Yazarlar tarafından NIH RHC için fon sponsorluk kabul vermek #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Ulusal Enstitüsü gıda ve tarım gibi Finlandiya ayırt edici Profesör programı.

1. HEVNP üretim böcek hücrelerinde
Not: Tüm aşağıdaki adımları bir hücre kültür mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Bizim önceki yayın için daha ayrıntılı HEVNP üretim işlemleri11bakın.
<ol><li>Kültür Sf9 böcek hücrelerinde ( Tablo malzemelerigörmek) Medya 50-%75 izdiham içinde 6-şey plakaları için hücre.</li>
	<li>Böcek hücre transfection reaktifler göre üreticinin iletişim kurallarını kullanarak, rekombinant baculovirus üretmek için Bacmids HEVNP - 573C ORF2 Sf99 hücrelere içeren transfect. 27 ° C'de transfected hücreleri hücre canlılığı bağlı olarak 3-6 gün kuluçkaya.</li>
	<li>(Transfected hücre baculovirus enfeksiyon nedeniyle lysed sonra), 3-6 gün sonrası enfeksiyon süpernatant P0 baculovirus stok olarak toplamak.</li>
	<li>Kültür orta % 50-75 Konfluent Sf9 hücrelerde bir 25 cm2 monolayer şişesi 200 µL P0 stokunun uygulamadan önce kaldırın. Şişeye her 15dk inoculum tam kapsama sağlamak için rock. 4 kez, toplamda 60 dk için yineleyin.</li>
	<li>Böcek hücre kültür orta 2 mL şişe için ekleyin ve canlılığı hücre baculovirus için daha yüksek bir titresi yükseltmek için bağlı olarak 3-6 gün için 27 ° C'de tutun.</li>
	<li>12okuma baculovirus titresi elde etmek için plak deneyleri taşımak.</li>
	<li>Böcek cep orta 250 mL şişe 100 mL ile askıya alınmış Tn5 böcek hücreleri (Tablo reçetesi) kültür ve 150 devirde titresi 0.5 x 10 için 27 ° C'de sallamak5 - aşılama için 1 x 106 .</li>
	<li>Baculovirus enfeksiyonu (MOI) çokluğu, 5-10-100 mL Tn5 hücrelerinin bir 250 mL şişe ekleyin. Aşı sonra 150 rpm'de 27 ° C'de 5-7 gün için salla.</li>
	<li>Bir kez en hücreleri veziküller sahip gibi görünmesine ve hücrelerin % 70-90 optik mikroskop gözlem altında ölü, Tn5 hücreleri toplamak ve 33 mL ultracentrifuge tüpler içine aktarmak. 10.000 x g için 25 ° C'de 90 dk de kova rotor, denge ve hücre artıkları ve rekombinant baculoviruses aşağı spin sallanan içinde yer ultracentrifuge tüpler</li>
	<li>Daha fazla arıtma 4 ° C'de yayımlanan HEVNPs içeren süpernatant tutun. Baculovirus süpernatant genişletilmiş depolama için proteaz inhibitörleri ekleyin.</li>
</ol>2. HEVNP arıtma
<ol><li>Cips ve sezyum klorür (CsCl) degrade ayrımı yöntemi kullanılarak HEVNPs izole:<ol>
<li>Toplanan süpernatant nakletmek (adımından 1,10) ve % 20 eklemek NP-%40 0,5 son bir konsantrasyon yapmak her tüpün içine geri kalan herhangi bir hücresel membran çözülmeye NP-40. Yavaşça pipetting tarafından mix ve en az 30 dk. 25 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>Ultracentrifuge HEVNPs süpernatant üzerinden aşağı cips için kova rotorlar için 2 h 4 ° C'de sallanan içinde 112,400 x g de HEVNPs. Süpernatant Santrifüjü sonra atmak ve yavaşça ham Pelet 200 µL her tüp gecede 10 mM MES tampon pH 6.2 (O/N) 4 ° C'de yeniden askıya yılında SDS-52 kDa grup olarak ham Pelet içinde HEVNP ORF2 varlığını doğrulamak için sayfayı (Adım 3.1) çalıştırın.</li>
		<li>% 38.5 (w/v) CsCl degrade karıştırma 1.96 g CsCl, yeniden askıya alınmış ham Pelet ve ~ 4 mL 5 mL ultracentrifuge tüp içinde 0.01 M MES pH 6.2 hazırlayın. Tüpler dengelemek ve sallanan bir kova rotor yerleştirin. Ultracentrifuge 147000 x g 4 ° C'de 16 h için de</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kesirler CsCl degrade sonra toplamak:<ol>
