Bu eser NIH tarafından desteklenen DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R verin.

1. arabellek hazırlık
<ol><li>Arabellek (2 x PBS, pH 7,9) etiketleme: 400 ml deiyonize distile (DD) su 100 mL 10 x PBS ekleyin, pH 7,9 NaOH ile için ayarlayın.</li>
	<li>biotin 3 mM: 1 mg biotin arabellek etiketleme 588 µL içinde çözülür.</li>
	<li>3 mM Sulfo-etiket: Sulfo-etiket dağıtılması 150 nmol arabellek etiketleme 50 µL içinde.</li>
	<li>Antijen arabellek (%5 BSA): 500 mL 1 x PBS, 25 g, sığır Serum Albumin (BSA) ekleyin.</li>
	<li>0, 5 M Asetik asit çözüm hazırlamak.</li>
	<li>Tris-HCl tampon pH 9.0 1,0 M: hazırlamak 1 M Tris-HCl tampon ve pH HCl ile 9.0 için ayarlayın.</li>
	<li>Kaplama arabellek (%3 kütük parçası A): 500 mL 1 x PBS, engelleyici A. 15 g ekleyin</li>
	<li>Çamaşır arabellek (% 0.05 ara 20, PBST): 5000 mL 1 x PBS, ara 20 2.5 mL ekleyin.</li>
	<li>Okuma arabelleği (2 okuma arabelleği T ile yüzey aktif x): DD su 500 mL, 500 mL 4 x okuma arabelleği T yüzey aktif (Malzemeler tablo) ile ekleyin.</li>
	<li>Biotin ve Sulfo-etiket-20 ° C dondurucuda saklayın. Not: Her ikisi de Biotin ve Sulfo-etiket çözümleri her zaman taze hazırlanmış sadece etiketleme yordamı önce.</li>
</ol>2. etiket Biotin ve Sulfo-etiketi ile insan adacık Autoantigen
Not: Antijen, ≥0.5 mg/mL, yüksek yoğunlukta bir daha verimli etiketleme tepki için önerilir.
<ol><li>Biotin ve Sulfo-etiket için insan adacık autoantigen molar oranını belirler.<ol>
<li>Antijen molar numarası tarafından Moleküler ağırlık antijen ağırlık bölerek elde etmek.</li>
		<li>Molar oranı 1:5 küçük molekül ağırlıklı (≤10 kd) antijen ve molar oranı 1:20 büyük molekül ağırlığı ile antijen için kullanın (> 50 kd).</li>
		<li>Birimin Biotin veya Sulfo-etiket için onun konsantrasyon tarafından molar numarası bölünerek hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İnsan adacık autoantigen Biotin veya Sulfo-etiketi ile 1:5 molar oranı ile karıştırın. Not: Tris veya glisin tampon sistemleri protein miktarının 2 katı PBS tampon pH boyutlandırma spin kullanarak 7.9 ile alışverişinde sütun.</li>
	<li>Biotin ve Sulfo-etiket ışığa duyarlı olduğundan, alüminyum folyo ile reaksiyon tüplerin kapak. Reaksiyon, oda sıcaklığında (RT) 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sırasında spin sütun tarafından dağıtım 2 x PBS arabellek sütuna üç kez Başbakan. Belgili tanımlık eriyik vasıl 1000 x g 2 dk santrifüj kapasitesi her zaman. Not: Şu anda köprüleme, aracılığıyla etiketleme tepkisi, hala meydana gelen ve durdurulması gerekiyor.</li>
	<li>Etiketleme tepki etiketli insan adacık autoantigen arındırıcı tarafından durdurmak. Arındırmak için spin sütunu boyunca autoantigen geçmek ve 1000 x g 2 min için adresindeki sütun santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Antijen protein ve son hacim miktarda kullanarak etiketli antijen konsantrasyonu (µg/µL) belirlemek. Not: Kabaca, orada-ecek var olmak % 90-95 saklama etiketli antijen her spin sütun geçtikten sonra.</li>
	<li>Aliquot-80 ° C'de etiketli antijen ve mağaza etiketli antijen</li>
</ol>3. en iyi konsantrasyonları ve oranları iki etiketli antijenleri için tahlil (ekose desenli kurulu tahlil) tanımlamak
<ol><li>İki serum numuneleri, yüksek pozitif bir, her 200 µL toplam hacmi ile negatif ve bir tane hazırlayın.</li>
	<li>Aliquot 4 µL serum ve son hacim 96-şey PCR plaka için iyi başına 20 µL olana 1 x PBS ekleyin. Bir tabak yarısı yüksek olumlu örnek ve olumsuz örnek için diğer yarısı için şekil 2Agösterildiği gibi kullanın.</li>
	<li>10 µL biotin ve Sulfo-etiketi için iki farklı etiketli antijenler antijen ve davranış seri dilutions gösterildiği şekil 2Aetiketli 10 µL ekleyin. Bir etiketli antijen için yatay bir seri seyreltme ve etiketli diğer antijen için dikey bir seri seyreltme çalıştırın.</li>
	<li>5.3-9.1 içinde açıklanan tahlil adımları geri kalanı devam.</li>
	<li>Yüksek olumlu örnek her şekil 2Biçinde gösterilen negatif örnekten karşılık gelen sinyallerin karşı gelen sinyalleri oranını hesaplamak.</li>
	<li>Biotin için en iyi konsantrasyonları tanımlamak ve bir nokta ile en yüksek veya en yüksek oranı negatif pozitif yakınındaki seçerek antijenleri Sulfo-etiket etiketli. Oranı belirlemek için olumsuz örnek düşük arka plan sinyalini göz önünde bulundurun. Not: Adım 4 adım 6 için tahlil gün 1 içerir.</li>
</ol>4. hazırlayın Antigen arabelleği Biotin/Sulfo-tag antijen etiketli doğru konsantrasyon kullanarak
<ol><li>Her antijen Denetleyicisi Yönetim Kurulu tahlil üzerinde dayalı rasyonel konsantrasyonu seçin.</li>
	<li>Antijen çözüm Biotin/Sulfo-tag antijen antijen arabelleği için etiketli rasyonel konsantrasyon kullanarak plaka başına 3 mL hazırlayın.</li>
</ol>5. Serum numuneleri etiketli antijen ile kuluçkaya
Not: Bu bölümde iki protokol, serum asit tedavisi olmayan kişi ve bir serum asit tedavisi ile vardır. Oysa IAA tahlil adımları atlar ve serum asit tedavisi adımlardan 5.6-5,9 ile iletişim kuralını kullanan tüm adacık antikor deneyleri IAA tahlil dışında adımlardan 5.1-5,5, serum asit tedavi olmadan normal protokol kullanın.
<ol><li>Aliquot 4 µL serum ve son hacim 96-şey PCR plaka için iyi başına 20 µL olana 1 x PBS ekleyin.</li>
	<li>Etiketli antijen çözüm iyi başına 20 µL ekleyin.</li>
	<li>PCR plaka folyo ışık önlemek için mühürleme ile kapak.</li>
	<li>Bir shaker (düşük hız) RT, 2s için plaka koymak.</li>
	<li>4 ° C buzdolabında plaka koymak ve kuluçkaya geceleme (18-24 h). Not: Aşağıdaki protokol 5.6 adım ile 5,9 sadece IAA tahlil için tasarlanmıştır ve diğer antikor deneyleri bu adımları atlayın.</li>
