li>Eble, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+and+concerted+conformational+changes+enable+rhodocetin+to+block+&#945;2&#946;1+integrin+selectively.">Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block &#945;2&#946;1 integrin selectively.</a> PLoS Biol. 15 (7), e2001492 (2017).</li><li>Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reveal+the+alteration+of+the+rhodocetin+structure+upon+&#945;2&#946;1+integrin+binding.">Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon &#945;2&#946;1 integrin binding.</a> Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).</li><li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunizations.">Chapter 5: Immunizations.</a> Antibodies, a laboratory manual. 5, 53-138 (1988).</li><li>Lu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+interactions+between+SSB+and+proteins+by+the+use+of+fluorescence+anisotropy.">Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy.</a> Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).</li><li>Fielding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+determination+of+protein-ligand+dissociation+constants.">NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants.</a> Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).</li><li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).</li><li>McDonnell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance:+towards+an+understanding+of+the+mechanisms+of+biological+molecular+recognition.">Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition.</a> Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis.">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).</li><li>Pesquero, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+and+kinetic+parameter+estimation+of+the+affinity+interaction+of+jArtinM+and+rArtinM+with+peroxidase+glycoprotein+by+the+electrogravimetric+technique.">Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique.</a> Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).</li><li>Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+acquisition+and+analysis+of+microscale+thermophoresis+data.">On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data.</a> Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).</li></ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Titrasyon ELISA Reseptör-ligand etkileşim ayrılma belirlemek için bir çok yönlü test sistemidir. Titrasyon ELISA ücretsiz ve ilişkili ligandlar etkili bir şekilde ayırmak için ve onların konsantrasyonları nicelik, çözümlemek için önemli ölçüde daha fazla çalışmalar zorunluluk kaçınmanızı sağlar ve yayınlar titrasyon ELISAs bağlama eğrileri kayıt yerine istihdam . Ayrıca, titrasyon ELISAs gerçekleştirmek ve reseptör ve ligand oldukça düşük miktarda gerektirir kolaydır. Ayrılma s...