<li>Öncelikle hafif hücre zarı enkaz olan en iyi 500 µL kesir, atın. Tüp, en baştan başlayarak 500 µL kesirleri toplamak ve ipuçları her kesir arasında değiştirin. Her kesir numaralı/etiketli 1,5 mL tüpler içine yerleştirin. Not: Varlığı HEVNP ORF2 kesirler degrade jelleri CsCl yüksek konsantrasyon nedeniyle SDS sayfa çalıştırarak tespit edilemez CsCl ayrılmış. CsCl her kesir kaldırılabilir veya CsCl temizlik yordamı izleyerek seyreltilmiş. Alternatif olarak, CsCl gradyan CsCl arta kalan önlemek için bir 10-%40 Sükroz degrade13 tarafından değiştirilebilir.</li>
		<li>5 mL ultracentrifuge tüp her kesir aktarmak ve CsCl ile 4.5 mL 10 mm MES, pH 6.2 oranında seyreltin. Tüpler dengelemek ve sallanan bir kova rotor yerleştirin. Ultracentrifuge 147000 x g 4 ° C'de HEVNPs cips için 2 h için de.</li>
		<li>Süpernatant atın ve yavaşça HEVNPs 10 mM MES pH 6.2 her tüp 100 µL yeniden askıya. Tüpler buharlaşma önlemek ve O/N 4 ° C'de kuluçkaya kapak</li>
		<li>A280 okuma ve A260/A280 nm oranı bir Spektrofotometre kullanarak kaydedin. ORF2 yaklaşık konsantrasyonu belirlemek: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57020/57020eq1.jpg"> Her ORF2 1 Cys ve kimyasal konjugasyon için 1 Lys siteleri içerir. Not: 1.019 mg/mL × A280 eşdeğer olan 60,280, HEVNP ORF2 molar tükenme katsayısı dür. 1:1 yakın bu böyledir bu HEVNPs konsantrasyon (mg/mL içinde) A280 ve bu nedenle, ORF2 konsantrasyon yukarıdaki denklem tarafından yaklaşık. Örneğin, bir HEVNP bir A280 okuma 1 ile 1 mg/mL, 18.8 µM için eşdeğeri olan bir konsantrasyon olacaktır ORF2.</li>
		<li>SDS-sayfa hazırlamak. Her kesir 6 µL örnekten 53,3 kDa HEVNP ORF2 protein (Adım 3.1) içeren kesirleri belirlemek için kullanın. HEVNPs kesirler 3-5, yoğunluklu olarak ~1.25 g/mL bulundu.</li>
		<li>Varlığı ve HEVNPs saflık TEM gözlem tarafından onaylayın. Hazırlamak veya HEVNP örnekleri için 0.5 - 2.0 mg/mL TEM için sulandırmak. HEVNPs boş icosahedral proteinleri olarak ~ 27 TEM içinde görünür nm çapında (Şekil 2). Bazı protein kirletici kesirler içinde kalabilir ve TEM (Adım 3.2) altında gözlenir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yabancı maddelerin TEM altında mevcut durumda 2.1.3 - 2.2.6 daha iyi HEVNPs saflığı için adımları yineleyin. Not: Ekstra arıtma CsCl gradyan ile HEVNPs verim kaybına neden olabilir. Alternatif olarak, CsCl degrade arıtma arta kalan CsCl13önlemek için % 10-40 Sükroz degrade tarafından değiştirilebilir.</li>
</ol>3. HEVNP karakterizasyonu
<ol><li>SDS sayfa 4-%12 Bis-Tris Protein jelleri, 1.0 mm, kullanıcının el ile14göre 17-wells ( Tablo malzemelerigörmek) hazırlayın:<ol>
<li>4 x 6 µL protein örneği arabelleğe yükleme 2 µL ekleyin. Örnek karışımı bir ısı blok 100 ° C'de protein denatüre için 10 dakika içinde kuluçkaya. Protein örnekleri jel üzerine yükleyin.</li>
		<li>SDS-sayfa 100 V 10 dk, 1 cm alt jel yukarıda örneklerini çalıştırma kadar 45 dk sonra 150 V DC güç kaynağı ayarlayarak çalıştırın.</li>
		<li>Leke SDS sayfa jel Coomassie mavi (% 0.25 (w/v) Coomassie parlak mavi R250, %30 (v/v) metanol, % 10 (v/v) Asetik asit), 1 h için.</li>
		<li>Sonra boyama yordam Coomassie mavi leke kaldırmak ve uygulamak için protein jel üzerine de-boyama arabellek (%30 (v/v) metanol, % 10 (v/v) Asetik asit) > oda sıcaklığında 12 h.</li>
		<li>Jel 52 kDa band, HEVNP ORF2 varlığını doğrulamak için beyaz ışık altında belge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TEM kullanarak HEVNPs gözlemlemek.<ol>
<li>Hazırlamak veya HEVNP örnekleri için 0.5 - 2 mg/mL ile TEM görüntüleme için 10 mM MES pH 6.2 oranında seyreltin.</li>
		<li>40 mA kızdırma deşarj için 30 ile karbon kaplı Izgaralar iyonize hidrofilik karbon yüzey üretmek için s. Kızdırma boşaltma ekipmanları Malzemeleri tabloaçıklanmıştır. Not: Kılavuzlar hidrofilik karbon yüzeyinde sadece son 30 dakika sonra parlaklık için tedavi akıntı.</li>
