Bu eser için bilimsel araştırma (NWO; Hypatia bursu Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi, kariyer geliştirme Ödülü insan sınır bilim programı, yerçekimi programı 2013 Hollanda organizasyon tarafından desteklenmiştir ICI-024.002.009), bir VIDI vermek NWO (ALW VIDI 864.14.001) ve bir başlangıç Grant Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (hibe sözleşmesi numarası 336479) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden.

1. mikroskop örnekleri hazırlanması
<ol>
	<li>Qa-tuzak sözdiziminin 4 ifade mCitrine (sözdiziminin 4-mCitrine; donör fluorophore) erimiş ve R-tuzak VAMP3 mCherry (VAMP3-mCherry) erimiş Not: Diğer tuzaklarına onların C-terminal transmembran sarmal erimiş floresan proteinler ile de kullanılabilir. MCitrine-mCherry yerine hayalice ayrı fluorophores diğer donör-alıcısı çiftlerini de kullanılan (örneğin, CFP-YFP) olabilir.<ol>
		<li>HeLa hücreleri büyümek ve üç 35 mm çaplı cam alt yemekleri mikroskopi için uygun üzerinden 900.000 HeLa hücreleri bölmek. Not: ilke olarak, bu iletişim kuralı diğer ökaryotik hücre tipleri ve mikroskopi yemekleri için adapte edilebilir.<ol>
			<li>T75 Şişeler 10 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), % 10 fetal buzağı serum (FCS) ve % 1 antibiyotik antimycotic (içeren Amfoterisin B, penisilin ve streptomisin) 37 ° C'de ve % 5 ile desteklenmiş yüksek glikoz ile HeLa hücre kültürleri korumak CO 2 hücre kültür kuluçka.</li>
			<li>Orta haftada iki kez doldurmak ve hücreleri 1:10 haftada bir kez veya hücreleri confluency yeni T75 şişeler (500.000 hücreler/flask, ortalama) % 85-90 ulaştığınız zaman bölünmüş.</li>
			<li>DMEM kaldırmak ve HeLa monolayers 8 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 3 dakika ile iki kez yıkayın.</li>
			<li>PBS kaldırın ve PBS 2 mL 2 mM ethylenediaminetetraacetic asitle (EDTA) ekleyin.</li>
			<li>Hücreleri hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 5 min için kuluçkaya ve daha sonra hafifçe şişeye HeLa hücreleri balonun altından ayırmak için tahrik.</li>
			<li>Orta 10 mL ile hücreleri temizlemek, süspansiyon 15 mL tüp aktarmak ve sayımı için 10 µL aliquot kaldırmak.</li>
			<li>Aliquot 1: %0,4 trypan mavi leke ile 1 sulandırmak ve Bürker hemasitometre9hücreleri saymak. Not: 10.000 hücre/mL sayısı için tarafından iki 4 x 4 kareler ve birden çok hücre sayı saymak.</li>
			<li>Sonra sayım 15 mL tüp almak 900.000 hücreleri hücre (bkz. Adım 1.1.1) 3 cam alt yemekleri onları bölmek ve transfection için hazır olun.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hücre çoğalmasıyla10 tarafından transfect ( Tablo malzemelerigörmek) sahip sözdiziminin 4-mCitrine yapı (yalnızca, donör Örnek #1), sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (örnek 2) ve sözdiziminin 3 ile birlikte erimiş mCitrine ve mCherry () için Örnek 3). Not: Diğer hücre transfection yöntemleri de kullanılan11olabilir. Örnek #3 tandem inşa kısa ömrü expectable (Yani, maksimal expectable perde) tahmin etmek için olumlu bir denetimdir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yüksek glikoz % 10 FCS ve antibiyotik-antimycotic % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 37 ° C'de % 1 ile birlikte gelen DMEM hücreleri gecede kültür.</li>
	<li>DMEM Aspire edin ve bir kez canlı hücre orta Imaging hücrelerle yıkayın (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7.4, mOsm = 300 =; Tablo reçetesibakın) 2 min için ve daha sonra hücreleri taze görüntülemede yer Orta.</li>
</ol>
2. veri yazmak için FLIM
<ol>
	<li>Yer Örnek #2 saat-alan FLIM confocal mikroskop altında pulsed uyarma kaynağı ile donör fluorophore (örneğin, mCitrine) ve zaman çözülmüş veri toplama için. Isıtmalı bir sahne ile 37 ° C'de hücreler tutmak. Not: Bu protokol için kullanılan confocal mikroskop bir 63 X 1,20 NA su daldırma amacı ile de, bir beyaz ışık lazer bulunuyor (80 MHz darbe, &#60; 100 ps darbe süresi), bir foton çarpanı tüp (PMT) ve bir Time-Correlated tek foton sayma (TCSPC ) sistemi ( Tablo malzemeler kullanılan özel kurulum için bakınız). Diğer FLIM mikroskoplar kullanılan (örneğin, PMTs, tek dalga boyu pulsed lazerler bir beyaz ışık pulslu lazer yerine yerine tek foton çığ diyotlar (SPAD)) da olabilir.</li>
