Yazarlar mali desteği ile University of Southern California, ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI), R00HL124279, Eli ve Edythe geniş inovasyon ödülü ve L.K. Whittier Vakfı sigara kanser kabul etmek istiyorum EJC için verilen translasyonel araştırma ödülü. Yazarlar Merkezi elektron mikroskobu ve Microanalysis, Center of Excellence NanoBiophysics içinde Center of Excellence için moleküler karakterizasyonu ve Translational görüntüleme Merkezi, University of Southern California için yardım için teşekkür ederiz enstrümantal kurulumları.

Not: MSDS reaktifler için okumak ve tüm kimyasal güvenlik önlemleri yerel kurum tarafından gerektiği gibi izleyin.
1. MCP-1 PAMs hazırlanması
<ol><li>
MCP-1 peptid hazırlanması
	<ol>
<li>Fmoc-L-Lys (Boc) 0,25 mmol tartmak-Wang bir reaksiyon gemi (RV) içinde. 5 mL dimethylforamide (DMF) ile RV tarafında kimyasal duman mahallede durulayın.</li>
		<li>RV bir otomatik benchtop peptid synthesizer üzerine yükleyin. Önceden paketlenmiş amino asit şişeleri, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', c N-terminus yükleyin. Vasıl belgili tanımlık son final deprotection adım için boş bir şişe içerir. Not: Şifreli bir peptit dizisi, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', de sentezlenmiş aynı iletişim kuralını kullanarak.</li>
		<li>Sentezi bittiğinde, tüm reçineler transfer edilene kadar peptidler bağlı ölüm mercek şişe 2-3 mL metanol ile aktarın. Sonra reçine altına batırdı, metanol süpernatant çıkarın ve kuru kadar kalan buharlaşır. Vakum kuru bir ek 2 h için ya da gece, oda sıcaklığında.</li>
		<li>Trifluoracetic asit (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % kimyasal duman başlıklı içeren 12 mL bölünme çözüm olun. Eşit olarak karışık emin olmak için bölünme çözüm girdap. Dikkat: triisopropylsilane ve ethanedithiol hava duyarlı olduğundan, argon tasfiye triisopropylsilane ve ethanedithiol onları geri koyarak önce 1 dk. için hisse senedi şişeleri.</li>
		<li>Sentez taşıyıcıyı (SV) altına ZF yarısı sıkma tarafından bir kol shaker koyun. Tüm peptid reçineler transfer edilene kadar peptid-reçine SV 2 mL bölünme çözeltisi ile aktarın.</li>
		<li>Kenarlarına ZF 3 mL bölünme çözüm ile yıkayın. ZF kapağı kapatın ve 300 salınımlarını/dk 4 h için sallamak.</li>
		<li>Bir boş 50 mL santrifüj tüpü çıkarmak tartın. Kayıt kitle.</li>
		<li>4 h sonra 50 mL santrifüj tüpüne ZF i ciddi peptid çözümden drenaj. SV birkaç kez kalan bölünme çözüm ile yıkayın.</li>
		<li>Santrifüj tüpte kalan daha az 4 mL kadar i ciddi peptid çözüm ile azot buharlaşır.</li>
		<li>Buz gibi eter 36 mL peptid i ciddi ekleyin.</li>
		<li>Girdap bu kadar tamamen beyaz veya sarı bir çözümdür. 3000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.</li>
		<li>40 mL buz gibi eter tüp ekleyin. Girdap ve tekrar solüsyon içeren temizleyicide. Santrifüjü işlemi yineleyin. Süpernatant dikkatle boşaltmak.</li>
		<li>Eter gözle görülür buharlaşan kadar azot gaz tasfiye ile ham PA Pelet kuru.</li>
		<li>20 mL çift distile ekleyin su, girdap ve peptid çözümde tamamen eriyene kadar solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>Don eriyik ve kuru kadar lyophilize.</li>
		<li>Bir kez peptid kurutulur, ham peptid içeren santrifüj tüpü kitle tartın. Ham peptid 5 mg/mL suda çözülür.</li>