		<li>Cımbız içinde tutun ve HEVNP örnek 2 µL tasarım kılavuzuna ekleyin, 15-30 s için bekleyin ve filtre kağıdı ile leke.</li>
		<li>Hemen GKD20 kılavuzla ve leke filtre kağıdı ile yıkayın.</li>
		<li>Hemen kılavuz, bekle 15 s sonra leke filtre kağıdı ile 2 µL % 2 uranyl asetat ekleyin. Kuru bir elektronik koyarak onları örnek Izgaralar kuru kabine O/n için Ceketinizi</li>
		<li>Izgarayı TEM ve resim 10-80 k büyütmede içine aktarın. HEVNPs ~ 27 çoğu boş icosahedral proteinleri olarak TEM içinde görünür nm çapında, viral RNA yokluğu nedeniyle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. kimyasal konjugasyon Biotin, kanser hedefleme Ligand ve Fluorophores ile HEVNPs
<ol><li>HEVNPs ve maleimide bağlı biotin bir adım konjugasyon gerçekleştirin.<ol>
<li>Tampon Değiştir: HEVNPs mini diyaliz birimlerinde uygulamak ve 0.01 M PBS pH 7.4 üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre 1 h için oda sıcaklığında karşı diyaliz. HEVNPs 1.5 mL tüpler için aktarmak ve protein konsantrasyonu 280 ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.</li>
		<li>(Bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) Cys tepki siteleri, maleimide-biotin (100 µM) 1:5 molar oranı yapmak için 0,01 M PBS, pH 7.4, eşit miktarda 18.8 µM eşdeğeri olan 1 mg/ml HEVNP karıştırın; O/N 4 ° C'de tepki İlişkisiz maleimide-biotin üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre 40 K MWCO Spin Desalting sütun yordamı ile kaldırın.</li>
		<li>SDS-sayfa (Adım 3.1) küçültme bir standart ile örnekleri analiz.</li>
		<li>Standart prosedürler kullanarak, HRP bağlantılı Streptavidin kullanarak leke, chemiluminescent bir Western hazırlayın. Chemiluminescent sinyal tarafından X ray film (Şekil 2) yakalama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki adım LXY30 konjugasyon yüzey maruz sistein HEV NPs (şekil 5) gerçekleştirin.<ol>
<li>Arabellek Satım: HEVNPs mini diyaliz birimlerinde uygulamak ve 0.01 M PBS pH 7.4 oda sıcaklığında 1 h. 1,5 mL tüpler HEVNPs aktarmak için karşı diyaliz ve ölçmek protein konsantrasyonu 280 nm bir Spektrofotometre kullanarak.</li>
		<li>0,01 M PBS pH 7.4 200 µM CuSO4 ve 1 mM askorbik maleimide bağlı LXY30 oluşturmak için asit ile 650 µM maleimide-azid ve 650 µM ALKİN-LXY3010 ekleyin (Mal-LXY30) kuluçkaya 650 µM. 4 ° C'de karışımı O/n için</li>
		<li>Cys tepki sitesi 18.8 µM için eşdeğeri olan 1 mg/ml HEVNP mix (bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) yaklaşık % 10 ile Mal-LXY30 hacmi (650 µM) 1:3 molar oranı; yapmak için 0,01 M PBS pH 7.4, içinde O/N 4 ° C'de tepki Not: Mal-LXY30 nispeten yüksek konsantrasyon nedeniyle, 10 kat, onların zarar HEVNPs görmesini önlemek için karıştırma sonra Reaktanları CuSO4gibi son konsantrasyonları azaltılır. Başka bir seçenek Cu-Alerjik konjugasyon yöntemi15' tir.</li>
		<li>Kaldır bağlantısı çözülmüş maleimide-tıklayın-LXY30 bir sütunla 40 K MWCO Spin Desalting üreticinin protokolüne göre ( Tablo malzemelerigörmek). 4 ° C'de LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) tutmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>LXY30-HEVNPs ve Cy5.5 NHS ester (NHS-Cy5.5) bir adım konjugasyon gerçekleştirmek<ol>
<li>Cys tepki sitesi 18.8 µM için eşdeğeri olan 1 mg/ml LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) mix (bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) NHS-Cy5.5 eşit hacmi ile (100 µM) 0.01 M PBS pH 7.4 1:5 molar oranı; yapmak içinde O/N 4 ° C'de tepki</li>