	<li>MCitrine ve mCherry etiketli SNARE proteinler görünür ifadesi içeren bir hücreyi seçin ve her FLIM ölçü önce her iki fluorophores aynı anda uyarma 256 × 256 piksel olan confocal bir resmi kaydetmek. Yaklaşık 2 kat kırınım mikroskop Uzaysal çözünürlük sınırlı daha küçük bir piksel adım (~ 200 nm) kullanılmalıdır. 516 nm ve 521-565 nm toplamak emisyon mCitrine için heyecanlandırmak; 613-668 nm 610 nm ve toplamak emisyon, mCherry için heyecanlandırmak. Not: görüntüleme uçak çok yakın çanak alt konum yapmak (içinde ~ 2 µm mesafe), bu bir yansıma tepe Floresans ömür boyu histogram da yol açar. Bu örnek hareket olası sorunu aşmak için donör ve alıcısı fluorophores eşzamanlı uyarma tercih edilen, önemlidir. Ancak, sıralı uyarma de kullanılabilir.</li>
	<li>Kayıt aynı boyutlara ve confocal resmi olarak Uzaysal çözünürlük ile kaydedilen FLIM görüntü ile Çalıştırmak FLIM tıklayarak bir FLIM görüntü adım 2.2. Bütün hücre FLIM çözümleme veya en az 400 fotonlar/piksel görüntü en az 50.000 fotonlar kaydedin. Sadece mCitrine donör fluorophore ve değil mCherry alıcısı fluorophore heyecanlandıracak ve böylece 521-565 nm 516 nm ve toplamak emisyon, heyecanlandırmak.</li>
	<li>Çoklu hücrelerdeki ve diğer örnek #1 (sadece donör) ve örnek #3 (mCitrine-mCherry tandem yapı) 2.1-2.3 adımları yineleyin.</li>
	<li>Bir enstrüman yanıt işlevi (IRF) kaydedin. Uyarma dalga boyu (örneğin, 510-550 nm kayıt emisyon) için emisyon dedektörü monokromatör ayarlamak ve sonra geri bir temiz cam kapak kayma FLIM Çalıştırdüğmesini tıklatarak saçılma ile bir FLIM görüntü kaydetmek. Aynı uyarma dalga kullanın (516 nm) ve lazer gibi adımlar 2,1-2.4 hücre veri kaydetmek için kullanılan güç. Not: birden fazla doruklarına IRF içinde görünür durumdaysa ya da emisyon monochromators ayarlı, IRF da floresan boya ile ultrafast ömür boyu, bir çözüm ile örneğin bir organik boya ile doymuş bir sulu Floresans Şoklama tarafından ölçülebilir Potasyum iyodür çözüm. Ayrıca, Floresans histogramlar çürüme eğimi de IRF deconvolution monte edilebilir çünkü bir IRF kaydetmek için kesinlikle gerekli değildir. Ancak, bir IRF kullanılan foton dedektörü zamanlama özellikleri için düzeltmek için sağlar ve böylece ömür boyu histogramlar krizleri daha doğru olmasını sağlar.</li>
</ol>
3.Foton kayıtları FLIM görüntülere dönüştürme
<ol>
	<li>Karşıdan yükleyip PT32ICS dönüşüm yazılım5. Not: Ömür boyu veri da bilgisayar yazılımı--dan çeşitli mikroskop satıcılar da dahil olmak üzere diğer yazılımlar tarafından analiz edilebilir.</li>
	<li>PT32ICS yazılım yapılandırın.<ol>
		<li>256 × 256 piksel görüntü boyutu Ayarları üzerinden boyutu ayarlamak | Boyutu.</li>
		<li>2 ayarları kanal ayarla | Boyutu. Not: Kanal mCitrine emisyon sadece mikroskop yapılandırmasına bağlıdır. Hatalı bir kanal bir FLIM görüntü yok fotonlar (Yani, siyah görüntü) ve sonuç olarak boş bir 'LifetimeTable.txt' neden olur-dosya. Doğru kanal deneme-yanılma tarafından tespit edilebilir.</li>
		<li>ImageJ (xyz) için Çıkış ayarla (veya TRI2 (xyt)) FLIM görüntüleri (Adım 3.4) oluşturmak için.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Convert tuşuna basın ve bir veya daha fazla foton izlemeler (.pt3 dosyaları) yükleyin. Birden fazla foton izleme seçmek için Ctrl tuşunu basılı tutun. Not: Daha yeni 64 bit .ptu biçimi de dönüştürülebilir.</li>
	<li>PT32ICS yazılım pt3 dosyalarının kaydedildiği yer olarak aynı klasörde aşağıdaki dosyaları oluşturur emin olmak: bir foton yığın .pt3 foton izlemesinde resim sitometresi standart biçimi (.ics), .pt3 foton izleme (.bmp) her bir bit eşlem dosyası, metin dosyası dönüşüm başına ücret (_Report.txt) içeren bilgi içeren toplam foton istatistikleri (Yani, her .pt3 foton izleme, zaman çözünürlüğü Dedektör fotonlar toplam sayısı) ve ikinci bir metin dosyası dönüştürme (_LifetimeTable.txt) başına Floresans ömür boyu çubuk grafikler her .pt3 foton izleme için sekmeyle ayrılmış biçimde. Not: .ics dosyası FLIM görüntülerle, örneğin TRI2 yazılım12,13 ya da Kütüphane FIJI ImageJ14,15dakika sonra uygun ince eğri oluşturmak için uygun tek piksel için kullanılabilir. Bu dosyayı da Fazör analiz16için örneğin FIJI Spechron üzerinden zaman Gated Fazör eklentisi ile kullanılabilir. Bit eşlem dosyası ömür boyu bilgiler içermez. İkinci metin dosyası 4. adımda bütün hücreli FLIM analizi için kullanılır.</li>
</ol>
4. uygun floresan ömür boyu histogramlar bütün hücreli FLIM analizi için
Not: Bu adımı (deconvoluted provası IRF) yazılımı deconvoluted provası kapasitesine sahiptir gerektirir. IRF deconvolution olmadan Floresans histogramlar yamaçları uygun diğer yazılımlar ile de yapılabilir.
