Hastane ve hastaların tüm tıbbi ve yardımcı personel katılmayı kabul etmiş için teşekkür ediyoruz. Gabrielle White Wolf, doktora, Edanz bu raporu taslağını düzenlemek için Grup (www.edanzediting.com/ac) teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada genom araştırma projesinden Yamanashi İli (YH ve tarzı) ve bir hibe üzerinden YASUDA tıbbi Vakfı (YH) için bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmiştir.

1. TIC hazırlık Normal cam kullanarak hızlı mikroskopik değerlendirmesi için slaytlar
<ol><li>Klinik Patolojik doku malzemelerin mevcut olacağı sonra en kısa zamanda TIC hazırlık gerçekleştirin. TIC numuneler hemen hazır değil, serum ıslatılmış kaplı doku malzemeler steril gazlı bez tutmak ve dokuları kurutma önlemek için buzdolabında saklamak.</li>
	<li>Klinik olarak cerrahi veya endoskopi tarafından elde edilen 5 mm3 doku malzeme solid tümör (örneğin, karaciğer, akciğer ve meme dokuları) gibi hazırlayın.<ol>
<li>Yavaşça doku fizyolojik serum kaplı steril gazlı bezle silin ve kan, doku yüzeyi çok kan varsa kaldırın.</li>
		<li>Biyopsi malzeme gibi mikroskobik örnekleri için fizyolojik serum içinde batırılmış steril gazlı bezle nemlendirilmiş örnek tutmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kesmek ve normal doku düzeltme bıçakla trim ve tümör kitleleri fena halde görünür değilse tümör lezyon yüzeyine karşı karşıya.</li>
	<li>Eldivenli ellerle birkaç kez normal cam slayda rezeke örneklerin tümör yüzeye dokunun. Görsel olarak dokundu alan üzerinde normal cam slayt % 80'i olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Hafifçe karşı bir polietilen Naftalin (PEN) membran slayda normal cam slayt tuşuna basın ve 2 - 3 kez eldivenli elleriyle hafifçe ovalayın. Görsel olarak hücreleri kalem membran slayda normal cam slayttan aktarılır onaylayın.</li>
	<li>Cam ve kalem membran slaytlar oda sıcaklığında 5 min için kuruması.</li>
	<li>Doğrudan saytolojik muayene için normal cam slayt leke. 5 s için sabitleştirici çözüm ile cam slaytlar ve çözüm 15 boyama Giemsa ile sonra leke daldırma s.</li>
	<li>Değerlendirmek ve tamamen hızlı değerlendirme için mikroskop ile tümör içeriği ve cellularity normal cam slayt üzerinde ekran. Tümör hücreleri çeşitli ölçütlere göre değerlendirmek; Nükleer genişleme, anormal karyotip, bol Kromatin, hücre eşitsiz dağılımı, nükleer bileşen/sitoplazmik bileşeni, hücre boyutunu ve hücre polarite oranı.</li>
</ol>2. genetik test için hazırlık kalem membran Slayt Film
<ol><li>Örnek tümör cellularity gösteriyorsa hızlı mikroskopik değerlendirme (1.8. adım) üzerinden % 60 oranında tümör dokundu filmin DNA ekstraksiyon kalem membran slaytların bir bıçak ile kesmek ve eldivenli elleri. Bir pincette ve eldivenli elleri ile steril microcentrifuge tüp kesme film aktarın.</li>
	<li>Tümör cellularity düşük (az %60 tümör içindekiler) hızlı mikroskopik değerlendirme (Adım 1.8) tarafından tespit edildi, lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanın ve tümör örneklerini almak.<ol>
<li>Standart protokolleri kullanarak tümör hücreleri değerlendirmek için boyama Giemsa gerçekleştirin.</li>
		<li>PEM membran slayt uygun lazer yakalama mikrodiseksiyon tarafından film kesti.</li>
		<li>Bir pincette ve eldivenli elleri ile steril microcentrifuge tüp kesme film aktarın.</li>
		<li>Film içeren microcentrifuge tüp 4 ° C'de (protokol burada duraklatılmış) DNA ekstraksiyon kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNA ekstraksiyon
<ol><li>DNA çekme--dan küçük değişiklikler ile FFPE DNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre kullanarak TIC veya FFPE doku örnekleri gerçekleştirin. FFPE DNA ekstraksiyon adım için eşdeğer bir takımdır.</li>
	<li>Doku lizis arabelleği 180 µL eklemek (pH = 8,3) el ile 200-µL pipet ile film içeren microcentrifuge Tube. 5 için maksimum hızda (yaklaşık 2500 rpm) bir girdap karıştırıcılı vortexing tarafından İndinavir K bir el ile 20 µL pipet ve karıştırmak ile 20 µL eklemek s.</li>
	<li>56 ° C'de örnekleri gecede bir hava kuluçka ile kuluçkaya.</li>
	<li>90 ° c ısı blok için 1 saat 10 dk, FFPE ve TIC örnekleri sırasıyla kuluçkaya. Kısaca microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı spin s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.</li>
	<li>200 µL lizis arabelleği için örnek bir 200-µL pipet ve karıştırmak ile iyice vortexing 5 için maksimum hızda tarafından ekleyin s.</li>
	<li>Etanol (96-%100) 200-µL pipet ile 200 µL ekleyip iyice karıştırın kısaca 5 için maksimum hızda vortexing tarafından s. spin microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.</li>
	<li>Dikkatle 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun için tüm lysate aktarma</li>
	<li>Spin sütun bir temiz 2 mL toplama tüp eldivenli ellerle yerleştirin ve bir plastik atık kutusuna akışı aracılığıyla içeren koleksiyon tüp atın.</li>
	<li>Yıkama arabelleği 500 µL 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun ekleyin</li>
	<li>Spin sütun bir temiz 2 mL toplama tüp eldivenli ellerle yerleştirin ve bir plastik atık kutusuna akışı aracılığıyla içeren koleksiyon tüp atın.</li>
	<li>Yıkama arabelleği 500 µL 1.000-µL pipet ve 25 ° C'de 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj ile spin sütun ekleyin</li>
	<li>Akış-aracılığıyla bir plastik atık kutusuna içeren koleksiyon tüp atmak. Spin sütun eldivenli ellerle temiz 1.5 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin ve 20.000 x g 3 dk membran kuruması için 25 ° c de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Spin sütun bir DNA-düşük bağlama tüp eldivenli ellerle yerleştirin.<ol>
<li>40-50 µL elüsyon arabelleği membran 100 µL pipet ile Merkezi ekler.</li>
		<li>5 min ve 25 ° C'de 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj için oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
		<li>DNA örnekleri-20 ° c (protokol burada duraklatılmış) sonraki adım kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. nicel gerçek zamanlı PCR ile DNA kalitesinin tahmini
<ol><li>Aşağıdaki gibi bir pipet ile steril microcentrifuge tüp ana karışımda hazırlamak: 2 gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL 20 x 10 µL RNase P astar-sonda Mix x (amplicon boyutu: 87 bp) ve steril su nükleaz Ücretsiz 8 µL.</li>