		<li>Kaldır bağlantısı çözülmüş Cy5.5-NHS bir 40K Spin MWCO Desalting sütun yordamını üreticinin protokolüne göre ( Tablo malzemelerigörmek). LXY30, Cy5.5 bağlı HEVNPs 4 ° C'de (LXY30-HEVNP-Cy5.5) tutmak</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HEVNP bağlama ve MDA-MB231 meme kanseri hücrelerinin içselleştirilmesi
<ol><li>Tohum MDA-MB231 meme kanseri hücrelerinin içine bir 35 mm cam alt yemekleri (5 x 104 tabak başı) O/N kabine bir memeli hücre kültüründe.</li>
	<li>Hücre bağlama deneme için LXY30-HEVNP-Cy5.5 tarafından aşağıdaki adımları 4.2-4.3 hazırlayın. LXY30-HEVNP-Cy5.5 HEVNP ORF2 0,188 µM için eşdeğerdir 0.01 mg/ml seyreltik (2.2.4 adıma bakın), 0 - 250 µL içinde % 1 FBS/DMEM.<ol>
<li>Negatif kontrol örneği 0.01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 adımı uygulayarak 4.3 konjuge NHS-Cy5.5 boya sadece, (HEV-Cy5.5) ama'hazırlayın. HEVNP-Cy5.5 HEVNP ORF2 0,188 µM için eşdeğerdir 0.01 mg/ml seyreltik (2.2.4 adıma bakın), %250 10 µL içinde FBS DMEM ile desteklenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri bir kez 1 M PBS tamponunun pH 7.4 250 µL uygulayarak yıkayın. Hücre kültür tabak içinde bazı arabellek tutarken yıkama sonra PBS arabellek kaldırın.</li>
	<li>LXY30-HEVNP-Cy5.5 250 µL % 10 FBS FBS kültürlü MDA-MB231 meme kanseri hücreleri için DMEM ile birlikte % 10 DMEM veya HEVNP-Cy5.5 ile desteklenmiş uygulanır. Kalkan hücre ışık alüminyum folyo ile gelen yemekler kültürlü.</li>
	<li>Kültürlü hücre yemekleri bir 37 ° C hücre kültüründe içselleştirilmesi için 1 h için kabine tutun.</li>
	<li>Buz kültürlü hücrelerdeyse 3 kez, yıkama, 1 M PBS, pH 7.4 250 µL ile başına 5 dk yıkayın.</li>
	<li>% 4 hücreleri tamir PFA 1 M PBS, pH 7.4 20 min ve o zaman yıkama için 1 M PBS, pH 7.4 250 µL hemen ile içinde. Not: Hücreleri tarafından confocal mikroskop yansıması hazırsınız. Temsilcisi veri şekil 5' te gösterilmektedir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Virus-based nanocarriers for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).</li><li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activatable+viral+capsid+functionalized+for+cancer+targeting.">Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).</li><li>Jariyapong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hepatitis+E+virus-like+particle+as+a+carrier+for+oral-delivery.">Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery.</a> Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+hepatitis+E+capsid+protein+self-assembles+into+a+dual-domain+T+=+1+particle+presenting+native+virus+epitopes.">Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes.</a> Virology. 265 (1), 35-45 (1999).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway.">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain.">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+&#945;3+integrin-expressing+human+tumors.">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of &#945;3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li><li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants.">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li><li>Technologies, N. b. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).</li><li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Genellikle hafta sürer, zaman alıcı genetik mühendisliği yordamı aksine burada biz basit iki adım ve ligand hedefleme kanser ekleme 3 gün içinde tamamlanabilir tek adımlı kimyasal konjugasyon yordamlar göstermek ve/veya Floresans algılama boya HEVNPs Cys/Lys sitelerine. Teknik-ebilmek var olmak kullanılmış için en iyi ligand hedef ekran aday havuzu ve böylece mevcut peptit/küçük molekül sentezi Hizmetleri makul maliyet ve teslimat teker yararlanır.
Geleneksel genetik han...