Ayrışma sabiti K bir reseptör (R) benzeşim onun ligand (L) açıklamak için önemli bir parametredir. Kitlesel eylem hukuk üzerinde bağlı olarak, K içinde Reseptör-ligand karmaşık RL R reseptörü ve ligand L: ayrışıp denge için tanımlanan
<img alt="Equation 1 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq1.jpg">            Denklem 1
reseptör ve ligand ücretsiz/ilişkisiz durumunu gösteren endeksi f ile. Reseptör-ligand kompleks RL, konsantrasyon reseptör bağlı ligand Lbkonsantrasyon için aynıdır. Reseptör Rt toplam konsantrasyonu ücretsiz reseptör Rf ve ligand bağlı reseptör Rb toplamı olarak = Lb, ayrışma sabiti olarak da yazılabilir:
<img alt="Equation 2 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq2.jpg">        Denklem 2
Bu nedenle, doygunluk ilişkili ligand Lb reseptör Rttoplam konsantrasyonu ilişkisi kesir olarak tanımlanmış Y, verim,
<img alt="Equation 3 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq3.jpg">        Denklem 3
Ücretsiz ligand Lfkonsantrasyon üzerinde bağlıdır:
<img alt="Equation 4 " src="/files/ftp_upload/57334/57334eq4.jpg">        Denklem 4
Hiperbolik bu ilişki bir Reseptör-ligand etkileşim bağlama eğriyi tanımlayan ve onun arsa ilişkili ligand Lb toplama ücretsiz ligand Lfkonsantrasyonu bir fonksiyonu olarak gösterir. Bağlama eğrisi ayrışma sabiti K, yarı-azami doygunluk verim ücretsiz ligand konsantrasyonu olarak elde edilebilir. Ayrıca, bağlama eğrileri linearize farklı algoritmaları, gibi çift karşılıklı arsa Klotz1,2veya Scatchard veya Hanes (Bisswanger3tarafından gözden) göre dönüşümleri tarafından kurulmuştur. Ancak, tüm algoritmaları asimptotik ücretsiz ligand bağlayıcı eğri yüksek konsantrasyonlarda yaklaştı doygunluk verim maksimum değeri bir grafik öncesi değerlendirilmesinde tahmin edilecek sahip ve bu nedenle sorunu muzdarip hataya.
Buna ek olarak, bir bağlama eğrisi belirlenmesi ücretsiz ve ilişkili ligand miktar sırasında bağlama denge gerektirir. Bu amaçla, ücretsiz ligand reseptör bağlı ligand ayrılmış ve sayısal gerekiyor. Bu nedenle, ligand ve reseptör protein ligand olarak karşı bir protein reseptörü gibi özellikleri, farklı gerekir. Her iki bağlama ortak proteinler ise, kendi boyutları, ücret veya diğer moleküler özellikleri ayırt olmak zorundalar. Yine de, küçük ölçekli bağlama yaklaşımlar konsantrasyonlarda ligand miktar zor bir iştir. Özellikle reseptörleri önemli miktarda kullanılabilir veya uygun olmasa radyoaktif ligand etiketleme genellikle ilişkili ligand, düşük yoğunlukta algılamak gerekli oldu. Ayrıca, reseptör bağlı ligand-ihmal edilebilir bir şekilde sırasında ve sonrasında yalıtım ayırmak. Bu nedenle, denge jel filtrasyon4, Kapiler Elektroforez5ve nabız proteolizis6, gibi karmaşık yöntemler reseptör bağlı ligand ölçmek ve ücretsiz ligand ayırmak için gereklidir.
Bu bağlama deneyleri aksine titrasyon deneyler ilişkili ve ücretsiz ligand nicel ayrılması gerek yoktur. Bu amaçla, bir reseptör sabit bir konsantrasyon, eklenen ligand farklı konsantrasyonları ile titre. Reseptör için bağlama tarafından ilişkili ligand ücretsiz ligand ayıran ve örneğin, fotometri, fluorometry veya antikor algılama, ölçülebilir biyofiziksel bir özelliğe sahiptir. Böylece, bir sinyal ile doygunluğu ile doğru orantılıdır S Y verim ve sonuç olarak da reseptör bağlı ligand (Lb) konsantrasyon için eklenen ligand (Lt) toplam konsantrasyonu bir fonksiyonu olarak algılanır. Parametreleri, sinyal S ve eklenen ligand toplam konsantrasyonu ilişkili ve ücretsiz ligand konsantrasyonu daha doğrudan ve kolay bir şekilde sayılabilir. Özellikle, reseptör bağlı ligand enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından algılanmasını 100 µL aşağıda örnek birimlere azaltılması yanı sıra birkaç ligand konsantrasyonu paralel ölçümleri çok iyi microtiter levha izin. Bir titrasyon ELISA, bir reseptör fiziksel olarak aynı toplama bir microtiter plaka adsorbe ve çözünür ligand ile titre. Reseptör plastik yüzeye aslında hidrofobik adsorpsiyon tarafından immobilize. İmmobilize reseptör ilişkilendirir yüzey konsantrasyon reseptör Langmuir´s adsorpsiyon izoterm7göre muhtemel bir doğrusal olmayan ilişkide kaplama konsantrasyonu ile. Genel adsorbe reseptör molekülleri ek olarak, etkinlik durumlarına titrasyon deneyleri için başka bir önemli parametre sayısıdır. Sadece hangi ligand bağlayıcı faaliyet korunur, titrasyon tahlil için uygundur ve sonunda etkin reseptörleri Rt doğrudan belirlenemez titrasyon testin toplam konsantrasyonu katkıda reseptörleri immobilize.
İmmobilize reseptör tarafından kapsanmayan siteleri plastik yüzeyi ligand gibi diğer proteinler absorbe yatkındır. Tür plastik yüzey sitelerde ligand fiziksel adsorpsiyon reseptör bağlı ligand olarak benzer bir sinyal, henüz belirsiz bir şekilde sonuçlanır. Bu nonspesifik sinyal plastik yüzey siteleri hangi protein ile kaplı değil henüz sığır serum albumin (BSA)-ecek var olmak kütük parçası microtiter plakaların azaltmak için. Ancak, bazı Reseptör-ligand titrasyon deneyleri için spesifik olmayan arka plan sinyalleri gözlenen. O zaman, engelleme diğer ajanlar gibi bir çözüm % 0,2 jelatin veya %0,04 ara 20, önerilir.