	<li>Bir steril microcentrifuge tüp ikinci ana karışımda gibi hazırlamak: 2 gerçek zamanlı PCR Master Mix, 1 µL 20 x 10 µL RNase P astar-sonda Mix x (amplicon Boyut: 268 bp) ve steril su nükleaz Ücretsiz 8 µL.</li>
	<li>Seri dilutions (kit ile sağlanan) insan kontrolü genomik DNA'ın beş maddelik standart eğri için 4 kez gerçekleştirmek ve mutlak DNA konsantrasyonları13belirlemek.</li>
	<li>19 µL iki hazır ana karışımları (4.1 ve 4.2 adımda hazırlanan) bir optik 96-iyi tepki plaka 20 µL pipet ile ayrı kuyu içine ekleyin.</li>
	<li>FFPE DNA veya TIC DNA 2-µL pipet ile reaksiyon karışımı içeren wells ayırmak için 1 µL ekleyin. Hiçbir şablon kontrolü için tepki karışımı içeren ayrı bir kuyuya 1 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin.</li>
	<li>Optik bir yapıştırıcı film olmayan yapışkan tarafı tutun ve koruyucu film Merkezi'nden yedekleme geri soyma. Yavaşça aplikatör filmin sürükleyin ve film 96-şey plaka üzerinde mühür.</li>
	<li>96-şey plaka Mikser kullanarak 10 için 96-şey plaka karışımı yavaşça s 2000 devirde oda sıcaklığında. Plaka kısaca 1000 x g için oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR enstrüman ve INSERT 96-şey plaka gücüyle. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 20 95 ° C için 1 s ve 60 ° C 20 kullanım "Standart eğri" ve "hızlı modu" s. 95 ° C 45 döngüsü tarafından takip s,</li>
	<li>DNA (göreli miktar; oranıyla DNA fragmantasyonu değerlendirmek RQ) elde edilen uzun amplicon için (268 bp) kısa amplicon için (87 bp). RQ kısa amplicon13uzun amplicon / ortalama değeri ortalama değeridir.</li>
</ol>5. bir sonraki nesil sıralama kitaplığı hazırlanması
<ol><li>Sıralama kitaplığı üreticinin yönergeleri doğrultusunda sonraki nesil sıralama için hazır olun.</li>
	<li>Steril microcentrifuge tüp örnek başına çoklu PCR ana karışımda gibi hazırlamak: 4 µL Multiplex PCR reaksiyon çözüm, 4 µL astar Havuzu, ≤6 µL TIC veya FFPE DNA (1-100 ng), x 5 x 5 ve 20 µL kadar nükleaz ücretsiz su ekleyin.<ol>
<li>Çoklu PCR ana karışımı bir PCR tüp için hafifçe tüp dokunarak ekleyip karıştırın.</li>
		<li>Kısaca microcentrifuge tüp 1.500 x g 5 için de aşağı spin s mini santrifüj ile oda sıcaklığında.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 99 ° C için 2 dk, 99 ° C 20 döngüsü tarafından takip için 15 s ve 60 ° C 4 dk ve holding için adım 10 ° c Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında. Not: astar çiftleri sayısına göre devir sayısını belirleyin.</li>
	<li>PCR tüp kapağını açın ve restriksiyon enzimi 2-µL pipet ile 2 µL ekleyin. Kapağı PCR tüp ve karışımı yavaşça PCR tüp dokunarak Giriş Paneli'ni kapatın. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 10 min, 55 ° C 10 min, 60 ° C 20 dk için için için 50 ° C ve holding adım 10 ° c Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Her şey bir pipet ile sindirilir PCR amplicons aşağıdaki gibi içeren içine adaptörü ligasyonu ana karışımı ekleyin: 4 µL adaptör ligasyonu çözüm, barkod 0.5 µL, 0.5 µL bağdaştırıcısının, nükleaz ücretsiz su 2 µL ve DNA ligaz 2 µL. PCR tüp ve mix kapağı hafifçe dokunarak kapatın. Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile PCR tüp spin s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 30 dk, 5 dk, 5 dk, 72 ° C için 68 ° C için 22 ° C ve holding adım 10 ° c</li>
	<li>Sıralama kitaplığı üreticinin talimatlarına göre manyetik boncuklar ile arındırmak.</li>
	<li>Adaptör bakmaksızın kitaplığı Çözüm 1.5 mL DNA düşük-bağlama tüp içine aktarın. Manyetik boncuklar 45 µL 1st arıtma için DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Tüp dokunarak karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Sonra oda sıcaklığında 2 dk kadar çözüm açıktır kuluçkaya DNA-düşük bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin. Dikkatle süpernatant 200-µL pipet ile manyetik boncuklar bozmadan atmak.</li>
	<li>200-µL pipet ile taze hazırlanmış % 70 etanol 150 µL ekleyin, sonra tüp yan-yan boncuk yıkamak için mıknatıs taşı. Dikkatle süpernatant manyetik boncuklar bozmadan atmak.</li>
	<li>5.11 ikinci bir yıkama için yineleyin.</li>
	<li>Kısaca 5 için 1.500 x g de mini santrifüj ile tüp spin s, oda sıcaklığında. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatle 10 µL pipet ile etanol damlacıkları atın.</li>
	<li>Düşük TE 50 µL boncuk dağıtmak için manyetik boncuklar Pelet içeren DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve kadar çözüm açıktır, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>50 µL süpernatant, yeni DNA düşük-bağlama tüp içine aktarmak ve manyetik boncuklar 2nd arıtma 100 µL pipet ile 75 µL ekleyin. Tüp dokunarak karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Sonra oda sıcaklığında 2 dk kadar çözüm açıktır kuluçkaya DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin. Dikkatle süpernatant 200-µL pipet ile manyetik boncuklar bozmadan atmak.</li>
	<li>200-µL pipet ile taze hazırlanmış % 70 etanol 150 µL ekleyin, sonra tüp yan-yan boncuk yıkamak için mıknatıs taşı. Dikkatle süpernatant manyetik boncuklar bozmadan atmak.</li>
	<li>5,18 için ikinci bir yıkama arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Kısaca 5 için 1.500 x g, santrifüj mini ile tüp spin s, oda sıcaklığında. DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve dikkatle 10 µL pipet ile etanol damlacıkları atın.</li>
	<li>Düşük TE 50 µL boncuk dağıtmak için manyetik boncuklar Pelet içeren DNA düşük-bağlama tüp içine ekleyin. Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>DNA düşük-bağlama tüp manyetik bir rafa yerleştirin ve kadar çözüm açıktır, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Yeni DNA düşük-bağlama tüp 100 µL pipet ile içine arıtılmış kitaplığı içeren süpernatant ile 45 µL aktarın.</li>
</ol>6. Kütüphane konsantrasyon nicel gerçek zamanlı PCR tarafından ölçmek
<ol><li>Her kitaplık üreticisinin yönergeleri13göre konsantrasyonu belirlemek.<ol>
<li>Aşağıdaki gibi bir 20-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 2 µL arıtılmış Kütüphanesi ve nükleaz ücretsiz su bir DNA düşük-bağlama tüp 38 µL 2-µL ve 100 µL pipet ile karıştırın.</li>
