Bu eser Tıp bilimi, Yonsei Üniversitesi beyin Kore 21 artı proje tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, bu eser Ulusal Araştırma Vakfı Kore (NMK-2017R1D1A1B03030315) bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm yordamları Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, uygun araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm deneysel hayvan laboratuvar hayvan bakımı Komitesi Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, kuralları uyarınca feda etti.
1. hazırlanması reaktifler
Dikkat: Paraformaldehyde (PFA), Akrilamid ve Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) toksik tahriş edici vardır ve böylece bir duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE; önlük, eldiven, koruyucu gözlük) ile ele alınmalıdır.
<ol><li>%4 Akrilamid (AA) çözüm (A4P0): 20 mL % 40 Akrilamid çözüm için 180 mL 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin.</li>
	<li>% 0.25 VA-044 çözüm: 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane 0.5 g ekleyin] dihydrochloride (VA-044) toz 200 ml 0.1 M fosfat tamponlu tuz (PBS). VA-044 toz-ebilmek var olmak stok oda sıcaklığında iken, PBS solubilization üzerine 4 ° C'de depolanmalıdır. En iyi sonucu elde etmek için sadece deneme için gerekli çözüm miktarda hazırlamak.</li>
	<li>ANLAŞMA kokteyl çözüm: 10 g Akrilamid 225 mL % 4 paraformaldehyde (PFA) çözeltisi ekleyin ve 200 ml % 4 ile ses seviyesini PFA. Kullanılmadan önce VA-044 tozu 100 mg 40 mL 50 mL konik tüp içinde karışımı ekleyin.</li>
	<li>Çözüm arabelleği temizleyerek PAKTI: 40 g Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) 350 mL 0.1 M PBS ekleyin ve 500 ml 0.1 M PBS ile ses seviyesini. Çözüm takas mPACT için % 0,5 α-thioglycerol çözüm arabelleği temizleyerek PAKTI ekleyin.</li>
	<li>Bu çalışmada kullanılan fareler 2-hafta-yaşlı BALB erkek fareler vardı; Bu çalışmada kullanılan fareler 2 hafta eski erkek SD-sıçan vardı.</li>
</ol>2. anestezi ve perfüzyon cerrahi
Dikkat: PFA ve Akrilamid toksik tahriş edici ve böylece bir duman başlıklı uygun KKE ile ele alınmalıdır.
<ol><li>30 mg/kg 1 mL şırınga ile 26'lik iğne kullanarak zoletil patojen-Alerjik bir odada hayvan anestezi. İzlemek hayvan için 5-10 dak.</li>
	<li>Hayvan cerrahi anestezi uçağa ulaştı sonra anestezi derinliği belirlemek için ayak-çimdik yanıt yöntemini kullanın. Yanıt vermeyi durdurma sorununu onaylayın. Not: bir önceki çalışmada11' kullanılan benzer bir iletişim kuralı fare ve sıçan cerrahi içeren aşağıdaki adımları izleyin.</li>
	<li>Göğüs kafesi, deri ve karın duvarı altında 5-6 cm kesi yapmak.</li>
	<li>Eğri, künt makas bir kesik kesik önceden siteyi bulmak için göğüs alan palpating diyafram içinde olun</li>
	<li>Kesik göğüs kafesi plevral boşluğu ortaya çıkarmak için tüm uzunluğu boyunca uzanır.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde akciğerlere yerinden. Köprücük kemiği kadar göğüs kafesi ile kesme yapmak. Iris makas kullanarak, küçük bir insizyon attım sol ventrikül arka bitene kadar dayanabilir. Bir 18'lik perfüzyon künt veya zeytin uçlu iğne kesilmiş ventrikül geçen artan aort içine yerleştirin.</li>
	<li>İğne güvenli ve kalp bir hemostat ile sıkma tarafından kaçağı önlemek. Alternatif olarak, değiştirilmiş bir hemostat aorta iğne ucu etrafında kelepçe için kullanın.</li>
	<li>Azalan aortaya en az hasar sağlamak için dikkat çekici sağ atriyumu büyük bir kesi yapmak. Fare şimdi perfüzyon için hazırdır.</li>
</ol>3. bütün perfüzyon ve sıçan diseksiyon
Dikkat: PFA ve Akrilamid toksik tahriş edici ve böylece bir duman başlıklı uygun KKE ile ele alınmalıdır.
Not: Aşağıdaki tüm perfüzyon adımları bir önceki çalışmada Woo ve arktarafından kullanılan bir iletişim kuralı benzer. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Kalbin sağ atrium herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat çekici bir 18'lik iğne için ekleyin.</li>
	<li>50 mL şırınga kullanarak, hızlı bir şekilde ve eşit olarak 50 mL heparin (10 adet/mL) içeren soğuk 0.1 M PBS çözeltisi pompa.</li>
	<li>18'lik iğne Peristaltik pompa tüp takın.</li>
	<li>200 mL heparin (10 adet/mL) içeren soğuk 0.1 M PBS çözeltisi ile 10 mL/dak bir dolaşım hızda yıkayın.</li>
	<li>250 mL kan dolaşımı hızla 10 mL/dk soğuk % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi ile düzeltmek. Fare bu aşamada sert olmalıdır.</li>
	<li>Toplar ve kalan PFA çözüm bertarafı için saklarız.</li>
	<li>ANLAŞMA için bir soğutulmuş PAKTI kokteyl çözüm %4 PFA, % 4 Akrilamid ve % 0.25 VA-044 toz kurcalayarak bir 18'lik iğne ile sıvı ve baş ve omurga kaldır. Kafatası bir ensizyon boyun burun yaparak ortaya çıkarmak. Bu ek perfüzyon adım psPACT ve mPACT yöntemleri için gerekli değildir; fiksasyon sonra hemen baş ve omurga yalıtmak ve kafatası bulaşmasına neden.</li>
	<li>Kafatasının herhangi bir kalıntı boyun ve omurga kas kaldırarak maruz.</li>
	<li>Peel away kafatası için rongeurs ve makas kullanın. Beyin ve omurilik kaldırın.</li>
	<li>Dokuya %4 oranında depolamak PFA 4 ° c; doku 1 hafta kadar saklanabilir.</li>
</ol>4. hidrojel Monomer infüzyon ve fare ve fare MSS polimerizasyonu
Dikkat: Akrilamid, SDS, α-thioglycerol ve İngiltere'de yılın tahriş edici ve böylece bir duman Hood ve uygun çiş ile ele alınmalıdır.