Nano ölçekli vektörel çizimler nanotheranostics bilinen tedavi ve teşhis teslimat gelişimi çok hedeflenen teslimat1doğru Genelleştirilmiş tedaviler uzak Biyomedikal alanının kaymıştır. Hedeflenen nanotheranostic teslim stabil bir belirli hastalıklı doku ya da biyokimyasal yol2,3,4 theranostic moleküller doğrudan theranostic molekülleri ile nano ölçekli vektörel çizimler (nano tanecikleri) entegre . Çünkü en iyi şekilde ölçekli nano tanecikleri kapasite theranostic molekülleri ise stabilize ve seçmeli olarak hedef hücre yüzey molekülleri hastalıklı dokuları üzerinde sunulan Nanomedicine hedeflenen teslimat ön plana geldi. Birçok nanotheranostic platformlar hala pasif hücre alımı, ön-olgun bozulması, toksisite ve yetersiz Derneği theranostic molekülleri ile muzdarip. VIP birçok hedeflenen teslimat bu engelleri aşmak. Bunlar nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya küçük moleküller teslim için kullanılmıştır: birçok hastalıkları1mücadele için kullanılan bir rejimi. Bu uygulama ağırlıklı olarak mülkiyeti üzerinde dayanır kendinden montajlı yanı sıra verilen VIP için tasarlanmış uygulama yerine getirmek için genetik değişiklikler kolaylığı. Genetik mühendisliği için karşılaştırıldığında, VIP için yabancı peptidler kimyasal konjugasyon varlıklar, peptidler veya VIP yüzeyine içinde bir modüle Birleşik oligosakkaritler, gibi çok çeşitli izin verdiği için önemli bir avantaj görüntüler ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan.
HEVNPs, rekombinant HEV kapsid protein, 2nd açık türetilen çerçeve (ORF2) okuma, bulaşıcı olmayan, kendi kendine capsids giriş ve hücre-bağlama verebilir montaj. HEV Mukozal iletimi için evrim çünkü monte kapsid protein proteolitik ve asidik Mukozal koşulları5' te aynı şekilde stabil. HEVNPs içi boş, T şeklinde depolama ve hem de sert fizyolojik koşulları son derece kararlı işleme oluşan 60 aynı birim6,7 , ORF2, / 1 icosahedral kapsid, =. Herhangi bir virüs genetik öğe eksik, verimli, yüksek verim üretim baculovirus ifade sistem böcek hücrelerinde yoluyla elde edilir. Onların proteolitik istikrar nedeniyle, kendi kendine monte HEVNPs çıkarılan ve süpernatant cep gerekli arıtma adımları önemli ölçüde azaltarak saf. Ayrıca, HEVNPs kararlı bir icosahedral üs için esnek bir menteşe ile bağlı bir yüzey maruz çıkıntı etki (P) sahip. Esnek menteşe, önemli temel icosahedral yapısı ödün vermeden P etki alanı değiştirmek olanak verir iken yüzey maruz sivri icosahedral Bankası üstüne P etki alanı oluşturur. 60 tekrarlanan birimleri ile kimyasal modülasyon için 60 simetrik siteleri tek siteye özgü değişiklik sonuçlanır. Son zamanlarda, bir nano-platform önerilen kimyasal ligandlar veya theranostic uygulamalar için küçük moleküller eşlenik HEVNP kullanarak. Bu tek bir amino asit ile sistein HEV-VIP çıkıntı etki tepki site maleimide bağlı peptidler veya molekül ile değiştirerek sağlanır. HEV-VIP ve iyi okudu immünojenik epitopları8,9önceki yapısal çözümleme bağlı olarak, aşağıdaki beş HEV-VIP amino asitler olarak potansiyel adaylar sistein ile değiştirildi: Y485C, T489C, S533C, N573C ve T586C ( Şekil 1). İfade ve arıtma böcek hücrelerden sonra onların VIP oluşumları transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gözlem (Şekil 2) tarafından teyit edildi ve maruz sistein siteleri Western tarafından analiz edildi leke maleimide bağlı biotin sonra fiil (Şekil 2). Beş mutantlar arasında HEVNP - 573C maleimide-biotin konjugasyon (Şekil 2) en güçlü sinyal göstermek ve nanocarrier meme kanser hücresi4 (şekil 3) hedefleme için gücümüzü izleme için kullanıldı.
Bu iletişim kuralı tümör hedefleme molekülleri HEVNPs için yüzey sistein konjugasyon eklemek için kimyasal konjugasyon yöntemleri gösterilmektedir. Rekombinant HEVNPs içeren N573 adlı bir sistein ile tümör hedefleme ve algılama molekülleri'tümör dır konjugasyon detay (HEVNP - 573C). Peptid, forma LXY30-HEVNP (şekil 4) LXY3010 HEVNPs için hedefleme meme kanser tümörü bağlamak için bir tıklama kimya konjugasyon işlemdir üzerinde duruldu. Daha sonra N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 LXY30-HEVNP-Cy5.5 floresan algılama için her iki vitro (şekil 5) oluşturmak için HEVNPs ayrı Lys ücreti için Birleşik ve içinde vivo4.