		<li>-20 ° c su katılmamış kitaplıkları adım 7,3 kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki gibi bir 200-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 20-fold seyreltilmiş saf kitaplığının (6.1 adımda hazırlanan) 5 µL karıştırın ve bir DNA düşük-bağlama tüp su nükleaz ücretsiz 45 µL.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi bir 2,000-fold seyreltme çözüm hazırlamak: 200-fold seyreltilmiş saf kitaplığının (6.2 adımda hazırlanan) 5 µL karıştırın ve bir DNA düşük-bağlama tüp su nükleaz ücretsiz 45 µL.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi tepki ana karışım hazırlamak: 2 ana mix çözüm x 10 µL ve astar-sonda tahlil çözüm steril microcentrifuge tüp x 20 1 µL bir pipet ile karıştırın, sonra karışımı tüp dokunarak. 11 µL optik bir 96-şey reaksiyon kuyu içine tepki ana karışımı ekleyin.</li>
	<li>Her şey 10 µL pipet ile 9 µL 2,000-fold seyreltilmiş Kütüphanesi, standart her denetimin 9 µL veya 9 nükleaz ücretsiz su µL ekleyin.</li>
	<li>Optik yapıştırıcı film olmayan yapışkan tarafı tutun ve koruyucu film Merkezi'nden yedekleme geri soyma.<ol>
<li>Yavaşça aplikatör filmin sürükleyin ve film 96-şey plaka üzerinde mühür.</li>
		<li>96-şey plaka Mikser kullanarak 10 için 96-şey plaka karışımı yavaşça s, oda sıcaklığında.</li>
		<li>Plaka kısaca 1000 x g için oda sıcaklığında 3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerçek zamanlı PCR enstrüman ve INSERT 96-şey plaka gücüyle. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak PCR reaksiyonları çalıştırın: 50 ° C için 2 dk, 20 95 ° C için 1 s ve 60 ° C 20 kullanım "Standart eğri" ve "hızlı modu" s. 95 ° C 40 döngüsü tarafından takip s,</li>
	<li>Su katılmamış Kütüphane konsantrasyon qPCR ile 2.000 tarafından belirlenen konsantrasyon çarparak hesaplar.</li>
</ol>7. sonraki üretimi sıralaması
<ol><li>Çalışma durum planı ve yazılım içinde çalışma parametresini ayarlayın.<ol>
<li>[Planı sekmesini] ve [] şablon ve uygun çalışma yöntemini seçin.</li>
		<li>Uygulama ve teknik türü seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Enstrüman, örnek hazırlama takımı (isteğe bağlı), kitaplığı seti türü, şablon seti, sıralama seti seçin, kalibrasyon modu temel, türü chip, sıra (isteğe bağlı) ve barkod kümesi kontrol ve [ileri] düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Eklentileri seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Projeyi seçin ve [ileri] düğmesini tıklatın.</li>
		<li>Varsayılan başvuru ve hedef bölgenin yatak dosyaları seçin.</li>
		<li>Örnek adı yazın, barkod seçin ve [planı Run]'ı tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şablon hazırlama gerçekleştirmek ve üreticinin yönergelerine göre otomatik bir araç yükleme çip. Reaktif kartuşu kullanmadan önce 45 dk için oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>Su katılmamış kütüphanede 6,8 adımda hesaplanan Kütüphane konsantrasyon göre nükleaz ücretsiz suyla seyreltik ve 20 pM kitaplıkları olun.<ol>
<li>Havuza alınan bir kütüphane sıralama ve buz üzerinde mağaza hazırlayın.</li>
		<li>100 µL pipet ile havuza alınan Kütüphanesi 25 µL örnek tüp altýna ekleyin. 48 saat içinde havuzlu kitaplığı kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Güç ve otomatik araç kapağını açın.<ol>
<li>Sıralama çip, fiş adaptörü, zenginleştirme kartuş, ipucu kartuş, PCR plaka, PCR çerçeve mühür, kurtarma tüp, çözüm kartuş ve reaktif kartuşu otomatik araç uygun konuma yerleştirin.</li>
		<li>Dokunmatik çalışma [Kurulum] ve [adım adım] üstünde belgili tanımlık perde.</li>
		<li>Kapağı kapatın ve [Başlat onay] dokunmatik ekran üzerinde.</li>
		<li>Sonra güverte tarama işlemini, [ileri] dokunmatik ekran üzerinde.</li>
		<li>(Kit, yonga türü, çip ID, örnek kimliği, planları) ekran içeriğini denetleyin, saati ayarlamak ve [OK] dokunmatik ekran üzerinde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çip yükleme bittikten sonra:<ol>
<li>[İleri] dokunmatik ekran üzerinde ve kapağını açın.</li>
		<li>Sıralama küçük parça--dan fiş adaptörü eldivenli ellerle kaldırıldı.</li>
		<li>Çip çip kapsayıcıya yerleştirmek rap parafilm ve sıralama tepki kadar 4 ° C'de mağaza ile.</li>
		<li>Zenginleştirme kartuş, PCR plaka, PCR çerçeve mühür, kurtarma tüp, çözüm kartuş ve reaktif kartuşu eldivenli ellerle otomatik enstrümanın uygun konumdan kaldırıldı.</li>
		<li>Bir boş-ipucu kartuş otomatik araç eldivenli elleri ile atık ipucu konumunu aktarın.</li>
		<li>[İleri] dokun ve kapağı kapatın.</li>
		<li>[Başlat] dokunma ve 4 dk için ultraviyole ışınları tarafından otomatik araç temiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ultrasaf su ve filtre çözüm 0,22-µm filtre akış filtresi birimi olan 1000 ml sodyum klorit tablet geçiyoruz.<ol>
<li>Sıralama araç gücüyle.</li>
		<li>Dokunma [temiz] ve [ileri] sıralama enstrümanın ekranda.</li>
		<li>Sıralama araç 250 mL filtre sterilize sodyum klorit çözüm ve daha sonra 250 mL ultrasaf su ile temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>[Başlat] dokunun ve ekrandaki uygun sıralama seti seçin.<ol>
<li>Uygun yerde gri bir nakliyeci eldivenli elleriyle yükleyin.</li>
		<li>(Kit ile sağlanan) yıkama çözüm, (100 mM sodyum hidroksit 350 µL içeren) pH ayarlama çözüm ve (kit ile sağlanan) pH standart çözüm ile sıralama aracı başlatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Kit ile sağlanan) dATP, dGTP, dCTP ve dTTP nükleotit (Seti'nde sağlanan) 50 mL tüpler 20 µL 100 µL pipet ile ekleyin.<ol>
<li>Uygun yerde gri bir nakliyeci eldivenli elleriyle yükleyin.</li>
		<li>50 mL tüp ve vida sıralama araç üzerine yükleyin.</li>
		<li>[İleri] dokunmatik ekran üzerinde yaklaşık 25 dakika sürer başlatma adım başlamak için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başlatma adımı tamamladıktan sonra:<ol>
<li>[Run] dokunmatik ekran üzerinde ve uygun Kütüphane hazırlık aracı seçin.</li>
		<li>Çipin iki boyutlu barkod tarama.</li>
		<li>Uygun konumu sıralama çipte yerleştirin.</li>
		<li>Çip kelepçe ve enstrüman kapıyı kapat.</li>