Reseptör için bağlama sonra ücretsiz ligand tarafından iki çamaşır adımı kaldırılır. Microtiter iyi plastik yüzeye immobilize ve isteğe bağlı olarak kimyasal fiksasyonu tarafından güçlendirilmiş reseptör ile ilişkili ligand kalır. Sonraki kovalent çapraz-bağlantı için ilişkili ligand ve oxazolidin ile immobilize reseptör arabellek madde TRIS ligand bağlayıcı herhangi bir değişiklik olmadan HEPES için değiştirilir. TRIS, aksine HEPES oxazolidin devre dışı değil. Oxazolidin ile kovalent çapraz bağlantı ile onun reseptör ilişkili ligand giderir ve onun ayrılma sonraki çamaşır ve kuluçka adımları sırasında engeller. Böylece, Reseptör-ligand etkileşimi kimyasal dondurulur ve çamaşır ve kuluçka sonraki adımlarla etkilenmez bir titrasyon eğrisi garanti eder. Ancak, oxazolidin fiksasyon kimyasal olarak ligand ve reseptör etkileşimlerini azaltılmış veya kaldırılmış şekilde değiştirebilir. Ayrıca, özellikle Monoklonal antikor ilişkili ligand ölçmek için kullanılıyorsa epitopları ligand içinde değişiklik algılama antikor bağlama benzeşme değişebilir. Oxazolidin fiksasyon bu olumsuz etkilerin ikisi de bu titrasyon ELISA oluşmakla birlikte, test oxazolidin karşı duyarlılığını titrasyon deney öncesinde her Reseptör-ligand etkileşim için test edilmelidir. Fiksasyon sonra aşırı oxazolidin TRIS içeren bir arabellek ile üç yıkama adımda kaldırılır. TRIS nonspecifically antikorlar sonraki adımda algılama ile tepki kalan aldehit gruplarını inaktive.
Fotometrik ELISA sinyal S. sağlayan enzim bağlı antikorlar ile ilişkili ligand miktarını sayısal Bu eklenen toplam ligand konsantrasyonu Lt karşı çizilir her şey için. Onun daha kolay satın alma rağmen titrasyon eğrisi hiperbolik işlevi bağlama eğrisi aksine değil. Ayrıca, nasıl bir titrasyon eğrisi üzerinden ayrışma sabiti K hesaplamak için belli olmuştur. Algoritmalar spectroscopically Edinsel titrasyon eğrileri linearize bağımsız olarak Stockell8 ve Hey ve Weischet9tarafından bildirilmiştir rağmen yüksek sinyal tahmin onların belirsizlik nedeniyle yetersiz kalmışlar değeri doygunluk verim eklenen ligand yüksek konsantrasyonları yaklaşıyor.
Burada, bir titrasyon ELISA ve doğrusal regresyon algoritması titrasyon eğrisi Reseptör ligand müdahalesini ayrışma sabiti K türetmek açıklanmıştır. Bu protokol ile bir yılan zehri elde edilen inhibitörü kollajen bağlayıcı A-etki integrin α2β1, etkileşim için örneklenir. İntegrinler hücrelerin etrafındaki hücre dışı matriks veya temel membran10,11anchorage aracılık hücre adezyon molekülleri vardır. Ayrıca, ek moleküller sinyal ve yeni hücre organelleri, adhesomes, hücre-matris etkileşim12,13, üzerine şekillendirme işe integrinler hücreleri ve hücre dışı matriks arasında önemli sinyalleri iletmek 14. kollajen, α2β1 Integra, ligand insan vücudunun en bol protein ve bağ dokusu15önemli iskele bileşenidir. Α2β1 integrin ve kollajen arasındaki etkileşimi bir integrin α2 alt birimi A etki tarafından aracılık ettiği. İntegrin α2A-etki alanı, kollajen bağlama için gereklidir ve yapısını stabilize bir divalent ba * içerir. Mutantlar hangi biri gibi yüzey maruz kalan Y216 glycine için yerine α2A etki alanının yanı sıra yaban türü formlar kolayca recombinantly bir bakteriyel ifade sisteminde üretilen ve onların oligo-His-etiketleri ile bir NiNTA ile izole bir sonraki diyaliz TRIS arabelleğe alınmış serum (TBS; 50 mM TRIS/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) içeren 2 mM MgCl216karşı montaj sütun. Bicinchoninic asit tahlil (BCA) ile onların konsantrasyonları belirlenmiştir ve onların eroine geleneksel SDS-PAGE tarafından test edilmiş ve Coomassie-parlak mavi R250 ile lekeli.
Α2β1 integrin ve kollajen arasındaki etkileşimi bağlama yılan zehri bileşeninin Malaya çukur engerek (Calloselasma rhodostoma)16,17rhodocetin tarafından engellendi. Bu titrasyon ELISA içinde çözünür bir ligand olarak kullanılan, rhodocetin ham saflaştırıldı16daha önce açıklandığı gibi zehir. HEPES arabelleğe alınmış serum (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl) içinde çözünmüş ve -20 ° C'de dondurulmuş depolanır Onun konsantrasyonu BCA tarafından tespit edildi ve saflığı SDS-PAGE tarafından kanıtlanmış oldu. Bir antagonisti rhodocetin sadece kollajen için integrin bağlama engeller α2β1 A etki alanı, ama aynı zamanda böylece herhangi bir kollajen hücreleri ya da trombosit18sinyal önleme integrin etkin olmayan biçimi stabilize. Rhodocetin reseptör hedefine ile ayrışma sabiti belirlemek ve böylece onun moleküler mekanizması ve ilaç potansiyel örneğin, antitrombotik bir ajan olarak çözmek Biyomedikal büyük önem taşımaktadır. Bu amaçla, ELISA onun değerlendirme de dahil olmak üzere anlatılan bir titrasyon hangi bir 1:1 etkileşim stoichiometry ile hemen hemen her Reseptör-ligand etkileşim için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>TRIS</td><td>neoFrox</td><td>1125KG001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Applichem</td><td>1,316,591,214</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>172571</td><td></td></tr><tr><td>integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant</td><td></td><td>isolated in author&#039;s lab</td><td></td></tr><tr><td>NiNTA superflow column&amp;nbsp;</td><td>Qiagen, Germany</td><td>30821</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie-Brilliant Blue R250</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumine (BSA), fraction V</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>25 % solution of glutaraldehyde</td><td>Merck</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9919</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Applichem</td><td>A1377</td><td></td></tr><tr><td>Zn(II)-acetate</td><td>Applichem</td><td>A4324</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Applichem</td><td>A1551</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0942</td><td></td></tr><tr><td>Costar half-area microtiter plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>Corning 3690</td><td></td></tr><tr><td>micro reaction tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Microplate ELISA reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td></td></tr></tbody></table>