	<li>18 µL serum örnekleri için 0,5 M Asetik asit ile Mix 15 µL serum. RT bu karisimin 45 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Biotin ve Sulfo-antijen Denetleyicisi Yönetim Kurulu tahlil dayalı, etiketli antijen tampon kullanarak etiket rasyonel konsantrasyon antijen Çözümle hazırlayın. Her iyi, yeni bir PCR plaka antijen, aliquot 35 µL antijen arabelleği, Biotin ve Sulfo-etiketi içeren etiketli.</li>
	<li>45 dk kuluçka (Adım 5.6) adım bitmeden önce her şey (Adım 5.6) antijen tabakta tarafına 1 M Tris pH 9.0 arabelleği 8.3 µL ekleyin. Tris tampon ve antijen arasında karıştırma sınırlamak önemlidir. Hemen adım 5.6, her kuyuya asit ile tedavi serum 25 µL aktarmak ve çözüm tahrik. PCR plaka folyo ışık önlemek için mühürleme ile kapak.</li>
	<li>2 h. 4 ° C buzdolabında tabak koyun RT bir shaker (düşük hız) plaka koymak ve kuluçkaya için plaka izin geceleme (18-24 h).</li>
</ol>6. Streptavidin plaka hazırlayın
<ol><li>Streptavidin plaka 4 ° C buzdolabından alın ve plaka RT. için gelmek izin</li>
	<li>Streptavidin plaka RT olduğunda, her şey için 150 µL % 3 kütük parçası A ekleyin.</li>
	<li>PCR plaka folyo mühürleme ile kapak.</li>
	<li>4 ° C buzdolabında tabak gecede kuluçkaya. Not: Tahlil gün 2 adım 7 adım 9'ye içerir.</li>
</ol>7. transfer Serum/antijen Streptavidin plakasına kuluçkaya
<ol><li>Ertesi gün, buzdolabı streptavidin plaka çıkarmak ve plaka arabelleğinden atın. Biraz kuru kağıt havlu masayı ve kuyuları içinde daha fazla arabellek yok olana plaka baş aşağı dokunun.</li>
	<li>PBST 150 µL de başı boş streptavidin plaka doldurmak ve plaka üç yıkama olmak üzere toplam PBST atın.</li>
	<li>30 aktarım µL serum/antijen kuluçkaya iyi streptavidin plaka.</li>
	<li>Işık önlemek için folyo ile plaka kapak. Bir düşük ayarda RT için 1 h, plaka, salla.</li>
</ol>8. yıkayayım plaka ve okuma arabelleği ekleyin
<ol><li>Atma plaka incubates. PBST 150 µL iyi ücret ekleyin ve plaka üç yıkama olmak üzere toplam PBST atın.</li>
	<li>Yıkandıktan sonra iyi okuma arabelleği başına 150 µL ekleyin. Not: Bu plaka plaka okuyucu makinede nasıl okurum etkiler çünkü çözüm içinde hava kabarcıkları önlemek önemlidir.</li>
</ol>9. plaka okumak ve veri analiz
<ol><li>Plaka plaka okuyucu makine üzerinde saymak. Antikor değerler sayar / saniye (CPS) olarak görüntülenir.</li>
	<li>Antikor düzeyleri gibi göreli bir dizin plaka okuyucu makineden alınan iletmek. Aşağıdaki denklemi dizinden Hesapla: Dizin değeri = [CPS (örnek) - CPS (negatif kontrol)] / [CPS (pozitif kontrolü) - CPS (negatif kontrol)].</li>
	<li>Pozitif ve negatif antikor sonuçları 99 100 sağlıklı kontrol konuların (diyabetik olmayan bireyler bilinen herhangi bir otoimmün hastalıklar ve şeker hastalığı aile öyküsü olan olmadan) göre kesme için tanımlanan pozitifliği, kullanarak tanımlayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment.">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes.">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+Predictors+of+progression+from+the+appearance+of+islet+autoantibodies+to+early+childhood+diabetes:+The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY).">TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY).</a> Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).</li><li>Krischer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+The+6+year+incidence+of+diabetesassociated+autoantibodies+in+genetically+at-risk+children:+the+TEDDY+study.">TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study.</a> Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics.">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li><li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+type+1+diabetes.">Natural history of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+islet+autoantibody+appearance+and+mean+levels+of+insulin,+but+not+GAD+or+IA-2+autoantibodies,+predict+age+of+diagnosis+of+type+1+diabetes:+diabetes+autoimmunity+study+in+the+young.">Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young.</a> Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).</li><li>Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li><li>Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+PEG-hGH+detection+supporting+pharmacokinetic+evaluation+in+growth+hormone+deficient+patients.">Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).</li><li>Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+inhibition+of+drug+target+interference+in+immunogenicity+assays.">Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays.</a> J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).</li><li>Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+&#34;subspecificity&#34;+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody &#34;subspecificity&#34; in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+autoimmune+disease+found+in+33%+of+patients+at+type+1+diabetes+onset.">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Adacık otoantikorlar şu anda otoimmünite tip 1 diyabet için en güvenilir biyolojik vardır. Adacık belirli otoimmünite başlangıcını işaretlemek ve aleni hastalık riskleri belirlemek. ECL tahlil adacık otoantikorlar için kapsamlı bir şekilde birden fazla ulusal ve uluslararası tip 1 diyabet klinik deneylere doğrulandı. Tahlil artan duyarlılık ve özgüllük geçerli 'altın' ile karşılaştırıldığında göstermiştir standart RBAs. ECL tahlil üstün avantajı yüksek hastalık özgüllük için ayrımcılık yüksek-benzeşme ve yüksek riskli adacık otoantikorlar RBA tarafından oluşturulan düşük riskli, düşük-ilgi sinyalleri tarafından göstermiştir. Bu sadece tek adacık antikor pozitif olan bireylerde