		<li>[Çip onay] [ileri], dokunma ve [sıralama çalışma başlatmak için ekrandaki OK].</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıralama reaksiyon sonra veri aktarımı ve veri analiz boru hattı üzerinde sıralama sunucu13,17gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Path+to+Cancer+-+Three+Strikes+and+You're+Out.">The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out.</a> N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).</li><li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome+atlas+pan-cancer+analysis+project.">The cancer genome atlas pan-cancer analysis project.</a> Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li><li>Nagasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+variant+discovery+by+deep+whole-genome+sequencing+of+1,070+Japanese+individuals.">Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals.</a> Nat Commun. 6 (8018), (2015).</li><li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+genome+landscapes.">Cancer genome landscapes.</a> Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).</li><li>Zehir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+landscape+of+metastatic+cancer+revealed+from+prospective+clinical+sequencing+of+10,000+patients.">Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients.</a> Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).</li><li>Garraway, L. A., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+the+cancer+genome.">Lessons from the cancer genome.</a> Cell. 53 (1), 17-37 (2013).</li><li>Chalkley, R., Hunter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-histone+propinquity+by+aldehyde+fixation+of+chromatin.">Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).</li><li>Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixation+on+the+amplification+of+nucleic+acids+from+paraffin-embedded+material+by+the+polymerase+chain+reaction.">Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction.</a> J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>Adhya, A. K., Mohanty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+touch+imprint+cytology+in+the+preoperative+diagnosis+of+malignancy+in+low+resource+setting.">Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting.</a> Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).</li><li>Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touch+Imprint+Cytology+and+Frozen-section+Analysis+for+Intraoperative+Evaluation+of+Sentinel+Nodes+in+Early+Breast+Cancer.">Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer.</a> Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).</li><li>Sumiyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+intraoperative+touch+smear+cytology+in+breast-conserving+surgery.">Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery.</a> Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).</li><li>Amemiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Touch+imprint+cytology+with+massively+parallel+sequencing+(TIC-seq):+a+simple+and+rapid+method+to+snapshot+genetic+alterations+in+tumors.">Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors.</a> Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).</li><li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+multiple+lung+cancers:+Discrimination+between+primary+and+metastatic+lung+cancers+by+genomic+profile.">Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile.</a> Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).</li><li>Goto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+tumor-derived+DNA+dispersed+in+the+airway+improves+the+diagnostic+accuracy+of+bronchoscopy+for+lung+cancer.">Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer.</a> Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).</li><li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+and+exome+sequencing+identified+somatic+mutations+in+hepatocellular+carcinoma.">Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).</li><li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+two+amplicon-based+sequencing+panels+of+different+scales+in+the+detection+of+somatic+mutations+associated+with+gastric+cancer.">Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer.</a> BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).</li><li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+HER2+V777L+mutation+mediates+resistance+to+trastuzumab+in+a+breast+cancer+patient.">Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient.</a> Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).</li><li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+BRCA1+and+BRCA2+germline+mutations+in+Japanese+population+using+next-generation+sequencing.">Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).</li><li>Hirotsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+panel+analysis+identified+germline+mutations+of+DNA+repair+genes+in+breast+and+ovarian+cancer.">Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer.</a> Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).</li><li>Li&#232;vre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+mutation+status+is+predictive+of+response+to+cetuximab+therapy+in+colorectal+cancer.">KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).</li><li>Mok, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+or+Platinum-Pemetrexed+in+EGFR+T790M-Positive+Lung+Cancer.">Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer.</a> N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).</li><li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted-capture+massively-parallel+sequencing+enables+robust+detection+of+clinically+informative+mutations+from+formalin-fixed+tumours.">Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours.</a> Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).</li><li>Wong, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+artefacts+in+a+prospective+series+of+formalin-fixed+tumours+tested+for+mutations+in+hotspot+regions+by+massively+parallel+sequencing.">Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing.</a> BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada, tümör DNA TIC kullanarak klinik patolojik numunelerin elde etmek için alternatif bir yöntem mevcuttur. TIC hazırlık çok basittir ve FFPE yöntemleri, özel aletleri10zorunluluğu olmadan ile karşılaştırıldığında daha az zaman ihtiyacı var. TIC hazırlık DNA ekstraksiyon için yordamlar (şekil 1) iki gün içinde tamamlanabilir. Bu yöntem böylece genetik test gerçekleştirmek için geri dönüş süresini kısaltır. Özellikle, bu...