		<li>Ham MCP-1 peptid toplam konsantrasyonu 5 mg/mL 5 mL çift distile su içinde 25 mg geçiyoruz. %0.1 TFA su (a solvent) ve % 0.1 kullanarak ham MCP-1 peptid yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) tarafından arındırmak TFA Asetonitril (solvent B) bir C8 ters fazlı sütunda mobil aşamaları olarak. Peptid 5 mL HPLC enjekte. Not: A 9.0 mL/dak akış hızında azalma çözücü A yavaş yavaş %30 27 min için ve bu kompozisyon 3 dk. dönüş % 100 solvent degradeye tutmak % 100 solvent ilk mobil faz oluşan bir 3 dk ve bu kompozisyon için vermek 1 dk at tutun bir toplam çalışma-saat 34 dk. tutun sütun sıcaklığı 55 ° C'de Pozitif İyon kaynağı modu analizi için kullanın. TFA HPLC sütun için çok asittir formik asit TFA yerine kullanılabilir. Bu organik çözücü kompozisyon rampa hız 2%/min daha iyi ayrılması için aşmaması gerektiğini tavsiye edilir.</li>
		<li>Beklenen ürün m/z 2,890 adlı için matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma (maldı) kütle spektrometresi kullanılarak her fraksiyonu analiz. Not: α-cyano-4-hydroxycinnamic asit 1 mg/mL Asetonitril/su (50: 50 vol %), matris çözüm olarak geçiyoruz. Matris çözüm her kesir 0,75 µL tarafından takip maldı plaka üzerine 0,75 µL nokta. 500-5000 Da toplu bir mesafeden bir pozitif yansıtıcı iyon modu kullanılarak analiz gerçekleştirmek.</li>
		<li>Ürün kesirler birleştirmek, Asetonitril darbe donma ve arıtılmış peptidler kadar kuru lyophilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MCP-1 PA hazırlanması
	<ol>
<li>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide peptid ayrı mercek şişeleri için 1.1 molar fazlalığı hazırlayın. Her iki bileşikler yapmak için çift distile su içinde erimesi ~ 15 mg/mL. 15 dakika veya her iki çözüm de tamamen berraklaşana kadar solüsyon içeren temizleyicide. Not: Nerede çözüm pH 8,5 için ayarlanır DSPE-PEG (2000)-Amin ve N-hydroxysuccinimide (NHS) ester functionalized Cy5, adım 1.2.3, dışında aynı iletişim kuralını kullanarak DSPE-PEG (2000)-Cy5 sentezlenir.</li>
		<li>DSPE-PEG (2000)-maleimide çözüm peptid ekleyin. Girdap ve solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>1 ekleyin M NaOH dropwise (1 µL) çözüm pH 7 kadar bir zamanda.</li>
		<li>Azot tasfiye çözüm 5 dakika süreyle gecede çözüm karıştırın.</li>
		<li>Don eriyik ve kuru kadar lyophilize.</li>
		<li>Bir kez ham ürün kurutulur, katı 5 mg/mL suda çözülür.</li>
		<li>HPLC ile yukarıda açıklandığı gibi arındırmak. Not: Çekimsiz peptid ve DSPE-PEG(2000) arasında % 15-30 organik konsantrasyonu (vol %), DSPE-PEG elute (2000)-MCP-1 eşlenik % 40-50 arasında organik konsantrasyon elute.</li>
		<li>Karşılık gelen m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1-meli-si olmak geniş m/z tepe 5,760 maldı kütle spektrometresi kullanıyorum her fraksiyonu analiz. Not: 2,5-dihidroksibenzoik asit en iyi matris DSPE-PEG için (2000)-MCP-1 maldı ile kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MCP-1 PAMs Meclisi
	<ol>
<li>Dağıtılması 1,75 mg 3 mL metanol içinde 1-Dramı şişe ile MCP-1 PAs. MCP-1 PA tamamen eriyene kadar solüsyon içeren temizleyicide. Not: Cy5 amphiphiles 10:90 MCP-1 PA görüntüleme uygulamaları için molar oranını, dahil edilebilir.</li>
		<li>Metanol azot dairesel bir hareketle altında tek tip bir film şişe dibinde oluşan kadar şişe yan kalan metanol durulama sırasında buharlaşır. Vakum-Kuru filmin gecede.</li>
		<li>Film 3 mL su veya fosfat tampon ile hidrat serum (PBS) MCP-1 PAMs bir 100 µM çözüm yapmak. Yavaşça girdap ve temiz kadar çözüm solüsyon içeren temizleyicide. 30 dk 80 ° C'de kuluçkaya. Not: Yüksek sıcaklık kendinden montajlı süreci hızlandırmak için gösterilmiştir ve kritik micelle konsantrasyonu (CMC)42,43düşürürken en istikrarlı ikincil yapı oluşturmak peptit bileşeni sağlar.</li>
		<li>Elde edilen dağılımı oda sıcaklığında için ne yapıyorsun?</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MCP-1 PAMs karakterizasyonu