özellikle fark ettim ve hiç tip 1 diyabet için hayli ilerlemiştir. Otoantikorlar sırasında kayıp bulundu bu düşük benzeşimini en içinde yıl, ay için bir 'geçici olumlu.' davranmaya test kadar izleyin Daha önce olan bu düşük benzeşme bağışıklama cross-reactive bir molekül ile gelen 'tek' otoantikorlar büyük olasılıkla sonuçlandı. Daha yüksek afinite daha yüksek risk adacık otoantikorlar bağışıklama adacık antijenleri kendilerini ile gelen sonuçlandı. Buna ek olarak, ECL deneyleri 'serokonversiyonu' zaman yıl klinik diyabet için doğumdan itibaren takip edildi öncesi Diyabetli Çocuklarda tarafından geçerli standart radyo-bağlama deneyleri (RBA) antedate yeteneğini gösterdi. Bir devam eden uluslararası klinik, çevre belirleyicileri diyabet içinde genç (oyuncak), zamanlama ve ilk adacık antikor 'adacık çok başlangıcını kutlamak üzere serokonversiyonu' görünümünü kesin olarak belirlemek için doğru algılama bağlıdır otoimmünite ve çevre Tetikleyicileri tanımlamak için. Tahlil tüm immünglobulin sınıfları yakalar ECL tahlil duyarlılık arttı olası bir nedeni var: IgG, IgM, IgA, IgE, tercihan--dan geleneksel RBA ya da sadece IgG algılamayı güvenen ELISA.
ECL deneyleri, IAA gibi belirli bazı otoantikorlar için otoantikorlar antijen için bağlama bazı bileşen normal insan serumu mevcut tarafından inhibe olabilir görünüyor. Kaldırmak veya bu inhibisyon serbest bırakmak için serum numuneleri asit tedavisi serum antijen ile inkübe önce yapmak gerekli. [Şekil 5], gösterildiği ECL IAA tahlil olarak fare insülin Monoklonal antikor ve hastaların serum otoantikorlar antijen ile bağlama faaliyetlerinin büyük ölçüde geliştirilmiştir. Serum numuneleri, antikor deneyleri içinde kullanılan asitleştirme genellikle önceden varolan ilişkili kompleksleri ilişkisini kaldırmak uygulanır. IAA sinyalleri nasıl insan serumu örneklerinde inhibe ve serum asitleştirme tarafından yayımlanan arkasında mekanizması bilinmiyor ama bu yöntem diğer dayalı ECL deneyleri14,15' te kullanılmıştır.
Birkaç durumda da, ne zaman moleküllerin etiketleme, Biotin ya da Sulfo-etiket, antijen protein moleküllerinin etiketleme positionsinside vardır, veya anahtar epitopları antikorlar için bağlama aktivite ile girişime neden olabilir antikor bağlama çok yakın. Bu tahlil hassasiyeti azaltır ve tamamen tahlil gözyaşı. Yordam etiketleme alışılmış çalışma yöntemi için maksimizasyonu veya doygunluğu her olası etiketleme konum etiketleme kapasitesi maksimize ederek maksimum etkinlik veya etiketli molekül başına sinyal oluşturmak her antijen protein molekül için arzu edilir. Doymamış etiketleme antijen üzerinde etiketleme kesinti antikor bağlama faaliyet olası bir neden olduğunda (Biotin ve Sulfo-etiket) antijen protein molekülleri etiketleme molar oranı azaltarak yapılmalıdır. Binbaşı epitopları daha iyi ayrılmış olabilir ve kesinti antikor bağlama faaliyet doymamış etiketleme stratejisi çoğu durumda kullanarak tahliye edilecek.
Her tahlil bir iç standart yüksek pozitif ve negatif kontrol bilinmeyen örneklerinin dizin hesaplamalar için içermelidir. Normal kontrollerin tahlil'ın üst sınırı yakınındaki bir düşük pozitif kontrol tahlil duyarlılığını izlemek için eklemek önemlidir. Laboratuvar yeterli aliquots uzun süreli kullanımı için standart pozitif ve negatif denetimlerini tutmalı ve tüm aliquots-20 ° C'de muhafaza edilmelidir Tahlil kalite güvencesi, deneyleri için her bir örneği diğerinin aynısı açmanız gerekir ve her olumlu sonuç örnek ayrı bir tahlil yinelenen tarafından onaylanması. İkinci doğrulama tahlil ilk tahlil ve katılıyorum iki deneyleri sonuçları ile kabul etmez zaman üçüncü bir tahlil gereklidir (örn., +, + veya-, -), pozitif veya negatif sonuç son belirlenmesi-ecek var olmak.
Tek ECL deneyleri için ayarla platformu ile çoğaltılmış bir tahlil üzerine bu genişletilebilir. Aynı anda bir tek iyi bir serum küçük bir miktar ile ilâ 10 farklı otoantikorlar belirleyebilirsiniz. Şu anda, IAA dahil olmak üzere dört adacık otoantikorlar GADA, IA-2A ve ZnT8A önem ilerlemesinde T1D için her iki akraba T1D ve genel nüfus hastalarda risk tahmini için eşittir. Zahmetli ve verimsiz, özellikle büyük ölçekli nüfus filtreleme için geçerli tek antikor ölçüler kullanarak bu 4 otoantikorlar eleme için kullanılan yöntemlerdir. Önemlisi, yukarı T1D hastalarının % 40'a bir ek otoimmün koşul16,17,18var. Ne yazık ki, bu koşullar için ekran için hiç kolay ve ucuz aracı vardır. Multiplex ECL tahlil sadece 4 geçerli büyük adacık antikor deneyleri birine birleştirerek yeteneğine sahip değildir, ama aynı zamanda daha fazla daha fazla antikor deneyleri ilgili diğer otoimmün hastalıklar birleştirmek yapabiliyor. Bu verimli bir şekilde yüksek işlem hacmi büyük ölçekli nüfus aynı anda birden fazla otoimmün hastalıklar için eleme kuralları sağlar. Multiplex ECL tahlil [şekil 6' da], gösterildiği gibi her antikor-antijen akışkan aşamasında oluşan karmaşık bir özel bağlayıcı kaynak noktaya aynı iyi ölçülü. Plaka okuyucu makine üzerinde sinyal alıcı noktalarından 10 farklı kaynaklardan gelen sinyalleri tanımak mümkün. Ancak, son derece yüksek bir sinyal lekeli bir yüksek tahlil arka plan oluşturmak ve çapraz-hadis ile komşu noktalar parazitlere neden. Bu nedenle, her antikor tayini için üst sınır sinyalleri için daha az 20.000 sayıları sınırlı olmalıdır. Deneyim, alt arka planlar ile otoantikorlar nispeten uzak nokta harita tasarlarken daha yüksek sayıları sahip bu noktalardan yerleştirilmelidir. Multiplex ECL deneyleri kullanarak uzun vadeli çalışmalar için aynı bağlayıcı tahlil tutarlı tutmak için aynı antikor tayini için kullanılması önerilir.