<table><tbody><tr><td>MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69572</td><td>mini dialysis unit</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>Tn5 cells</td></tr><tr><td>SF9 Cells&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 cells</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11101, A11100</td><td>Baculovirus expression system</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td><td>Bacmid</td></tr><tr><td>ESF921 Insect Cell Media</td><td>Expression Systems LLC</td><td>96-001-01</td><td>insect cell media</td></tr><tr><td>Cy5.5 NHS ester, 5mg</td><td>Lumiprobe Corp</td><td>27020</td><td>Cy5.5 NHS ester</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>87766</td><td>spin desalting column</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td><td>M8250-250G</td><td>MES</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td>Depends on Rotor</td><td>ultracentrifuge tube</td></tr><tr><td>NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NPO321BOX</td><td>SDS protein gel</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>EMS Glow Discharger</td><td>Electron Microscopy Science</td><td></td><td>glow discharger</td></tr></tbody></table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

Virüs gibi parçacıklar (VIP) nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya algılama ve çeşitli hastalıkların tedavisinde küçük moleküller teslim etmek için kullanılmaktadır. Bu uygulama üzerinde genetik değişiklik, kendinden montajlı dayanır ve sistein konjügasyon, rekombinant VIP'ler. tümör hedefleme uygulama yerine getirmek ile genetik karşılaştırıldığında yabancı peptidler VIP'ler için değişiklik yalnız, kimyasal konjugasyon sunar bir önemli avantaj varlıkları, sentetik peptidler veya oligosakkaritler VIP yüzeye bir modüle edilmiş ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan Birleşik, gibi çeşitli sağlar çünkü.
Burada, biz nasıl hepatit E virüs nanopartikül (HEVNP), bir modularized theranostic kapsülü, bir çok fonksiyonlu teslim taşıyıcı olarak kullanıldığını göstermektedir. HEVNPs fonksiyonlar doku hedefleme, görüntüleme ve tedavi teslim. HEVNP köklü yapısal araştırmaya dayalı, yapısal olarak bağımsız ve yüzey Günese maruz kalan artıkları sistein yerine konjugasyon siteleri maleimide bağlı kimyasal gruplar thiol seçici bağlantıları üzerinden için seçildi. Belirli bir sistein-modified HEVNP (573, asparagine Cys yerine aa (HEVNP - 573C)) için bir meme kanseri hücre özgü ligand, LXY30 Birleşik ve tümör hedefli işleme yakın kızılötesi (Nur) floresan boya ile (Cy5.5), etiketli Etkili tanı kapsül (LXY30-HEVNP-Cy5.5) olarak HEVNPs. Benzer mühendislik stratejileri tanınmış atomik yapıları ile diğer makromoleküllerin kompleksleri ile theranostic teslim potansiyel uygulamalar keşfetmek için istihdam edilebilir.