<ol>
	<li>Veri analizi yazılım programı deconvolution (Malzeme tablo) ile uygun yetenekli açın ve her foton izleme (_LifetimeTable.txt) dosya üzerinden için çubuk içeren metin dosyası alma | Alma | Tek ASCII.</li>
	<li>IRF ( Kopyala ve Yapıştırkullanarak) tablonun ikinci sütununda öyle ki tabloyu yeniden düzenlemek. IRF ikinci sütununda B a ilk sütunundaki zaman değerleri yanında yer</li>
	<li>Ctrl + A tuşlarına basıp arsa seçerek tüm sütunları seçerek kaydedilen foton izlemeler kalitesini belirlemek | Paneli çoklu | 9 paneli. Foton izleri bir yüksek yansıma tepe (şekil 4F) ile analiz etmiyorsun.</li>
	<li>Seçin Ctrl kullanarak B sütunundaki IRF yanı sıra monte edilebilir kalite kontrollü ömür boyu çubuk grafikler içeren tüm sütunları anahtar ve doğrusal olmayan uydurma analiz üzerinden yüklemek | Uygun | Doğrusal olmayan eğri Fit | Açık iletişim.</li>
	<li>Analiz yazılımı için bu işlev ekleyerek deconvoluted uygun işlev ( ek dosya 1' kullanılabilir) yük ( Kategori üzerinden | Kullanıcı tanımlı | İşlev | Ekle). 'FLIM_convoluted_IRF.fdf' uygun işlev dosyayı seçin. Bu işlev uygun floresan ömür boyu histogramlar bir mono üstel çürüme fonksiyonu ile deconvoluted (Yani, tabloda ikinci sütun B) IRF ile (Denklem 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(Denklem 1) t ile belgili tanımlık zaman, τ belirgin Floresans ömür boyu, A genlik ve y0 uzaklık. Not: Başka bir ömür boyu histogramlar BI üstel uygun fonksiyon (Denklem 2) ile uygun seçenektir: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(Denklem 2) Donör tek şart yavaş bileşenine (τ1) ömrünü sabitleme tarafından (Adım 1.1.2: Örnek #1) ve hızlı bileşeninin (τ2) tandem yapı (örnek 3) için bu kısmını tahmini sağlar TUZAK protein kompleksi (F) üzerinden genlikleri yavaş (A1) ve hızlı bileşenleri (A2; bkz: tartışma; Denklem 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(Denklem 3) Deconvoluted BI üstel uygun 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' için uygun fonksiyon dosyası ek dosya 2' kullanılabilir.</li>
	<li>Seçin donatılmış eğrileri | Veri türü x olarak giriş veri olarak aynı. Not: Bu xuygun yol açar-monte eğrileri eksen ölçeklendirme.</li>
	<li>Eğrileri uygunbasarak uygun. Not: Bu uygun dönüştürmek ve bir 'raporu sayfası' dizisinde Floresans yaşam süreleri, ofset ve genlikleri içeren bir tabloyla birlikte oluşturmak. Ayrıca monte eğrileri ve fazlalıklar uygun veri sayfasıyla oluşturacaktır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion.">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li><li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+and+traffic.">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li><li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion.">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li><li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking.">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), 1543-1559 (2009).</li><li>Verboogen, D. R. J., Gonz&#225;lez Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation.">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dance+of+the+SNAREs:+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses.">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+pixel+kinetic+data+analysis+for+FRET+detection+by+multi-photon+time-domain+FLIM.">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).</li><li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Biosensor F&#246;rster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li><li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane.">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li><li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift.">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li><li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits.">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li><li>Veale, K. J., Offenh&#228;user, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4/SNAP23+mediates+adhesion,+cell+spreading+and+persistent+migration.">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li><li>G&#243;mez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells.">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı FRET-FLIM görselleştirme SNARE sözdiziminin 4 ve VAMP3 canlı HeLa hücreleri arasında bir köprü işlevi için kullanımı gösterilmiştir. Sözdiziminin 4 ağırlıklı olarak nerede ekzositozu1,2,20,21aracılık eder plazma zarı bulma Qa-tuzak bir proteindir. VAMP3 esas olarak endosomal bölmeleri geri dönüştürme bulmak için açıklanan ve diğer endosomes de plazma zarı1,2,20olarak kaçakçılığı aracılık eder R bir tuzak var. Ancak, FRET-FLIM tahlil diğer SNARE proteinler eğitimi için kolayca adapte edilebilir. Bu tuzaklarına hangi çoğu SNARE proteinler tarafından uzak1,2için geçerli bir C-terminal transmembran heliks içeren tek durumdur. Ayrıca, burada açıklanan protokol SNARE kompleksleri bitki ve Maya da dahil olmak üzere herhangi bir ökaryotik hücre tipinde görselleştirme için adapte edilebilir. Bu protokol için donör fluorophore floresan ömrünü kısalma perde ölçüsü olarak kullanılan. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak alıcısı fluorophore ömrünü muayene, kesin kanıt bu rezonans enerji transferi sağlayan duyarlilasmis emisyon belirgin artış faz nedeniyle oluşur.