Son bir hazırlama sınıflandırma sistemi T1D ilk etap hastalarda Tanı ile yardımcı olmak için oluşturuldu. İnsan adacık otoantikorlar tam algılama belirlenmesinde önemli bir rol oynar ve evreleme presymptomatic tip 1 diyabet, adacık otoantikorlar varlığı β-hücre otoimmünite varlığını gösterir gibi. Hangi diyabet β-hücre otoimmünite ilk oluşumunu etkiler hastalar semptomatik hastalık ilişkili adacık otoantikorlar, türü ve numarası ile oranıdır değişken2,3.
Antikor serokonversiyonu, titresi ve adacık otoantikorlar benzeşme semptomatik tip 1 diyabet4,5,6,7,8 ilerleme hızını etkileyebilir ,9,10. Son zamanlarda, Gelişmiş ECL deneyleri kapsamlı bir şekilde doğrulanmış, duyarlılık arttı göstermiştir ve daha fazla hastalığa özgü10,11,12,13vardır. Bu deneyleri tahmin ve evreleme adacık otoantikorlar önceki tespiti ile şeker hastalığı riskini artırır. Daha doğrusu adacık otoimmünite inisiyasyon işaretlemek ve diyabet için alakalı değil düşük-benzeşme ve düşük riskli sinyalleri görmezden geliyor.
ECL assay olarak, otoantikorlar serum, varsa, biotinylated yakalama antijen için Sulfo etiket Birleşik antijen akışkan aşamasında köprü. Köprüleme sonra Biotin bağlayıcı katı aşamasında yakaladı ve ECL streptavidin kaplı plaka (şekil 1) Sulfo etiketinde tarafından algılanan.
Bu derlemede, öncelikle tek antikor ECL deneyleri insan adacık otoantikorlar ile kullanılmaktadır. Kısaca, multiplexed antikor deneyleri tek ECL deneyleri göre tartışılacaktır. Multiplex tahlil birden çok, en çok 10, otoantikorlar içinde bir tek şey, 15 µL serum kullanarak tanımlamak için kullanılabilir. Bu basit yüksek işlem hacmi tahlil perde, aynı anda birden fazla ilgili otoimmün hastalıklar genel popülasyonda için birden fazla otoantikorlar için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Human recombinant proinsulin protein(PINS)</td><td>AmideBio</td><td>Human Proinsulin, Rec</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant GAD65 protein</td><td>Diamyd</td><td>rhGAD65</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant IA-2 protein</td><td>Creative BioMart</td><td>IA2</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plate&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin coated plate</td><td>MSD</td><td>L15SA</td><td></td></tr><tr><td>Zeba sizing spin column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td></td></tr><tr><td>Twen-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-tag</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>Blocker A</td><td>MSD</td><td>R93AA-1</td><td></td></tr><tr><td>4x Read Buffer T with Surfactant</td><td>MSD</td><td>R92TC-1</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-Biotin</td><td>ThermoScience</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>96-well polymerase chain reaction (PCR) plate</td><td>Fisher brand</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Streptavidin plate</td><td>MSD GOLD</td><td>L 15SA-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Column</td><td>ThermoScience</td><td>PL208984</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate Shaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>MSD</td><td>QuickPlex SQ120</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge with bucket rotary</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr></tbody></table>

electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies

Tip 1 diyabet ile ilişkili adacık otoantikorlar saptayarak (T1D) projesi ve bu hastalığın genel popülasyonda caydırmak için yol açar. Bir roman ECL tahlil için adacık otoantikorlar ile daha yüksek duyarlılık ve özgüllük geçerli 'altın' standart radyo-bağlama tahlil (RBA) daha nonradioactive sıvı faz tahlil olduğunu. ECL deneyleri daha doğrusu RBAs ve geleneksel enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA içinde oluşturulan düşük riskli, düşük-benzeşme otoantikorlar üzerinden yüksek risk, yüksek-benzeşme otoantikorlar ayırt presymptomatic T1D başlangıçlı tanımlayabilirsiniz ). Bu ECL assay olarak kullanılan antijen protein Sulfo etiketi ve Biotin, anılan sıraya göre etiketlenir. Laboratuvar uygulaması için kullanılmadan önce belirli antijen protein kullanan her ECL antikor tahlil bir optimizasyon adım gerekir. Bu adım özellikle serum asit tedavisi, konsantrasyonları ve oranları ile Sulfo-etiket ve Biotin etiketli iki farklı antijenleri gereksinimlerini belirlemede önemlidir. Tahlil gerçekleştirmek için antijen protein tamponlanmış fosfat çözüm (PBS), % 5 içeren serum örnekleri ile karışık Sulfo etiket Birleşik ve biotinylated yakalama sığır Serum Albumin (BSA). Daha sonra örnekleri gecede 4 ° C'de inkübe Aynı gün streptavidin kaplı bir plaka ile pencere engelleyicisi tampon hazırlanır ve gecede 4 ° C'de inkübe İkinci gününde streptavidin tabak yıkama ve serum antijen karışımı plaka üzerine aktarın. Plaka plaka shaker yerleştirin, düşük hızda ayarlayın ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Daha sonra plaka tekrar yıkadım ve okuyucu arabellek eklenir. Plaka sonra plaka okuyucu makinede sayılır. Sonuçları iç standart pozitif ve negatif kontrol serum örnekleri oluşturulan bir dizin içinde aktarılmaktadır.