HEV-VIP, benzer tüm Cys oluşan HEVNPs çözünür icosahedral capsids değiştirilebilir ve çözümde üretim veya arıtma sırasında toplam değil. Önce ve sonra tek adım maleimide-biotin konjügasyon, her biri Cys modifiye HEVNPs HEV-VIP negatif leke EM (Şekil 2) içinde ayırdedilemez. Maleimide-biotin konjugasyon verimliliği Cys değiştirilmiş HEVNPs ilk Batı chemiluminescent streptavidin bağlama yoluyla kurutma ile test edildi. Maleimide-biot...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

surface-functionalization-hepatitis-e-virus-nanoparticles-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K Görüntüleme.  University of California Davis. Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Video: Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach in&#160;vaccine design. Antigen is delivered to DC via antibodies specific for endocytosis receptors such as DEC-205 that induce uptake, processing, and MHC class I- and II-presentation.
Efficient and reliable conjugation of the desired antigen to a suitable antibody is a critical step in DC targeting and among other factors depends on the format of the antigen. Chemical conjugation of&#160;full-length protein to purified antibodies is one possible strategy. In the past, we have successfully established cross-linking of the model antigen ovalbumin (OVA) and a DEC-205-specific IgG2a antibody (&#945;DEC-205)&#160;for in vivo DC targeting studies in mice. The first step of the protocol is the purification of the antibody from the supernatant of the NLDC (non-lymphoid dendritic cells)-145 hybridoma by affinity chromatography. The purified antibody is activated for chemical conjugation by sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) while at the same time the sulfhydryl-groups of the OVA protein are exposed through incubation with TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride). Excess TCEP-HCl and sulfo-SMCC are removed and the antigen is mixed with the activated antibody for overnight coupling. The resulting &#945;DEC-205/OVA conjugate is concentrated and freed from unbound OVA. Successful conjugation of OVA to &#945;DEC-205 is verified by western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We have successfully used chemically crosslinked &#945;DEC-205/OVA to induce cytotoxic T cell responses in the liver and to compare different adjuvants for their potential in inducing humoral and cellular immunity following in vivo targeting of DEC-205+ DC. Beyond that, such chemically coupled antibody/antigen conjugates offer valuable tools for the efficient induction of vaccine responses to tumor antigens and have been proven to be superior to classical immunization approaches regarding the prevention and therapy of various types of tumors.

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We describe a protocol for the chemical conjugation of the model antigen ovalbumin to an endocytosis receptor-specific antibody for in vivo dendritic cell targeting. The protocol includes purification of the antibody, chemical conjugation of the antigen, as well as purification of the conjugate and the verification of efficient conjugation.

Vitro ve In Vivo'da Fare Dendritik Hücrelerini Hedeflemek için Tam Uzunlukta Proteinli Saflaştırılmış DEC-205 Yönlendirilmiş Antikorun Kimyasal Konjugasyonu

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Kanser Araştırmaları

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine, a siderophore recognized by Yersinia enterocolitica, using a succinyl moiety as a linker are described.
Magnetic nanoparticles (MNP) of magnetite (Fe3O4) were prepared by solvothermal method and coated with SiO2 (MNP@SiO2) using the St&#246;ber process followed by functionalization with APTES (MNP@SiO2@NH2). Then, feroxamine was conjugated with the MNP@SiO2@NH2 by carbodiimide coupling to give MNP@SiO2@NH2@Fa. The morphology and properties of the conjugate and intermediates were examined by eight different methods including powder X-Ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive X-Ray (EDX) mapping. This exhaustive characterization confirmed the formation of the conjugate. Finally, in order to evaluate the capacity and specificity of the nanoparticles, they were tested in a capture bacteria assay using Yersinia enterocolitica.

This work describes protocols for the preparation of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine using a succinyl moiety as a linker. A deep structural characterization description and a capture bacteria assay using Y. enterocolitica for all the intermediate nanoparticles and the final conjugate are also described in detail.

İşlevselleştirilmiş Manyetik Nano partiküllerin sentezi, Siderofor Feroksamin ile Konjugasyonu ve Bakteri Tespiti Için Değerlendirilmesi

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

Kimya

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load but not result in complete remission. An efficient hepatocyte model for HBV infection would offer a true-to-life viral life cycle that would be crucial for the screening of therapeutic agents. Most available anti-HBV agents target lifecycle stages post viral entry but not before viral entry. This protocol details the generation of a competent hepatocyte model capable of screening for therapeutic agents targeting pre-viral entry and post viral entry lifecycle stages. This includes the targeting of sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) binding, cccDNA formation, transcription, and viral assembly based on imHC or HepaRG as host cells. Here, the HBV entry inhibition assay used curcumin to inhibit HBV binding and transporting functions via NTCP. The inhibitors were evaluated for binding affinity (KD) with NTCP using isothermal titration calorimetry (ITC)-a universal tool for HBV drug screening based on thermodynamic parameters.

We present a protocol to screen anti-hepatitis B virus (HBV) compounds targeting pre- and post-viral entry lifecycle stages, using isothermal titration calorimetry to measure binding affinity (KD) with host sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Antiviral efficacy was determined through the suppression of viral lifecycle markers (cccDNA formation, transcription, and viral assembly).