<ol><li>
Dinamik ışık saçılma (DL) ve zeta potansiyel
	<ol>
<li>Yer 100 µM MCP-1 PAM veya DLS veya zeta potansiyel enstrümanın talimatlara göre bir küvet içinde şifreli PAM. Not: DLS ve zeta potansiyel cuvettes gerecin yönergeler bağlı farklı olabilir.</li>
		<li>Oda sıcaklığına enstrüman equilibrate. PAM in yüzey fiyat istemek ve boyutu ölçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
	<ol>
<li>7 µL eklemek 50 µM MCP-1 PAM veya şifreli PAM TEM ızgara üzerine kendi kendine kapanan bir cımbız 5 dk. fitil uzakta içinde damlacık bir hassas görev bezle askıya alındı.</li>
		<li>7 µL kılavuz yıkamak için su ekleyin. Uzak damlacığı fitil.</li>
		<li>1 wt % phosphotungstic asit 2 dk. fitil uzakta için 7 µL damlacığı ekleyin. 2.2.2 arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>TEM kılavuz TEM analiz önce kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dairesel dichroism (CD) spektroskopisi
	<ol>
<li>5-10dk için azot aracı kullanmak için önceden açın.</li>
		<li>Boş (su veya PBS) 300 µL küvet içinde yerleştirin.</li>
		<li>Spectra 190-265 nm, 0.2 mm yol-uzunluğu 1 s entegrasyon zaman ve oda sıcaklığında bir 1 nm bant genişliği ile ölçmek. 3 çoğaltır toplamak.</li>
		<li>Ölçü 100 µM MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, peptid şifreli ve PAM 2.3.3. adımda açıklanan aynı koşul altında şifreli. Boş çıkarma.</li>
		<li>Polylysine temel spectra ürününün bir doğrusal ilişkilendirme kullanarak veri uygun.</li>
		<li>Araç dön. Azot açmadan önce 10 dakika bekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. MCP-1 PAMs Vitro analiz
<ol><li>
Vitro Biyouyumluluk
	<ol>
<li>Kültür ve WEHI 274.1 Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 fetal sığır serum ile (FBS), takıma orta fare monosit genişletin % 1 penisilin-streptomisin ve 37 ° c altında %5 0.05 mM 2-mercaptoethanol CO2 ' ye geçiş 5. Not: WEHI 274.1 hücreler süspansiyon. Ne zaman kültür, medya her 2-3 gün doldurulan.</li>
		<li>Damlalıklı monosit medya steril 50 mL santrifüj tüpü içine. 4 ° C'de 5 min için 300 x g, santrifüj</li>
		<li>Eski medya Aspire edin ve 10 mL taze medyada santrifüj tüpüne resuspend. Hücreler eşit şekilde medyada dağıtılır kadar yavaş yavaş karıştırın. Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
		<li>Böyle medya iyi başına 90 µL başına 4.000 monosit hücreleri oranında seyreltin. Hücre 90 µL 96-şey plaka wells ekleyin. 24 saat kuluçkaya. Not: buharlaşma farklılıkları ve plaka ısı değişiklikleri önlemek için plaka dış kenarında kuyuları kullanmaktan kaçının. Dış kuyu 100 µL PBS ile doldurun.</li>
		<li>MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, şifreli peptid veya 150 µL PBS ayrı, steril microcentrifuge tüpler şifreli PAM 0.15 µmol geçiyoruz. 1, 10 ve 100 µM her örneğinin 65 µL yapmak için seri seyreltme gerçekleştirin.</li>
		<li>10 µL PBS her konsantrasyon WEHI 274.1 içeren wells ekleyin (Toplam birim: şey, 6 satır, 96 toplam kuyu başına 100 µL). 72 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Eklemek 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) her şey içinde. 1s için kuluçkaya.</li>
		<li>490 bir plaka okuyucu kullanarak Absorbans analiz nm veya üreticinin yönergeleri dayalı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vitro micelle bağlama
	<ol>
<li>6-şey plaka 2 ml 100 µM Cy5 etiketli MCP-1 PAM (10:90 molar oranı DSPE-PEG (2000)-Cy5 ve MCP-1 PA) içeren medya her iyi tohum 500.000 monosit. 1s için kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüjü 300 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından WEHI 274.1 toplamak Medya Aspire edin.</li>