Şekil 2 Dama Tahtası görüntüler. O 250 ng/mL biotin ve 250 ng/mL Sulfo-etiketinin etiketli antijen vardır tahlil'ın arka plan ve oranı yüksek pozitif denetimi örneğini, negatif kontrol örnek gelen sinyalleri dikkate alınarak tahlil kullanılan en rasyonel konsantrasyonları gösterilir olumlu olumsuz sinyaller. için Bu iki etiketli antijenleri en iyi duruma getirilmiş konsantrasyonları ile tahlil T1D ve 100 sağlıklı kontrol ile 100 yeni teşhis edilmiş hastalarda serum numuneleri ile gerçekleştirildi. 0.023 dizin değeri pozitif tahlil kesme olarak tanımlanmıştır. Bu sağlıklı kontrol karakteristik (ROC) eğrisi şekil 3Aiçinde gösterilen faaliyet alıcı kullanarak hastalar ve % 99 özgüllük % 85 duyarlılık gösterir. Tahlil için bilinmeyen örnekleri iç standart yüksek pozitif, düşük pozitif ve negatif kontrol örnekleri ile yapılmıştır. CPS sayar sonuçları gösterilmektedir tablo 2A. CPS yüksek ve düşük pozitif denetimlerin 17903 [(19940+15866)/2 kırmızıyla vurgulanır demek] ve 839 [(857+820)/2], ve negatif denetimlerini 168 [(170+165)/2 yeşil renkle vurgulanmıştır]. Bilinmeyen örnekleri için dizin tarafından hesaplanır "(CPSörnek-168)/(17903-168)." Tablo 2B tüm örnekleri için hesaplanan dizin değerleri gösterir. 0.023 kırmızı, ayrıca tablo 2Akırmızıyla yazılmış CPS değerlere karşılık gelen yazılı daha büyük olan dizin değerleri. Bu değerler 99inci yüzdelik sağlıklı kontrol nüfusunun büyük olumlu sonuçlar olarak tanımlanır. Ne zaman bir irrasyonel antijen konsantrasyon kullanılır, tahlil yüksek bir arka plan, Tablo 2 C. içinde gösterildiği gibi olacak Pozitif antikorlar düşük düzeyde A2, A5, D1 ve gri tablo 2Dolarak vurgulanmış H4 değerleri gibi cevapsız olacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> Resim 1 : Üzerinde tek bir ECL IAA tahlil bivalent plaka yakalama Illustration. Adacık antikor Sulfo etiket antijen streptavidin kaplı plaka üzerinde katı fazda yakalanan biotinylated yakalama antijen için Birleşik serum köprüler içinde. Sulfo-etiket konjuge antijen plaka yakalanan tespiti ECL gerçekleştirilir. Bu rakam Yu değiştirildi ve ark. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> Resim 2 : ROC eğrisi tahlil pozitifliği cut-off belirlenmesi için. Özgüllük % 85 duyarlılık karşılık gelen 99inci yüzdelik seçildi ve 0.023 dizin değeri temsil edilir. Tahlil bu üst sınırı 100 sağlıklı denetimlerden çekildi. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> Şekil 3 : Normal insan serumu ECL IAA sinyallerini engelleme Illustration. A: sinyalleri ECL IAA deneyleri bir insülin Monoklonal antikor (MoAb) ile büyük ölçüde normal insan serumu eklenmesi tarafından bloke edildi. İnsan serum asit ile tedavi edildi zaman PBS MoAb karşılaştırırken, sinyal kısmen restore edildi. B: sinyalleri bir ECL IAA tahlil 4 hasta sera ile önemli ölçüde asit tedavisi ile gelişmiş. Bu rakam Yu değiştirildi ve ark. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> Şekil 4 : Mutiplex ECL tahlil Illustration. Antikor-antijen kompleksleri özel bağlayıcı ile sıvı faz oluşur. Belirli antikor-antijen-bağlayıcı kompleksleri özel bağlayıcı noktalar aynı tümünde de sınırlanmıştır. Plaka okuyucu makine sinyalleri noktalar farklı kaynaklardan ayırt edebilir ve CPS sayıları 10 farklı kanallarda sırasıyla verir. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> Tablo 1: Denetleyicisi Yönetim Kurulu tahlil konsantrasyonları ve biotin oranları belirler ve Sulfo-etiket etiketli antijenleri. A: ham CPS plaka ve diğer yarısı negatif serum tarafındaki yüksek olumlu serum Denetleyicisi Yönetim Kurulu plakalı için sayar. Biotinylated antijen konsantrasyonu yatay dizi düşürülmüştü ve Sulfo-etiket antijen etiketli konsantrasyonu dikey dizi düşürülmüştü. B: CPS oranı değerleri sayar her biri kendi karşılık gelen CPS sayar negatif serum üzerinden karşı yüksek olumlu serum üzerinden. Sarı vurgulanan wells Panel b negatif pozitif en iyi oranı temsil eder. Bu oran 250 ng/mL için Biotin karşılık gelir ve 250 ng/mL Sulfo-etiket antijen konsantrasyonları negatif serum için çalışarak düşük bir CPS sayısı ile A panelindeki etiketli. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> Tablo 2: tahlil sonuçları analiz. Re: ham CPS tahlil plaka kırmızı ve yeşil ile standart negatif denetimleri vurgulanmış standart yüksek ve düşük pozitif denetimleriyle sayar. Her örnek tahlil çoğaltıldı. B: dizin değerlerini, tahlil protokolünde açıklandığı hesaplanmıştır. 0.023 büyük herhangi bir dizin değeri kırmızı renkte olumlu bir sonuç olarak tanımlanmıştır. C: bir irrasyonel antijen konsantrasyon kullanıldığında tahlil plaka örnekleri aynı kümesiyle ham CPS sayar. Bu yüksek bir arka planda sonuçlandı ve normalde tespit, bazı düşük pozitif negatif, gri Panel d vurgulanmış Panel b'de gösterildiği gibi çevrildi <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies at JoVE.com