Terapötik Hedef Olarak Polipeptitin Sodyum Taurokolat Kotransportasyonu Yoluyla Hepatit B Virüsü Girişini İnceleyen Yetkin Bir Hepatosit Modeli

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

Biyokimya

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to prevent and treat sexually transmitted infections (STIs). Moreover, many EF technologies focus on encapsulating the active agent, relative to utilizing the surface to impart biofunctionality. Here we describe a method to fabricate and surface-modify poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) electrospun fibers, with the potent antiviral lectin Griffithsin (GRFT). PLGA is an FDA-approved polymer that has been widely used in drug delivery due to its outstanding chemical and biocompatible properties. GRFT is a natural, potent, and safe lectin that possesses broad activity against numerous viruses including human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). When combined, GRFT-modified fibers have demonstrated potent inactivation of HIV-1 in vitro. This manuscript describes the methods to fabricate and characterize GRFT-modified EFs. First, PLGA is electrospun to create a fiber scaffold. Fibers are subsequently surface-modified with GRFT using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)chemistry. Scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the size and morphology of surface-modified formulations. Additionally, a gp120 or hemagglutinin (HA)-based ELISA may be used to quantify the amount of GRFT conjugated to, as well as GRFT desorption from the fiber surface. This protocol can be more widely applied to fabricate fibers that are surface-modified with a variety of different proteins.

This manuscript describes the procedure to fabricate and characterize Griffithsin-modified poly(lactic-co-glycolic acid) electrospun fibers that demonstrate potent adhesive and antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro. Methods used to synthesize, surface-modify, and characterize the resulting morphology, conjugation, and desorption of Griffithsin from surface-modified fibers are described.

İmalat ve Fiber Griffithsin-modified iskele karakterizasyonu önlenmesi için cinsel enfeksiyonlar iletilen

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Biyomühendislik

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Endotel hedefleme için Functionalized 10-nm polimer kaplı altın parçacıkları ve ilaç dağıtım sentezi

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, genetic programmability, and biodegradability. While they&#39;re highly amenable to bioconjugation reactions for adding synthetic ligands onto their surface, the range in bioconjugation methodologies on these aqueous born capsids is relatively limited. To facilitate the direction of functional biomaterials research, non-traditional bioconjugation reactions must be considered. The reaction described in this protocol uses dibromomaleimides to introduce new functionality in the solvent exposed disulfide bonds of a VLP based upon Bacteriophage Q&#946;. Furthermore, the final product is fluorescent, which has the added benefit of generating a trackable in vitro probe using a commercially available filter set.

Here, we present a procedure to fluorescently functionalize the disulfides on Q&#946; VLP with dibromomaleimide. We describe Q&#946; expression and purification, the synthesis of dibromomaleimide-functionalized molecules, and the conjugation reaction between dibromomaleimide and Q&#946;. The resulting yellow fluorescent conjugated particle can be used as a fluorescence probe inside cells.

Konjugasyon kaynaklı floresan pegile virüs benzeri moleküller tarafından Dibromomaleimide-disülfür Kimya yapma

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting agents is a crucial aspect to enhance their efficacy in diagnostics and treatments while minimizing the side effects. The benefit of magnetic nanomaterials compared to non-magnetic ones is their ability to respond to magnetic fields in a contact-free manner and over large distances. This allows to guide or accumulate them, while they can also be monitored. Recently, magnetic nanowires (NWs) with unique features were developed for biomedical applications. The large magnetic moment of these NWs enables a more efficient remote control of their movement by a magnetic field. This has been utilized with great success in cancer treatment, drug delivery, cell tracing, stem cell differentiation or magnetic resonance imaging. In addition, the NW fabrication by template-assisted electrochemical deposition provides a versatile method with tight control over the NW properties. Especially iron NWs and iron-iron oxide (core-shell) NWs are suitable for biomedical applications, due to their high magnetization and low toxicity.
In this work, we provide a method to biofunctionalize iron/iron oxide NWs with specific antibodies directed against a specific cell surface marker that is overexpressed in a large number of cancer cells. Since the method utilizes the properties of the iron oxide surface, it is also applicable to superparamagnetic iron oxide nanoparticles. The NWs are first coated with 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) acting as a linker, which the antibodies are covalently attached to. The APTES coating and the antibody biofunctionalization are proven by electron energy loss spectroscopy (EELS) and zeta potential measurements. In addition, the antigenicity of the antibodies on the NWs is tested by using immunoprecipitation and western blot. The specific targeting of the biofunctionalized NWs and their biocompatibility are studied by confocal microscopy and a cell viability assay.

In this work, we provide a protocol to biofunctionalize magnetic nanomaterials with antibodies for specific cell targeting. As examples, we utilize iron nanowires to target cancer cells.

Manyetik Nanomalzemelerin Biyofonksiyonelleştirilmesi

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...