<ol><li>
PAKTI (pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>İzole etmek ve tüm MSS (beyin ve omurilik) sabit fareler ve sıçanlar %4 PFA, % 4 Akrilamid ve % 0.25 VA-044 toz ve mağaza 24 h doku tamamen s içinde dalmış sağlamak için 4 ° C'de soğutulmuş PAKTI kokteyl solüsyon içeren bir 50 mL tüp için kültür olution.</li>
		<li>10 dk mendil kullanarak bir azot tanka bağlı hibridizasyon sistem jel için örnek azot gazı içinde katıştırma: sistem 37 ° C'ye ayarla Dokuların taze soğuk (4 ° C) PAKTI içeren bir 50 mL tüp transferi kokteyl çözüm ve tüp kap ile bağlayın ve vakum üzerine açın.</li>
		<li>Hidrojel polimerize için örnek bir sallayarak kuluçka (150 d/d, 37 ° C) içeren tüp 3 h için veya polimerizasyon tamamlanana kadar koyun.</li>
		<li>Bloting kağıt kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), Kaldır dokuları çevreleyen kalan polimerli hidrojel.</li>
		<li>Doku takas solüsyon (0.1 M PBS, pH %8.0 8 SDS) içeren bir 50 mL tüp aktarın.</li>
		<li>Örnek doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla titreyen bir kuluçka makinesine koyun. Ortalama olarak, bu tam açıklığı elde etmek için yaklaşık 20 gün boyunca fareyi CNS alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (işlem ayrı pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>Bütün MSS (beyin ve omurilik) kemik kesici ve makas PFA-sabit fare ve sıçanlar temiz bir banka üzerinden ayırma.</li>
		<li>Doku transferi doku tamamen sabitleştirici dalmış PFA ve mağaza 24 h için 4 ° C'de % 4 içeren bir 50 mL tüp sağlamak.</li>
		<li>1s için sabit doku 0.1 M PBS yıkama ve A4P0 çözüm (0.1 M PBS %4 Akrilamid) aktarın. Mağaza 24 h 37 ° C'de.</li>
		<li>5 min için doku 0.1 M PBS içinde yıkayın.</li>
		<li>% 0.25 dokusunda bırakın VA-044 0.1 M PBS içinde. 6-24 h 37 ° C'de depolayın ve sonra taze % 0.25 VA-044/PBS çözüm için transfer.</li>
		<li>10 dk mendil kullanarak hibridizasyon jel için örnek azot gazı embed sistemi ( Tablo malzemelerigörmek) bağlı bir azot tankı: Transfer dokuların taze soğuk (4 ° C) içeren bir 50 mL tüp % 0.25 VA-044/PBS çözüm ve tüp kap ile bağlamak. Vakum üzerine açın.</li>
		<li>Doku çözüm (0.1 M PBS, pH %8.0 8 SDS) temizlemek için transfer.</li>
		<li>Titreyen bir kuluçka doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla örnek kuluçkaya. Ortalama olarak, yaklaşık 17 gün boyunca fare CNS tam açıklığı elde etmek için alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (değiştirilmiş pasif Temizleme tekniği)
	<ol>
<li>Bütün MSS (beyin ve omurilik) kemik kesici ve makas PFA-sabit fare ve sıçanlar temiz bir banka üzerinden ayırma.</li>
		<li>4.2.2 - psPACT Protokolü'nün 4.2.8 adımları.</li>
		<li>Doku çözüm temizlenmesi için transfer. ANLAŞMA ve psPACT protokollerinden farklı olarak, mPACT % 0.5 α-thioglycerol ek olarak % 8 SDS 0.1 M PBS, pH 8.0 içinde oluşan bir takas çözüm gerektirdiğini unutmayın. Α-thioglycerol doku daha hızlı ve etkili bir şekilde temizlemek yardımcı olur un esmerleşme bir ajandır. Doku tam çözümde dalmış emin olun.</li>
		<li>Örnek doku temizlenmiş oldu kadar 37 ° C ve 150 rpm için ayarla titreyen bir kuluçka makinesine koyun. Ortalama olarak, fare CNS tam açıklığı elde etmek için yaklaşık 2 hafta sürer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Kırılma indisi eşleme ve temizlenen MSS Immunostaining
Not: njantlar (Kırılma indisi eşleşen çözüm Nycodenz tabanlı) 0.8 g/mL Nycodenz toz içinde 30 mL temel tampon (% 0,01 sodyum azid ve ara-20 0.1 M PBS, pH 8.0) çözünmüş oluşur. Bu çözüm toz uygun solvasyon için izin vermek için kuluçka sallayarak 37 ° C yerleştirilir önerilir.
<ol><li>Kuluçkaya dokularda % 0.1 0.1 M PBS için 2 h, Triton X-100 sonra blok 0.1 M PBS 6 h için de %2 sığır serum albümin (BSA) ile.</li>
	<li>Bölümlerde üç kez PBST yıkamak (% 0.1 0.1 M PBS ara-20) için 2 h. bölümleri (Bu durumda, kan damarlarının lekeleri bir anti-tavşan PECAM-CD31 antikor) birincil antikorlar ile 2 gün boyunca leke.</li>
	<li>Bölümleri de %2 BSA (Bu durumda, bir keçi Anti-tavşan IgG Cy3 floresan eşlenik) ikincil antikor ile 2 gün boyunca leke.</li>
	<li>Yıkama üç kez içinde PBST 2 h için doku ve mağaza 15 mL 2-10 gün boyunca njantlar etiketli.</li>
	<li>Görüntüleme önce etiketli dokular njantlar küçük bir miktar için 35 veya 60 mm doku kültürü yemekleri üzerinde hareket ettirin. Silikon çevresinde çanak alt kenarı ile düzeltmek.</li>
	<li>1.5-2 mL taze njantlar ekleyin.</li>
</ol>6. görüntü işleme
<ol><li>Kiremit bir confocal lazer tarama microscopewith 10 x büyütme kullanarak tarama ile temizlenmiş dokuların görüntüleri elde etmek ( Tablo malzemelerigörmek). Cy3 etiketli dokusunun 550-600 nm dalga boyu kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY.">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75 (2014).</li><li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Pasif, elektroforetik sigara ekstraksiyon yöntemleri istihdam ederken PAKTI önceki doku NETLİK2,3,4,7 gibi yöntemleri temizlenmesi ile elde tutarlılık önemli ölçüde geliştirilmiş , 8, teknik hala birkaç eksiklikler, maksimal doku netlik12ulaşmak için gereken süreyi en önemli biri olduğunu taşımaktadır. Mevcut çalı...