Yeni nesil sıralama teknolojisi araştırmacılar genetik varyasyonları, Mendel hastalığı, kalıtsal yatkınlık ve kanser 1,2,3 genom bilgileri analiz önemli gelişmeler sağlamıştır . Kanser genom Atlas (TCGA) ve uluslararası kanser genom Konsorsiyumu (ICGC) genetik değişiklikler çeşitli yaygın kanserlerin4tanımlaması yakalamışlardır. Temel kanser sürücü genler yüzlerce başarıyla tespit edilmiştir ve bu moleküllerin bazıları ilaç geliştirme1,5,6için hedef alınmaktadır.
Klinik ortamda FFPE numuneler Patolojik tanı ve moleküler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için test için yaygın olarak kullanılır. Ancak, formalin ile fiksasyon sürecinde DNA-protein veya DNA-DNA cross-linking oluşur ve DNA fragmantasyonu indüklenen. Böylece, FFPE DNA örnekleri her zaman düşük kalite ve miktar DNA7,8,9nedeniyle genetik analiz için uygun değildir. Ayrıca, o FFPE numuneler hazırlamak için birkaç gün sürer ve teknik beceri doğru bölümleri hazırlamak gereklidir. Bu nedenle, bu yüksek kaliteli bozulmamış DNA elde etmek için basit ve hızlı bir yöntem geliştirmek için arzu edilir.
Sitoloji Patolojik tanı için alternatif bir yöntemdir. Daha basit, daha az pahalı ve daha hızlı yaklaşım FFPE hazırlık10ile karşılaştırıldığında saytolojik örnek hazırlıktır. TIC tekniği sentinel lenf düğümleri ve meme kanserli hastalarda bir yıl11,12için intraoperatif hızlı tanı için marjinal dokulardan yapıldı. Ancak, yüksek kaliteli genomik DNA-ebilmek var olmak hulâsa TIC örnekler incelenmiştir ve sonraki genetik analiz için kullanılan birkaç raporları vardır. Saytolojik örnekler yaygın özelikle (Pap) veya Giemsa boyama ile lekeli ve biz daha önce miktarı ve kalitesi TIC örnekler (özellikle Giemsa lekeli örnekleri) çıkarılan DNA'ın FFPE elde edilen örnekler daha üstün olduğunu bildirdi doku13. PAP boyama ile karşılaştırıldığında, Giemsa boyama boyama daha az prosedürleri gerektiren bir avantaja sahiptir. Sonra örnekleri sabit ve lekeli, Pap boyama, onlar orta (örneğin, Malinol) tümör hücreleri, normal hücreleri ve inflamatuar hücrelerin mikroskop altında gibi örnek içeriği ayırt için montaj ile monte edilmesi gerekir. Pap numune montaj adım hazırlanan örnek kurutulur çünkü hücrelerin mikroskop altında gözlemlemek neredeyse imkansız. İçinde karşılaştırma, Giemsa boyama kurutulmuş durumda görülebilir, bu nedenle, montaj adım hızlı hücresel değerlendirme için gerekli değildir. Kuru numune gerektirdiğinden mikrodiseksiyon için Giemsa boyama daha uygundur.
Bu raporda, biz Giemsa boyama ile TIC numunelerin hazırlanması için basit ve hızlı bir yöntem tanıtmak ve TIC FFPE numuneler ile karşılaştırıldığında DNA için daha iyi bir kaynak olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>FINE FROST white20 micro slide glass</td><td>Matsunami Glass ind, Ltd</td><td>SFF-011</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick A solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20571</td><td></td></tr><tr><td>Cyto Quick B solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>20581</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15053</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa solution</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>15002</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan RNase P Detection Reagents Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316831</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324034</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optical Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroMixer E36</td><td>TITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VIIA7-03</td><td></td></tr><tr><td>Himac CF16RXII</td><td>Hitachi-koki</td><td>CF16RII</td><td></td></tr><tr><td>Ion Library TaqMan Quantitation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4468802</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475346</td><td></td></tr><tr><td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4480442</td><td></td></tr><tr><td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4471250</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30044</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chef System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484177</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-well Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Veriti200</td><td></td></tr><tr><td>Ion 318 Chip Kit v2 BC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4488150</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PGM11-001</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Wash 2 Bottle kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25591</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&amp;trade; AMPure&amp;trade; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>16-position Magnetic Stand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&amp;trade; Optical 96-well Reaction Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp&amp;trade; Clear Adhesive Film</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&amp;trade; AMPure&amp;trade; XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol(99.5)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08948-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (10M)</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>DTU-Neo</td><td>TAITEC</td><td>0063286-000</td><td></td></tr><tr><td>E-36</td><td>TAITEC</td><td>0027765-000</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE Ci-L</td><td>Nikon</td><td>704354</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014393</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014384</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>petit-change</td><td>WAKEN</td><td>MODEL8864</td><td>Mini centrifuge</td></tr><tr><td>petit-incubator</td><td>WAKEN</td><td>WKN-2290</td><td>Air incubator</td></tr><tr><td>SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves</td><td>MEDLINE</td><td>SEM486802</td><td></td></tr><tr><td>Sterile gauze</td><td>Osaki</td><td>11138</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator MediCool</td><td>SANYO</td><td>MPR-312DCN-PJ</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.130</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER TRIMMING BLAD</td><td>FEATHER</td><td>No.260</td><td></td></tr><tr><td>FEATHER S</td><td>FEATHER</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genius 3</td><td>IKA</td><td>41-0458</td><td>Vortex mixer</td></tr><tr><td>Pincette</td><td>NATSUME</td><td>A-5</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microtube</td><td>BIOBIK</td><td>RC-0150</td><td></td></tr></tbody></table>