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Burada, biz electrochemiluminescence (ECL) deneyleri kullanarak insan adacık otoantikorlar algılamak için yöntemler sundu. Tip 1 diyabet, tahmin etmek için kullanılan iletişim kuralı, üzerine otoantikorlar diğer otoimmün hastalıklar için algılamak için genişletilebilir.

Electrochemiluminescence deneyleri için insan adacık otoantikorlar

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

electrochemiluminescence-assays-for-human-islet-autoantibodies

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.4K Görüntüleme.  University of Colorado Denver. Burada, biz electrochemiluminescence (ECL) deneyleri kullanarak insan adacık otoantikorlar algılamak için yöntemler sundu. Tip 1 diyabet, tahmin etmek için kullanılan iletişim kuralı, üzerine otoantikorlar diğer otoimmün hastalıklar için algılamak için genişletilebilir.

Video: Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, this assay was used to analyze intrinsic levels of MeCP2 in mouse brain tissue and the uptake of TAT-MeCP2 in human dermal fibroblasts. The MeCP2-ECLIA produces highly accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error. In summary, we developed a quantitative method for the evaluation of MeCP2 protein variants that can be utilized in high-throughput screens.

The electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) is a novel approach for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants, which produces highly quantitative, accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error over a wide working range. Here, the protocol for the MeCP2-ECLIA in a 96-well format is described.

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Biyokimya

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies available for ANA screening, indirect immunofluorescence (IIF) using Human epithelial cells-2 (HEp-2) substrate remains the primary and recommended method because of its superior sensitivity. HEp-2 substrates can detect a multitude of patterns resulting from autoantibody binding to various protein and nucleic acid autoantigens distributed throughout the nucleus and cytoplasm of the cells. The great diversity of monospecific and mixed patterns resulting from positive reactions on HEp-2 substrate also complicate the interpretation and accuracy of reporting. One specific example which received utmost attention recently is the dense fine speckled 70 (DFS70) pattern resulting from autoantibodies that specifically bind to a protein called lens epithelium derived growth factor (LEDGF). Lack of clear association with a specific systemic autoimmune disease and high prevalence in healthy populations have made accurate interpretation of DFS70 pattern important. Accurate distinction of DFS70 pattern from disease-associated patterns using conventional HEp-2 substrate is challenging. Moreover, frequent co-occurrence of DFS70 pattern along with disease-associated patterns such as homogeneous, speckled, and mixed homogeneous-speckled patterns complicate the IIF interpretation. The goal of this paper is to demonstrate the utility of a novel engineered HEp-2 IIF substrate that retains all advantages of conventional HEp-2 substrate while simultaneously providing the ability to distinguish DFS70 pattern with high confidence in both monospecific and mixed ANA positive examples. The new substrate is further able to unmask disease-associated ANA patterns previously concealed by DFS70 pattern.

DFS70 autoantibodies mimic common disease-associated antinuclear antibody patterns making accurate interpretation challenging when using conventional HEp-2 substrates. The protocol describes advantages of novel engineered HEp-2 substrate over conventional HEp-2 in ANA screening and distinguishing DFS70 patterns with high confidence in both monospecific and mixed ANA positive cases.