Şu anda, FRET-FLIM tekniği lizozomal bölmeleri SNARE kompleksleri görselleştirmek mümkün olmayabilir. Sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem inşa etmek için mCherry floresan kez mCitrine sinyal içinde cep daha bol ise büyük olasılıkla lizozomal bölmeleri için karşılık gelen bir juxtanuclear alanı, daha fazla birikmiş bulunabilir çevre5. Aynı SNARE protein flüoresan bu proteinler erimiş co ifade5yaşındayken mCitrine için karşılaştırıldığında mCherry benzer bir juxtanuclear birikimi gözlenmiştir. Organellerin karakterize tarafından son derece düşük bir pH (&#60; 4) ve proteolitik enzim yüksek bir etkinlik. MCherry juxtanuclear birikimi büyük olasılıkla mCherry fluorophore mCitrine fluorophore göre lizozomal bozulması için daha yüksek bir direnç nedeniyle oluşur. MCherry juxtanuclear birikimi de hücreleri5fiksasyonu gerçekleştiği sırada için pH-Şoklama nedeniyle mCitrine, biri değil. Bu nedenle, FRET-FLIM tekniği FRET juxtanuclear (lizozomal) bölgelerde miktarı hafife ve bu organellerin sert şartları Lümen içinde hayatta diğer floresan muhabir proteinler gerektirir.
FRET-FLIM ilke (yarı-) kantitatif tahmin karmaşık5tuzaklarına fraksiyonunun elde etmek için izin verir. Bu protokol için açıklandığı gibi bu gerektirir Floresans ömür boyu histogramlar (Denklem 2), çift üstel çürüme işlevleriyle uygun hızlı bileşeni genliği tuzaklarına kısmını orantılı nerede karmaşık () içinde Denklem 3). Ancak, böyle uygun bir iki model ile teknik olarak zordur. Montaj birden fazla ücretsiz uygun parametreleri (iki floresan hayat ve iki genlikleri) ile çok sayıda fotonlar, özellikle parametreleri birbirlerini etkiler ve ömür boyu küçük hataları genlikleri ve Yardımcısı etkiler gerektirir çok yönlü. Bu uydurma sorunların üstesinden gelmek için Floresans yaşam süreleri yavaş bileşeninin donör tek şart (Yani, hiçbir FRET; sadece mCitrine mevcut) ömür boyu sabit olabilir ve bu tandem ömrünü hızlı bileşenine () inşa maksimal expectable perde). Floresans yaşam süreleri bu denetim durumları ile aynı olmayabilir ve birden çok nedenlerle (kendi kendine Şoklama, dipol yönlendirme, microenvironment değişimler) sapma çünkü ancak, bu aynı zamanda bakım ile yorumlanmalıdır. Yakın bir konumda birden fazla tuzak kompleksleri (&#60; 10 nm) mesafe bağımlı perde, perde "moleküler cetvel" kullanılmak üzere izin verir aynı ilke sonuç ama bu durumda, gizlemektedir SNARE kompleksleri miktar. Çünkü etiketli tuzaklarına endojen (etiketsiz) tuzaklarına ile rekabet Ayrıca, nicel bir tahmin her zaman anlamlı değildir. Sonuç olarak, ifade mCherry etiketli SNARE yüzdesinin FRET5temel belirleyici düzeydir. Bu uyarılar yüzünden bu mono üstel çürüme fonksiyonu (Denklem 1) ile floresan ömür boyu histogramlar sığdırmak için tavsiye edilir. Bu yaşam bir temanın herhangi bir bilgi gerektirmez ve elde edilen belirgin ortalama floresan ömür boyu sağlam bir ölçü için tuzak kompleks5sağlar avantajı vardır.
Yine de, bu iki bileşenli uygun modelleri tarafından nicel FRET-FLIM görüntüleme güçlü gelecekteki uygulamalar olacaktır bekleniyor. TUZAK-encoding genlerin kromozom içinde floresan muhabir proteinler ile örneğin CRISPR/CAS9 tarafından erimiş. Bu endojen protein düzeyleri ve etiketsiz tuzaklarına, hiçbir arka plan ile endojen SNARE proteinlerin floresan etiketleme içinde neden olur ve böylece SNARE kompleksleri tarafından FRET-FLIM fraksiyonunun anlamlı bir nicel tahmini için sağlar. Endojen tuzaklarına ifade düzeyleri oldukça düşük olabilir ve vermek floresan sinyallerini nispeten düşük, bu fotonlar yeterli sayıda, özellikle tüm cep telefonu için (ki sadece birkaç 1.000 s fotonlar, gerektirir) FLIM elde edilebilir olduğunu bekleniyor. Ayrıca, bu perde-FLIM ölçümler de daha yüksek floresan sinyallerini ve daha iyi foton istatistikleri neden olur daha duyarlı çığ fotodiyot dedektörleri ile gerçekleştirilebilir.