titration elisa as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction

Ayrışma sabiti bağlama denge iki ortağı arasındaki etkileşim açıklar ve onların ilgi bir ölçüsüdür. Farklı ligandlar, örneğin, rekabetçi inhibitörleri, protein izoformlarının ve mutantlar için bağlama güçlerini bağlama ortağa karşılaştırmak için çok önemli bir parametredir. Ayrılma sabitler ilişkili karşı ücretsiz ligand konsantrasyonu olarak bağlama eğrileri komplo tarafından belirlenir. Buna ek olarak, ilişkili ligand konsantrasyonu orantılı bir sinyal eklenen ligand, toplam konsantrasyonu karşı çizilen titrasyon eğrileri kaydetmek çok daha kolaydır. Sinyal spectroscopically ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından tespit edilebilir. Bu bir titrasyon yılan zehri elde edilen rhodocetin α2β1 Integra, onun immobilize hedef etki alanına bağlama ölçer ELISA için bir protokol içinde örneklenir. Titrasyon ELISAs çok yönlü ve geniş kullanılmış. Herhangi bir çiftini etkileşen proteinlerin immobilize reseptörü ve çözünür ligand her iki protein saf ve onların konsantrasyonları bilinen koşuluyla kullanılabilir. Zorluk defa ayrışma sabiti titrasyon eğrisi üzerinden belirlemek olmuştur. Bu çalışmada, titrasyon eğrileri altta yatan bir matematiksel işlev giriliyor. Bir doygunluk verim herhangi bir hataya grafik tahmini, bu algoritma doğrusal olmayan regresyon ile matematiksel değerlendirme tarafından doğrudan ham veri (sinyal kırmızının koyulukları eklenen ligand farklı konsantrasyonlarda) işleme izin verir. Böylece, birkaç titrasyon eğrileri aynı anda kaydedildi ve aralarında ayrışma sabiti ve bağlama-aktif reseptör, konsantrasyon karakteristik parametreleri kümesini haline dönüştürdü ve istatistiksel olarak değerlendirilebilir. Bu algoritma ile birleştirildiğinde, titrasyon ELISAs doğrudan ayrışma sabiti sunma avantajı kazanmak. Bu nedenle, onlar daha verimli bir şekilde gelecekte kullanılabilir.

ELISA sonra geliştirilmiştir, dönüştürülmüş alkalen fosfataz substrat, para- nitrophenolate sarı rengini, ilişkili rhodocetin ligand tutarı eklenen rhodocetin konsantrasyonları azaltılarak azalır gösterir sütun 1-11 (şekil 1). Sütun 12 rhodocetin-Alerjik Wells renksiz wells bir düşük arka plan sinyal göster.
Fotometrik miktar itibariyle 405 nm doğrudan bir analiz yaz...