simple and rapid method to obtain high-quality tumor dna from clinical-pathological specimens using touch imprint cytology

Yönetim ve belirli moleküler hedefli uyuşturucu tedavisi kanser hastaları için önce kanser mutational durumunu belirlemek için önemlidir. Klinik ortamda parafin gömülü (FFPE) doku formalin sabit genetik test etmek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, FFPE DNA genellikle zarar görmüş ve formalin ile fiksasyon işlemi sırasında parçalanmış. Bu nedenle, FFPE DNA bazen düşük kalite ve DNA miktarı nedeniyle genetik test için yeterli değildir. Burada mikroskop altında gözlenen dokunmatik Künye Sitoloji (TIC) genomik DNA kanser hücrelerinden elde etmek için bir yöntem mevcut. Hücre morfolojisi ve kanser hücre sayıları TIC numuneler kullanılarak değerlendirilebilir. Ayrıca, genomik DNA ekstraksiyon TIC örneklerinden iki gün içinde tamamlanabilir. Toplam miktar ve kalite TIC bu yöntemi kullanarak elde edilen DNA FFPE DNA daha yüksek. Araştırmacılar yüksek kaliteli DNA (örneğin, sonraki nesil sıralama analizi, dijital PCR ve nicel gerçek zamanlı PCR) genetik test için elde etmek için ve sonuçları raporlama için dönüş süresini kısaltmak için bu hızlı ve basit bir yöntem sağlar.