Klinik ve bilimsel açıdan soruşturma temel amacı organ yapısı ve fonksiyonu tam bir anlayış ulaşmak içerir; Ancak, memeli organları son derece karmaşık doğası kez tamamen bu amaç1ulaşmak için bir engel olarak hizmet vermektedir. Sağlam dokulara gelen bir hidrojel Akrilamid tabanlı melez inşa içerir, berraklık (açık Lipid değiş tokuş Akrilamid melezleşmiştir katı görüntüleme uyumlu Tisssue-hidrojel)2,3,4, elde organ, beyin, karaciğer ve dalak, onların yapısal bütünlük5koruyarak dahil olmak üzere çeşitli optik geçiş izni. NETLİK böylece sadece görselleştirme ince karmaşık hücresel ağlar ve doku türleri Morfoloji kesit gerek kalmadan incelemek için bir fırsat aynı zamanda sağlamıştır.
Doku izni elde etmek için NETLİK örnek el altında lipit içeriğini kaldırmak için elektroforetik yöntemleri kullanır. NETLİK fiziksel olarak istikrarlı doku-hidrojel melez üretmek için kaydetti iken, elektroforetik doku takas (vb) yöntemleri kullanımı, esmerleşme epitope hasar, dahil olmak üzere, doku kalitesi açısından değişken sonuçlar verir çalışmalar göstermiştir ve protein kaybı5,6. Bu sorunları gidermek için vb tedavi yerini alan bir pasif, deterjan iyonik bağlı delipidation tekniği ile anlaşma (pasif netlik tekniği), gibi değiştirilmiş protokolleri gelişmiş7,8,9olmuştur. Sonuçlarında büyük bir tutarlılık ulaşmak rağmen ancak, PAKTI maksimal izni elde etmek için daha fazla zaman gerektirir. Ayrıca, bu teknikleri hiçbiri henüz tüm CNS formu veya fareler ve eskiden şiling şimdi pigs gibi daha büyük kemirgen modellerinde uygulandı.
Bu da çalışmanın roman metodolojileri, psPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI), Bütün CNS ve iç organlar fare ve sıçan modelleri10hızlı Gümrükleme kolaylaştırmak için teklif tarafından bu sınırlamaları gidermek çalışmaktadır. Özellikle, psPACT % 4 Akrilamid ve % 0.25 dokulara işleyen VA-044 hidrojel oluşumu sırasında; iki ayrı adımda mPACT esasen aynı adımları içerir, ancak % 0.5 α-thioglycerol anahtar reaktifi olarak SDS tabanlı takas Çözümle takviyeleri. Her iki teknikleri endojen sistemik ve cerebrospinal dolaşım optik temizleme üretmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltmak için sistemleri koşum. İlke kanıtı olarak biz confocal mikroskopi kan damarı desenleri temizlenen doku10analiz kullanımını göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Clearing solution</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>40% Acrylamide Solution</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polymerization (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&amp;acute;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polymerization (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Clearing solution (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>PECAM-CD31 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td>Perfusion, Polymerization</td></tr><tr><td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPB-9121</td><td>Perfusion, Buffer</td></tr><tr><td>10 mL stripette</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Solution transfer</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Clearing tube</td></tr><tr><td>35 mm Cell culture dish</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anesthetize&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL syringe</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polymerization (A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Blotting paper for gel removal</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Tissue gel hybridization system</td></tr></tbody></table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