Membran kaçakçılığı nerede membran veziküller kapalı bir donör organel bud ve sonra taşımak ve bir hedef organel1,2ile sigorta ökaryotik hücrelerin merkezi bir özelliktir. Mitokondri hariç, tüm bu membran füzyon adımları SNARE proteini aile1,2üyeleri tarafından katalize. Memeli hücrelerinde yaklaşık 36 üye ve Maya2yaklaşık 20 üye SNARE proteini aile oluşur. TUZAK proteinler SNARE-motifler denilen bir veya iki ~ 52 artıkları-uzun, yerel olarak yapılandırılmamış bölgeler, içerir. TUZAK proteinler kez bir C-terminal transmembran heliks1,2tarafından membranlar için gergin. Tuzaklarına katkıda bulundukları karmaşık tuzak arginin (R) ve glutamin (Q) tuzaklarına1,2olarak Merkezi artıkları göre sınıflandırılabilir. Membran füzyon birlikte 4 SNARE-motifler katkıda bulunmak ve üzerinde donör ve alıcısı membran1,2dağıtılan 3 ya da 4 soydaş tuzaklarına etkileşim tarafından tahrik edilmektedir. Bir tuzak kompleks bir R-tuzak motif ve üç Q-tuzak motifleri (kalite güvence, oyun kurucu ve Qc olarak adlandırılan) oluşur. Karmaşık oluşumu başlar SNARE-motifler, sözde transşekillendirme termini N-tuzak-karmaşık ve CISdenilen bir sıkı α-Helisel dolandı-bobin paket oluşturan C termini doğru gelirleri-tuzak-karmaşık. Hatta tek bir tuzak karmaşık karmaşık oluşumu donör ve alıcısı membranlar birlikte sürükler ve membran fusion3için enerji bariyeri üstesinden gelir.
Hücrelerin içindeki belirli ulaşım yolları ayrı SNARE kompleksleri atama kez teknik olarak zordur. Tuzaklarına açıkça kaçakçılığı membran özgüllük katkıda rağmen önüne gelenle yatıp kalkan, işlevsel olarak gereksiz olduğu ve bunların işlevlerini1,2örtüşmesi. Bu nedenle, pertürbasyon deneyler tuzaklarına, gibi hedefleyerek gen nakavt, RNA müdahale, tanıtım antikorlar engelleme ya da baskın negatif hareket çözünür SNARE parçaları ile sık sık diğer açık fenotipleri neden değil Tuzaklarına telafi etmek2,4. Ayrıca, tuzaklarına birden çok taşıma yolları2' dahil belirli membran füzyon adımları ters yönde kaçakçılığı olaylardan ayırt etmek zordur. Tuzaklarına yerelleştirme çalışmalarının mikroskobu yaklaşımlarla, immunolabeling veya floresan muhabir proteinler, genetik fusion kullanarak sorunları muzdarip bu: (i) tuzaklarına bulmak için birden fazla organelleri kez birden çok kaçakçılığı adımları ve (ii) arabuluculuk gibi onların yerelleştirmeler otomatik olarak işlevsel olarak tuzak karmaşık oluşumunda nişanlandıklarını anlamına gelmez. Son olarak, tuzak kompleksleri tuzaklarına birini kullanarak yem ve diğer tuzaklarına hedef olarak immunoprecipitation deneyler kullanılarak belirlenebilir ama bu özel organelleri veya ticaret yolları bu komplekslerin atama izin vermez. Böylece, şu anda, tuzak kompleksleri ile organellar kararlılık görselleştirmek için alternatif hiçbir tekniği yoktur. Ayirt SNARE etkileşimleri kanıtlamak mümkün değil ama sadece varlığı ya da yokluğu co yerelleştirme gösterebilir, immunoprecipitation sadece gösterebilir iken SNARE etkileşimler tüm hücre nüfus ama organelleri atamak değil nerede bunlar etkileşimler meydana gelir.
Bu sınırlamayı aşmak için tuzak kompleksleri organellar çözünürlük ile canlı hücrelerdeki nicel görselleştirme için izin veren bir roman yöntemi son zamanlarda Verboogen ve ark. tarafından geliştirildi 5 bu yöntemi C-ölümcül onların transmembran sarmal erimiş hayalice değiştirdi floresan proteinler ile tuzaklarına çiftlerini ifade üzerinde temel alır. Membran fusion ve CISoluşumu tamamlanmasından sonra-karmaşık tuzak, bu fluorophores C-termini transmembran sarmal, hemen birbirine bitişik. Fluorophores sonra iyi Förster mesafesindedir (genellikle &#60; 5 nm), sonuçlanan FRET yeşil kaymıştır donör fluorophore gelen kırmızı kaymıştır alıcısı fluorophore5,6. Donör fluorophore ve donör ve alıcısı emisyon (ratiometric perde) oranları ölçülebilir alıcısı fluorophore artan bir emisyon Şoklama sonuçlarındaki FRET. Ancak, ratiometric iki farklı molekül arasında perde, Floresans donör ve alıcısı tuzaklarına farklı organelleri ve hücreleri7,8arasında çapraz-hadis ve farklı düzeylerde nedeniyle meydan okuyor. PERDE uyarma ve bir foton emisyon arasındaki zamanı Floresans Lifetime ölçülebilir. Donör fluorophore enerjisini tarafından serbest bırakabilirsiniz Eğer FRET, belirgin bir kısalma Floresans ömür boyu rakip bu işlem sonucu. Bu FLIM7,8tarafından ölçülebilir. Ömür boyu perde perde ratiometric çok daha sağlam Floresans ömür boyu bir fluorophore, içsel bir özelliktir ve onun konsantrasyon için büyük küçük harf duyarlı olarak iki farklı molekül, arasındaki etkileşimler ölçmek için. Ayrıca, FRET yaklaşım nicel, çünkü FRET verimliliğini donör ve alıcısı fluorophores (aslında bir basamak fonksiyonu) arasındaki mesafe altıncı gücüne ters orantılıdır. Bu nedenle, bir çift bileşenli çürüme modeli ile FLIM tarafından kaydedilen Floresans ömür boyu histogramlar yaklaştırarak, FRET-FLIM (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu5' te nişanlı SNARE moleküllerin fraksiyonunun için sağlar.