Şekil 1 TIC numuneler DNA ekstraksiyon için hazırlanıyor üzerinden tüm süreci gösterir. Özellikle, yordamı genomik DNA TIC örneklerinden elde etmek için sadece iki gün alır. Biz herhangi bir etkisi tümör depolama slayt işlemeden önce değerlendirildi. Tümör hücreleri doku örnekleri hemen slayt dokundu vardı ve dokular serum fizyolojik nemli steril-gazlı bez için 1 h (Şekil 2) tutuldu cam slayt bağlı ol...

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology at JoVE.com

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

simple-rapid-method-to-obtain-high-quality-tumor-dna-from-clinical

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.8K Görüntüleme.  Yamanashi Central Hospital. Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Video: Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Kanser Araştırmaları

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a better understanding of tumor heterogeneity and thus facilitate the selection of patients for personalized treatment. However, this is hampered because of the rarity of CTCs. We present an innovative approach for sampling a high volume of the patient blood and obtaining information about presence, phenotype, and gene translocation of CTCs. The method combines immunofluorescence staining and DNA fluorescent-in-situ-hybridization (DNA FISH) and is based on a functionalized medical wire. This wire is an innovative device that permits the in vivo isolation of CTCs from a large volume of peripheral blood. The blood volume screened by a 30-min administration of the wire is approximately 1.5-3 L. To demonstrate the feasibility of this approach, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression and the chromosomal translocation of the ALK gene were determined in non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines captured by the functionalized wire and stained with an immuno-DNA FISH approach. Our main challenge was to perform the assay on a 3D structure, the functionalized wire, and to determine immuno-phenotype and FISH signals on this support using a conventional fluorescence microscope. The results obtained indicate that catching CTCs and analyzing their phenotype and chromosomal rearrangement could potentially represent a new companion diagnostic approach and provide an innovative strategy for improving personalized cancer treatments.