Monospecific ve karışık DFS70 desen bir roman hepatit-2 ELITE/DFS70 nakavt substrat ile birlikte ANA tarama sırasında eşzamanlı ayrım

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune diseases and cancer2. Our aim is to investigate the antigens recognized by human T cells in the autoimmune disease type 1 diabetes 1,3,4,5. To analyze human T-cell responses against tissue where the antigens recognized by T cells are not identified we developed a method to extract protein antigens from human tissue in a format that is compatible with functional assays 6. Previously, T-cell responses to unpurified tissue extracts could not be measured because the extraction methods yield a lysate that contained detergents that were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Here we describe a protocol for extracting proteins from human tissues in a format that is not toxic to human T cells. The tissue is homogenized in a mixture of butan-1-ol, acetonitrile and water (BAW). The protein concentration in the tissue extract is measured and a known mass of protein is aliquoted into tubes. After extraction, the organic solvents are removed by lyophilization. Lyophilized tissue extracts can be stored until required. For use in assays of immune function, a suspension of immune cells, in appropriate culture media, can be added directly to the lyophilized extract. Cytokine production and proliferation by PBMC, in response to extracts prepared using this method, were readily measured. Hence, our method allows the rapid preparation of human tissue lysates that can be used as a source of antigens in the analysis of T-cell responses. We suggest that this method will facilitate the analysis of adaptive immune responses to tissues in transplantation, cancer and autoimmunity.

A simple protocol for preparing extracts of human tissue to be used as a source of antigens in functional T-cell assays is described. This method allows T-cell responses to tissue-derived antigens to be measured in vitro.

Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Biyoloji

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Tıp

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and celiac disease in the United States. With the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic, the epidemiology of COVID-19 in the general population and knowledge about the association between COVID-19 infection and T1D development are urgently needed. The currently standard screening method of the radio-binding assay (RBA) has met two great challenges: low efficiency with a single assay format and low disease specificity with a large proportion of low-affinity antibodies generated in screening. With the platform of the multiplex electrochemiluminescence (ECL) assay we established previously, a novel 6-Plex ECL assay was developed that combines, in a single well, all four islet autoantibodies (IAbs) to insulin, glutamic acid decarboxylase (GAD65), insulinoma antigen 2 (IA-2), and Zinc transporter 8 (ZnT8) for T1D, transglutaminase autoantibodies (TGA) for celiac disease, and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) receptor-binding domain (RBD) antibodies for COVID-19. The assay was validated in blind using 880 samples from the ASK study, including 325 positive samples and 555 all antibody-negative samples, and compared with the standard RBAs and a single ECL assay. With the advantages of high efficiency, low cost, and low serum volume, this assay has been accepted as the primary screening tool for the ASK study.

In line with the urgent need for screening for type 1 diabetes, celiac disease, and coronavirus disease 2019, we developed a high throughput 6-Plex electrochemiluminescence assay to simultaneously detect all four islet autoantibodies, tissue transglutaminase autoantibodies, and antibodies to the receptor binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.

Tip 1 Diyabet, Çölyak Hastalıkları ve COVID-19 için Yüksek Verimli Çok Katlı Tarama

An ongoing clinical trial, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), is the first screening study in the general population for type 1 diabetes (T1D) and ...

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate decarboxylase-65 (GADA), insulinoma antigen-2 (IA-2A), and zinc transporter-8 (ZnT8A) are equally important in disease prediction. Presently, up to 40% of patients diagnosed with T1D go on to develop other autoimmune disorders. Unfortunately, current screening methods using a single autoantibody for measurement are laborious and inefficient for large scale screening studies. We recently developed a simple multiplexed electrochemiluminescence (ECL) assay to address these current issues. The assay combines all 7 autoantibody tests into one well. Each well includes three IAbs (IAA, GADA, and IA-2A), autoantibodies to thyroid peroxidase (TPOA) and thyroid globulin (ThGA) to detect autoimmune thyroid disease, autoantibodies to tissue transglutaminase (TGA) for celiac disease, and autoantibodies to interferon alpha (IFN&#945;A) for autoimmune polyglandular syndrome-1 (APS-1); all of which screen for T1D and other relevant autoimmune diseases, simultaneously. The multiplex ECL assay is based on the single ECL assay platform, but instead uses the multiplex plate combining multiple autoantibody assays, up to 10, into a single well. The main difference from the single ECL assay is that each antibody-antigen complex formed in the fluid-phase is restrained onto a specific spot on each well through a linker system on the multiplex plate. The 7-Plex ECL assay, in the present study, is validated against standard radio-binding assays (RBA) and single ECL assays, using a large cohort of newly diagnosed T1D patients and age-matched healthy controls, resulting in excellent assay sensitivity and specificity.

We model a simple multiplexed ECL assay that combines 7 autoantibody assays together. The assay is capable of screening for T1D and multiple other autoimmune diseases, simultaneously, including celiac disease, autoimmune thyroid disease, and autoimmune polyglandular syndrome 1.

Electrochemiluminescence deneyleri için insan adacık otoantikorlar

Özet

Daha Fazla Video Keşfet