NETLİK geliştirme beri teknik temizleyerek bir bioelectrochemical bu üç boyutlu fenotip eşleme için şeffaf dokularda, roman Temizleme yöntemleri kübik (açık, engelsiz beyin görüntüleme dahil olmak üzere çok sayıda sağlar kokteyller ve sayısal analiz), anahtarı (etkileşim zaman sistemde kontrol) ve kimyasal kinetik, harita (Proteom büyütülmüş analizi) ve PAKTI (pasif netlik tekniği), kurulmuştur için varolan araç daha fazla genişletmek için biyolojik dokuların mikroskopik analiz. Üzerine iyileştirmek ve özgün PAKTI yordamı tüm merkezi sinir sistemi (MSS), böbrek, dalak ve tüm fare embriyo gibi sağlam kemirgen dokuların bir dizi için en iyi duruma getirme mevcut çalışma amaçlamaktadır. PsPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI) olarak adlandırdığı, roman bu teknikler hücre devresi haritalama ve olduğu gibi normal ve patolojik dokularda hücre altı yapıları görselleştirme son derece etkili yol sağlar. Aşağıdaki iletişim kuralında, biz onların yapısal bütünlük psPACT ve mPACT üzerinden en az işgali ile maksimal doku izni elde etmek nasıl ayrıntılı, adım adım anahat sağlar.