We present a new approach to characterize tumor cells. We combined immunofluorescence with DNA fluorescent-in-situ-hybridization to evaluate cells captured by a functionalized medical wire capable of in vivo enriching CTCs directly from patient blood.

Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Davranış

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Tıp

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Establishment of a Clinic-based Biorepository

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is expected that there will be a parallel demand for cutaneous tumor samples for biomedical research studies. Tissue availability, however, is limited due the cost of establishing a biorepository and the lack of protocols available for obtaining clinical samples that do not interfere with clinical operations. A protocol was established to collect and process cutaneous tumor and associated blood and saliva samples that has minimal impact on routine clinical procedures on the date of a Mohs surgery. Tumor samples are collected and processed from patients undergoing their first layer of Mohs surgery for biopsy-proven cutaneous malignancies by the Mohs histotechnologist. Adjacent normal tissue is collected at the time of surgical closure. Additional samples that may be collected are whole-blood and buccal swabs. By utilizing tissue samples that are normally discarded, a biorepository was generated that offers several key advantages by being based in the clinic versus the laboratory setting. These include a wide range of collected samples; access to de-identified patient records, including pathology reports; and, for the typical donor, access to additional samples during follow-up visits.

Cutaneous tumors are often discarded following Mohs micrographic surgery. A protocol is described here that enables clinical support staff to effectively process and store cutaneous tumor (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) samples for downstream laboratory applications without interfering with clinical operations.

Kliniğe Dayalı Biyorepositoryum Kurulması

The incidence of skin cancer (e.g., squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma, and melanoma) has been increasing over the past several years. It is ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Biyoloji

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for the recovery of trace DNA employ cotton swabs or adhesive tape to sample an area of interest. However, such a &#8216;blind-swabbing&#8217; approach will co-sample cellular material from the different individuals, even if the individuals&#8217; cells are located in geographically distinct locations on the item. Thus, some of the DNA mixtures encountered in touch DNA samples are artificially created by the swabbing itself. In some instances, a victim&#8217;s DNA may be found in significant excess thus masking any potential perpetrator&#8217;s DNA.
In order to circumvent the challenges with standard recovery and analysis methods, we have developed a lower cost, &#8216;smart analysis&#8217; method that results in enhanced genetic analysis of touch DNA evidence. We describe an optimized and efficient micromanipulation recovery strategy for the collection of bio-particles present in touch DNA samples, as well as an enhanced amplification strategy involving a one-step 5 &#181;l microvolume lysis/STR amplification to permit the recovery of STR profiles from the bio-particle donor(s). The use of individual or few (i.e., &#8220;clumps&#8221;) bioparticles results in the ability to obtain single source profiles. These procedures represent alternative enhanced techniques for the isolation and analysis of single bioparticles from forensic touch DNA evidence. While not necessary in every forensic investigation, the method could be highly beneficial for the recovery of a single source perpetrator DNA profile in cases involving physical assault (e.g., strangulation) that may not be possible using standard analysis techniques. Additionally, the strategies developed here offer an opportunity to obtain genetic information at the single cell level from a variety of other non-forensic trace biological material.

Here we describe an optimized and efficient removal strategy for the collection of bio-particles present in &#8216;touch DNA&#8217; samples, together with an enhanced amplification protocol involving a one-step 5 &#181;l micro-volume lysis/STR amplification, to permit the recovery of short tandem repeat (STR) profiles of the bio-particle donor(s).

Adli &#39;Dokunmatik DNA&#39; Kanıt dan Basitleştirilmiş mikromanipulasyon tarafından Kurtarılan Tek İnsan Bioparticles geliştirilmiş Genetik Analiz

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection

The presence of contaminating non-tumor tissues in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can greatly undermine genomic studies. Herein we describe macrodissection, a method designed to augment the percentage tumor content of a tissue specimen by removing and eliminating unwanted tissue prior to performing downstream nucleic acid extractions. FFPE tissue blocks were sectioned to produce 4-5 &#181;m slide-mounted tissue sections. A representative section was submitted for hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining and subsequently reviewed by a board-certified pathologist. During the review, the pathologist identified and marked the regions of tumor tissue in the H&#38;E. Once complete, the demarked H&#38;E was used to guide resection of the serial unstained sections from the same tissue block. To demonstrate the effects of macrodissection, RNA extracted from matched macrodissected and non-dissected Diffuse Large B-Cell Lymphomas (DLBCL) were run on a digital gene expression assay capable of determining DLBCL subtype and BCL2 translocation status. The results showed that macrodissection changed the subtype or BCL2 translocation status calls in 60% of the samples examined. In conclusion, macrodissection is a simple and effective method for performing tumor enrichment prior to nucleic acid extractions, the product of which can then be confidently used in downstream genomic studies.

This protocol presents a method to increase the percent tumor content of formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.

Tümör Makrodiseksiyonu ile Tümör İçeriğinin Arttırılması

The presence of contaminating non-tumor tissues in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can greatly undermine genomic studies. Herein we ...