Son zamanlarda, bu perde-FLIM yöntemi Verboogen vd tarafından kullanıldı SNARE karmaşık oluşumu birincil dendritik hücreler bağışıklık sistemi5görselleştirmek için. Bu patojen bir uyarıcı gelince, dendritik hücreler kendi membran ile özellikle, Qa-tuzak sözdiziminin 4 R-tuzak vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 3 artan bir kompleks eşliğinde ticareti yeniden yönlendirme olduğunu gösterildi Plazma zarı. Bu artan SNARE karmaşık oluşumu büyük olasılıkla İnterlökin-65gibi inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını artmış salgı kapasitesini karşılamak için gereklidir. Bu iletişim kuralı SNARE kompleksleri görselleştirme ve (yarı-) kantitatif ölçüm için FRET-FLIM veri edinimi için deneysel adımları açıklar.Bu nasıl için bütün hücreli Floresans ömür boyu histogramlar SNARE etkileşimlerine belirgin Floresans ömür boyu nicel bir tahmin olarak sonuçlanan mono ve BI üstel çürüme işlevleriyle uygun açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, yaygın olarak kullanılan HeLa hücre örnek olarak kullanılır, ancak yöntem SNARE kompleksleri diğer ökaryotik hücrelerde çalışma için kolayca genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>Plasmid DNA &#039;syntaxin 4-mCitrine&#039;</td><td>Addgene</td><td>ID 92422</td><td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plasmid DNA &#039;VAMP3-mCherry&#039;</td><td>Addgene</td><td>ID 92423</td><td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td></tr><tr><td>Plasmid DNA &#039;syntaxin 3-mCitrine-mCherry&#039;</td><td>Addgene</td><td>ID 92426</td><td>Positive control for maximum achievable FRET.</td></tr><tr><td>Hela cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass bottom dishes&amp;nbsp;</td><td>Willco Wells</td><td>HBST-3522</td><td>Other live cell imaging chambers will work as a substitute</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Greiner Bio-one</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic solution</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Pen/Strep will work as a substitute</td></tr><tr><td>Live cell imaging medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14291DJ</td><td>Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented</td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used</td></tr><tr><td>Pulsed white light laser</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Other pulsed laser sources can also be used</td></tr><tr><td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system</td><td>PicoQuant</td><td>PicoHarp 300</td><td></td></tr><tr><td>PT32ICS conversion software</td><td></td><td></td><td>Available at the &#039;Software&#039;-section of www.membranetrafficking.com</td></tr><tr><td>data analysis software programme capable of deconvolution</td><td>Originlabs</td><td>OriginPro 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity</td><td>Fiji ImageJ</td><td></td><td>Available at the &#039;Software&#039;-section of www.membranetrafficking.com</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker Haemocytometer</td><td>VWR</td><td>630-1541</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun Melsungen&amp;nbsp; AG</td><td>362 3140</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2 mM</td><td>Merck</td><td>108417</td><td>CAS: 60-00-4</td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td>CAS: 72-57-1</td></tr><tr><td>NEON cell electroporation device</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy

Ökaryotik hücrelerde membran füzyon katalizler çözünür N- ethylmaleimide hassas füzyon proteini (NSF) ek protein reseptörü (tuzak) proteinler membran kaçakçılığı için anahtar şunlardır. SNARE proteini aile 36 farklı üyeleri için oluşur. Belirli hücre içi ulaşım yolları böylece özgüllük katkıda 3 ya da 4 SNARE proteinler belirli kümelerini ve membran ticareti sadakat tarafından katalize. Çünkü tuzaklarına birden fazla olması ve işlevleri üst üste çoğu tuzaklarına ile son derece bol ve işlevsel olarak gereksiz, ancak, tuzak proteinlerin hassas işlev eğitim teknik olarak, meydan okuyor. Bu protokol için görselleştirme canlı hücrelerdeki SNARE karmaşık oluşumu için yeni bir yöntem açıklanır. Bu yöntem SNARE protein C-ölümcül floresan proteinler için erimiş ifade üzerinde temel alır ve onların etkileşim Förster rezonans enerji tarafından ölçme transfer (FRET) istihdam Floresans ömür mikroskobu (FLIM) görüntüleme. Floresans ömür boyu histogramlar özellikli bir uygulamasının çürüme yaklaştırarak, FRET-FLIM farklı veziküller (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu kısmını sağlar. Bu iletişim kuralı SNARE karmaşık oluşumu plazma zarı ve endosomal bölmeleri memeli hücre satırları ve birincil bağışıklık hücreleri görselleştirmek için başarıyla uygulandı ve SNARE işlevler diğer organelleri, çalışmaya kolayca genişletilebilir Hayvan, bitki ve mantar hücreleri.