Watch this Scientific Journal Video about Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction at JoVE.com

Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

The dissociation constant describes the interaction between two partners in the binding equilibrium and is a measure of their affinity. It is a crucial ...

titration-elisa-as-method-to-determine-dissociation-constant-receptor

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

19.6K Görüntüleme.  University of Münster. Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Video: Titration ELISA as a Method to Determine the Dissociation Constant of Receptor Ligand Interaction

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Kimya

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a major pharmacological target for multiple indications, including analgesia, blood pressure regulation, and the treatment of psychiatric disease. Upon ligand binding, GPCRs catalyze the activation of intracellular G-proteins by stimulating the incorporation of guanosine triphosphate (GTP). Activated G-proteins then stimulate signaling pathways that elicit cellular responses. GPCR signaling can be monitored by measuring the incorporation of a radiolabeled and non-hydrolyzable form of GTP, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), into G-proteins. Unlike other methods that assess more downstream signaling processes, [35S]GTP&#947;S binding measures a proximal event in GPCR signaling and, importantly, can distinguish agonists, antagonists, and inverse agonists. The present protocol outlines a sensitive and specific method for studying GPCR signaling using crude membrane preparations of an archetypal GPCR, the &#181;-opioid receptor (MOR1). Although alternative approaches to fractionate cells and tissues exist, many are cost-prohibitive, tedious, and/or require non-standard laboratory equipment. The present method provides a simple procedure that enriches functional crude membranes. After isolating MOR1, various pharmacological properties of its agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), and antagonist, naloxone, were determined.

Guanosine triphosphate (GTP) binding is one of the earliest events in G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) activation. This protocol describes how to pharmacologically characterize specific GPCR-ligand interactions by monitoring the binding of the radio-labeled GTP analog, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), in response to a ligand of interest.

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Biyokimya

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Optimized Methods for the Surface Immobilization of Collagens and Collagen Binding Assays

Fibrosis occurs in various tissues as a reparative response to injury or damage. If excessive, however, fibrosis can lead to tissue scarring and organ failure, which is associated with high morbidity and mortality. Collagen is a key driver of fibrosis, with type I and type III collagen being the primary types involved in many fibrotic diseases. Unlike conventional protocols used to immobilize other proteins (e.g., elastin, albumin, fibronectin, etc.), comprehensive protocols to reproducibly immobilize different types of collagens in order to produce stable coatings are not readily available. Immobilizing collagen is surprisingly challenging because multiple experimental conditions may affect the efficiency of immobilization, including the type of collagen, the pH, the temperature, and the type of microplate used. Here, a detailed protocol to reproducibly immobilize and quantify type I and III collagens resulting in&#160;stable and reproducible gels/films is provided. Furthermore, this work demonstrates how to perform, analyze, and interpret in vitro time-resolved fluorescence binding studies to investigate the interactions between collagens and candidate collagen-binding compounds (e.g., a peptide conjugated to a metal chelate carrying, for example, europium [Eu(III)]). Such an approach can be universally applied to various biomedical applications, including&#160;the field of molecular imaging to develop targeted imaging probes, drug development, cell toxicity studies, cell proliferation studies, and immunoassays.

This work presents an optimized protocol to reproducibly immobilize and quantify type I and III collagen onto microplates, followed by an improved in vitro binding assay protocol to study collagen-compound interactions using a time-resolved fluorescence method. The subsequent step-by-step data analysis and data interpretation are provided.

Fibrosis occurs in various tissues as a reparative response to injury or damage. If excessive, however, fibrosis can lead to tissue scarring and organ ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

Biyoloji

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Nörobilim

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Competitive Binding Assay to Identify Compounds Disrupting Receptor-Ligand Interactions

Source: Schoofs, G., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57271">A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we describe a flow cytometry-based competitive binding assay to detect the interactions between the CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) and its fluorescently-labeled natural ligand CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), in the presence of a CXCR4-targeting small molecule. Incubating CXCR4-expressing cells with lower small molecule concentrations allows CXCR4-CXCL12 binding to some extent, which progressively declines upon a gradual increase in small molecule concentrations.

Reseptör-ligand etkileşimlerini bozan bileşikleri tanımlamak için rekabetçi bağlanma testi

Source: Schoofs, G., et al. A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

Biyomoleküler Etkileşim Tespit Teknikleri

Protein-protein

ELISA-Based Reporter Assay to Study the Receptor-Ligand Interaction in BW Cells

Source: Elias, S. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58685">A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the reporter assay-based detection of the receptor-ligand interaction. The successful receptor-ligand interaction activates the downstream signaling pathway, causing the generation and release of cytokines as secretory reporter molecules in the solution, which is confirmed using ELISA.