En iyi duruma getirilmiş pasif Temizleme teknikleri kullanarak tüm CNS şeffaf bir model nesil
Fare ve sıçan bütün CNS dokuların optik geçiş izni hızla çeşitli pasif Temizleme Teknikleri (şekil 1) kullanılarak sağlanır. Zaman içinde takas dokusunun bir şematik şekil 2Agösterilir. Özgün PAKTI yönteminden farklı olarak, % 4 Akrilam...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue at JoVE.com

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Görüntüleme.  Yonsei University College of Medicine. Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.

Video: Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Nörobilim

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Microsurgical Dissection and Tissue Clearing for High Resolution Intact Whole Retina and Vitreous Imaging

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole retina imaging techniques compared to conventional retinal flat mount preparations and sections. However, immunofluorescent imaging of intact whole retina is hindered by the opaque coatings of the eyeball, i.e., sclera, choroid, and retinal pigment epithelium (RPE) and the light scattering properties of retinal layers that prevent full thickness high resolution optical imaging. Chemical bleaching of the pigmented layers and tissue clearing protocols have been described to address these obstacles; however, currently described methods are not suitable for imaging endogenous fluorescent molecules such as green fluorescent protein (GFP) in intact whole retina. Other approaches bypassed this limitation by surgical removal of pigmented layers and the anterior segment of the eyeball allowing intact eye imaging, though the peripheral retina and hyaloid structures were disrupted. Presented here is an intact whole retina and vitreous immunofluorescent imaging protocol that combines surgical dissection of the sclera/choroid/retina pigment epithelium (RPE) layers with a modified tissue clearing method and light sheet fluorescent microscopy (LSFM). The new approach offers an unprecedented view of&#160;unperturbed vascular and neuronal elements of the retina as well as the vitreous and hyaloid vascular system in pathologic conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Yüksek Çözünürlüklü Sağlam Tüm Retina ve Vitreus Görüntüleme için Mikrocerrahi Diseksiyon ve Doku Temizleme

Presented here is a protocol for intact whole retina imaging in which the outer opaque/pigmented layers of the eyeball are surgically removed, and optical clearing is applied to render retina transparent enabling the visualization of the peripheral retina and hyaloid vasculature in intact retina using light sheet fluorescent microscopy.

Yüksek Çözünürlüklü Sağlam Tüm Retina ve Vitreus Görüntüleme için Mikrocerrahi Diseksiyon ve Doku Temizleme

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Tıp

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Yüksek Çözünürlüklü Sağlam Tüm Retina ve Vitreus Görüntüleme için Mikrocerrahi Diseksiyon ve Doku Temizleme

Yüksek Çözünürlüklü Sağlam Tüm Retina ve Vitreus Görüntüleme için Mikrocerrahi Diseksiyon ve Doku Temizleme

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

ACT-PRESTO: Biyolojik Doku Takas ve Hacim Görüntüleme için ile immün Yöntemleri