SNARE etkileşimler tarafından FRET-FLIM ölçmek için tahlil mantığı şekil 1' de gösterilen. C-termini soydaş SNARE proteinlerin transmembran sarmal hayalice değiştirdi floresan proteinler (örneğin, mCitrine ve mCherry) bir çift için erimiş. CISoluşumu-hemen birbirine bitişik olmak floresan bu proteinler membran füzyon sonuçlarında üzerine karmaşık tuzak ve YIPRATMAK. Şekil 2 SNARE proteinler fluorescently etiketli ifade HeLa hücreleri temsilcisi confocal görüntüleri gösterir. Bir hücre (alıcısı fluorophore), VAMP3-mCherry ile ifade sözdiziminin 4-mCitrine (donör fluorophore) yanı sıra denetim koşulları sadece sözdiziminin 4-mCitrine yapý (donör sadece; hiçbir perde) ve her iki mCitrine için erimiş sözdiziminin 3 ifade hücre gösterilen ve tandem (maksimal expectable perde) mCherry. Şekil 3 eşlik eden floresan ömür boyu ve ömür boyu histogramlar mono üstel çürüme fonksiyonları (şekil 3A-B) ve BI üstel çürüme işlevleri () ile her pikselin yaklaştırarak oluşturulan FLIM görüntüler gösterir Şekil 3 c - D). şekil 4A bir mikroskop cam arka saçılma tarafından ölçülen bizim ayarlarına IRF gösterir. Şekil 4B-E, temsilcisi Floresans ömür boyu histogramlar tüm cep telefonu ile birlikte uyum eşlik eden FLIM analiz, mono-üstel çürüme işlevleri için eğrileri gösterilmektedir. Şekil 4F bir önde gelen yansıma zirveye çıkan mikroskop kapak cam yüzeye çok yakın yansıma bir deney floresan ömür boyu histogramını gösterir. Şekil 4 g ile BI üstel çürüme işlev sığdırmak temsilcisi ile ömür boyu histogramını gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Şekil 1: tuzak kompleksleri perde tarafından görüntülenmesi için mantığı düzeninin. (A)yapısal model nöronal tuzaklarına (protein veritabanı 3HD717) vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 2 (mavi; R), sözdiziminin 1 (kırmızı; Qa-SNARE) ve SNAP25 (yeşil; her iki bir oyun kurucu ve Qc SNARE motif içerir). C-terminus transmembran heliks sözdiziminin-1, mCitrine (donör fluorophore; protein veritabanı 3DQ118) Birleşik. C-terminus VAMP2 transmembran heliks, mCherry (alıcısı fluorophore; protein veritabanı 2H5Q19) Birleşik. (B) düzeni SNARE perde içinde sonucu membran füzyon aracılık. Membran füzyon oluşumu bir CIStarafından sonra-tuzak karmaşık, tuzaklarına hemen perde içinde kaynaklanan birbirine bitişik. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Şekil 2: ifade SNARE proteinlerin erimiş floresan proteinler için. İlk sütun: donör fluorophore, 516 heyecanlı nm. İkinci sütun: alıcısı fluorophore, 610 heyecanlı nm. (A)donör sadece durumu. Bir HeLa hücre ifade sözdiziminin 4-mCitrine (donör fluorophore; yeşil birleştirmede) temsilcisi confocal görüntüsü. Alıcısı kanal (ikinci sütun) floresan çapraz-talk gösterir. (B) negatif kontrol (FRET). Her iki sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (alıcısı fluorophore; kırmızı mektup birleştirme işleminde) ile ifade bir HeLa hücre temsilcisi confocal görüntüsü. (C) pozitif kontrolü (maksimal expectable perde). Bir HeLa hücre ifade sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem temsilcisi confocal görüntüsünü oluşturun. MCitrine ve mCherry Floresans sinyalinin değil tamamen örtüşme, mCitrine mCherry için karşılaştırıldığında lizozomal bozulması için daha düşük bir direnç nedeniyle büyük olasılıkla sinyalleri Not (tartışma bölümüne bakın). BF: parlak alan. Ölçek çubukları, 20 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Şekil 3: FLIM görüntüleri SNARE karmaşık oluşumu. (A)temsilcisi Floresans ömür boyu görüntüleri Şekil 2' de gösterilen hücre. Görüntüleri bir TCSPC sistemi (.pt3) tarafından kaydedilen foton izlemeler dönüştürerek PT32ICS yazılımını kullanarak görüntü sitometresi için standart (.ics) oluşturuldu. Tek piksel görüntüleri daha sonra TRI2 yazılım12,13 eşik 15-%100 yoğunluğu, 7 piksel dairesel binning ve monoexponential uygun algoritması (başta) ile kullanarak oluşturulan Floresans ömür boyu donatılmış. Rengi ortalama belirgin floresan ömür boyu gösterir. (B) FLIM görüntüleri nerede Floresans ömür boyu görüntüleri (gösterildiği Masası A) ( Şekil 2' de gösterilen) mCitrine donör fluorophore floresan yoğunluklarda ile kıvrık. Evrişim FIJI özel yapım bir makro kullanarak ImageJ ile gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek). (C) floresan ömür boyu ve sözdiziminin 4-mCitrine ve VAMP3-mCherry A-B panelleri, ama şimdi BI üstel çürüme eğrileri ile uygun ile ifade HeLa hücre FLIM görüntüleri (bkz: ömürleriyle denetim koşulları için; sabit 4,4 inç adım iletişim kuralı). Tahmini kesirler F sözdiziminin 4 kompleks içinde VAMP3 ile piksel rengi belirtir (Denklem 3). (D) aynı panel B olarak ama BI üstel için uygun. Evrişim FIJI özel yapım bir makro kullanarak ImageJ ile gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Şekil 4: tüm cep telefonu FLIM analiz. (A) kurulum aracı yanıt fonksiyonu (IRF). IRF geri saçılma (su içeren bir temiz cam mikroskobu yemek kullanarak) cam-su arabirimi kullanılarak ölçüldü.(B-E) Bütün ömür boyu histogramlar Şekil 2 ve şekil 3' te gösterilen hücrelerin hücre. Tüm fotonlar görüntüleri mevcut havuzlu. Eğrileri ile IRF deconvoluted ve mono-üstel çürüme fonksiyonları (Denklem 1) ile donatılmış. Bu hücreler için 2,82 Floresans yaşam süreleri elde edilmiştir ns (ifade tek sözdiziminin 4-mCitrine; sadece donör; panel B hücreleri), 2.09 ns (sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry ile birlikte ifade hücreleri; Masası C) ve 2.08 ns (hücreleri ifade sözdiziminin 3 - mCitrine-mCherry tandem oluşturmak; maksimal expectable perde kontrolü; Panel D). Dişlerin ama şimdi y ekseni logaritmik ölçekleme ile aynı grafikler gösterirken. Panel E bir bindirme panelleri B-d çürüme eğrilerinin gösterir Bir floresan ömür boyu çubuk grafik örneği (F) mikroskop kapak notu yüzeye çok yakın kaydetti. Bir büyük yansıma tepe (sarı gölgeli alan tarafından tasvir) sonuçlanır. (G) şimdi ile yaşam süreleriyle BI üstel çürüme eğri uydurma ama C, panel gibi (bkz. Adım 4.4 protokolündeki) denetim koşulların sabit. Hızlı (A1) ve yavaş (A2) bileşenlerinin genlikleri 14.42 ve 0,01, sırasıyla, tuzaklarına karmaşık F 0,99 (Denklem 3) tahmini bir kısmını sonuçlanan idi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 1. İşlevi dosya FLIM_convoluted_IRF <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosyası 2. İşlevi dosya FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Membrane Structure and Functions

SCIENTISTS IN ACTION

9.4K Görüntüleme.  Radboud University Medical Center. Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Video: Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Biyomühendislik

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Nörobilim

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles involved in the endo/exocytotic trafficking of solutes and biomolecules. iMSD relies on standard time-lapse imaging, is compatible with any optical setup, and does not need to dwell on single objects to extract trajectories. From each iMSD trace, a unique triplet of average structural and dynamic parameters (i.e., size, local diffusivity, anomalous coefficient) is calculated and combined to build the "iMSD signature" of the nanostructure under study. 
The potency of this approach is proved here with the exemplary case of macropinosomes. These vesicles evolve in time, changing their average size, number, and dynamic properties passing from early to late stages of intracellular trafficking. As a control, insulin secretory granules (ISGs) are used as a reference for subcellular structures that live in a stationary state in which the average structural and dynamic properties of the whole population of objects are invariant in time. The iMSD analysis highlights these peculiar features quantitatively and paves the way to similar applications at the sub-cellular level, both in the physiological and pathological states.

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analysis is applied to macropinosomes to highlight their intrinsic time-evolving nature in terms of structural and dynamic properties. Macropinosomes are then compared to insulin secretory granules (ISGs) as a reference for subcellular structures with time-invariant average structural/dynamic properties.

Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

<meta charset="utf8"></head><body>GFP Etiketli RAB-3 Kullanılarak Canlı C. elegans'ta Aksonal Taşıma Analizinin Geliştirilmesi

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. Consequently, loss of axonal transport impairs neuronal growth and function. Studying axonal transport therefore improves our understanding of neuronal cell biology. With recent improvements in CRISPR Cas9 genome editing, endogenous labeling of axonal cargos has become accessible, enabling to move beyond ectopic expression-based visualization of transport. However, endogenous labeling often comes at the cost of low signal intensity and necessitates optimization strategies to obtain robust data. Here, we describe a protocol to optimize the visualization of axonal transport by discussing acquisition parameters and a bleaching approach to improve the signal of endogenous labeled cargo over diffuse cytoplasmic background. We apply our protocol to optimize the visualization of synaptic vesicle precursors (SVPs) labeled by green fluorescent protein (GFP)-tagged RAB-3 to highlight how fine-tuning acquisition parameters can improve the analysis of endogenously labeled axonal cargo in Caenorhabditis elegans (C. elegans).

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Endojen Aksonal Taşıma Dinamiklerini Görselleştirmek için İleri Teknikler

The paper describes the optimization of fluorescence microscopy acquisition parameters to visualize the axonal transport of endogenous labeled cargos at single-neuron resolution in a living nematode.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...