		<li>Resuspend ve 2 mL PBS hücrelerde yıkayın. 4 ° C'de 5 min için 300 x g, santrifüj PBS Aspire edin. 2 mL PBS ile yıkama işlemi tekrarlayın. PBS Aspire edin.</li>
		<li>Hücreleri düzeltmek için soğuk % 4 paraformaldehyde 2 mL ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Damlalıklı steril cam coverslip 6-şey plaka kuyu içinde üzerine sabit hücreleri. 400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Paraformaldehyde kaldırın. Yıkama ve durulama 2 mL PBS ile bir kez. 1 mL PB ile resuspend Not: durulama, coverslip hücrelerdeyse engellemeden kaçının.</li>
		<li>% 90 gliserol 10 µL PBS içinde bir slayt koy. Bir iğne ve cımbız coverslip kadar almak için kullanın. Coverslip kenarına kuru. Yavaşça coverslip bir slayt üzerine yerleştirin yüzü koyun.</li>
		<li>Yavaşça kenarına açık oje ile coverslip kapatın. Görüntüleme için hazır kadar buzdolabında yerleştirin.</li>
		<li>Confocal bir lazer lazerler ile Cy5 için λuyarma yüklü mikroskop (CLSM) tarama kullanın = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

MCP-1 PAMs bir hidrofilik hedefleme peptid ve nanoparçacık kendi kendine monte doğası sürücüler hidrofobik kuyruk oluşan bir umut verici moleküler görüntüleme platformu vardır. Bu monosit hedefleme micelle basit sentez ve arıtma adımlardan MCP-1 peptid ve DSPE-PEG (2000)-MCP-1 tarafından hazırlanmış olabilir. PAMs vivo içinde gibi moleküler görüntüleme için birçok yararlı özelliklere sahip kendi kendinden montajlı altında hafif koşulları, iç biodegradability ve yapısal ve kimyas...

Kalp-damar hastalıkları önde gelen yaklaşık 17.3 milyon ölüm dünya çapında1ile tüm dünyada ölüm nedenleri olarak kalır. Kalp-damar hastalıkları ateroskleroz, hangi arterler, böylece inhibe kan ve oksijen akışı vücut2,3hücrelere plaklar inşa bir koşul tarafından katkıda bulunmuştur. Ateroskleroz ilerleme bir enflamatuar yanıt, düzensiz lipid metabolizması ve plak birikmesi, plak rüptürü ve miyokard infarktüsü4,5' e lider tarafından kalınlaşma ve damar sertliği içerir. Endotel hücreleri monosit6,7,8yüzeyinde bulunan C-C Kemokin reseptör (CCR2) bağlar MCP-1 dahil sitokinler ve adezyon molekülleri ifade. Oksitlenmiş kolesterolü monosit makrofaj için hangi bölgede inflamatuar yanıt güçlendirir ve doku yaralanması ve kararsız ya da kolay incinir plaklar9, oluşumuna yol açar plak oluşumu erken aşamasında dönüştürür 10.
Geleneksel olarak, ateroskleroz luminal stenoz anjiyografi veya ultrason11,12kullanarak anatomik görüntüleme tarafından değerlendirilmesi tarafından değerlendirilir. Ancak, bu yöntemler sadece ciddi daralma değil ateroskleroz, erken evre ve atardamar duvarının belirleyebilirsiniz arter arter büyüklüğünü korumak ve akış oranı12,13, kan remodeling ilk plak büyüme neden olur 14. Bu nedenle, Anjiyo ateroskleroz yaygınlık underrepresent. Ayrıca, noninvaziv görüntüleme teknikleri gibi tek foton emisyon tomografi, Pozitron emisyon tomografi ve manyetik rezonans görüntüleme son zamanlarda kullanılan ilk ayrıntıları sağlayabilir plak Morfoloji karakterize hesaplanan ve plaklar karakterizasyonu. Ancak, Bu modalities kez duyarlılık, Uzaysal çözünürlük, eksikliği nedeniyle sınırlıdır veya iyonizan radyasyon, görüntüleme plak ilerleme farklı aşamalarında15,16çok daha zorlu hale kullanımını gerektiren, 17. Özellikle plaklar ateroskleroz farklı aşamalarında tanımlamak görüntüleme bir dağıtım sistemi geliştirilecek kalmaya devam eder.
Nano tanecikleri vivo içinde plak hedefleme ve tanılama18,19,20,21için gelişmekte olan bir platform olmasını göstermiştir. Özellikle, PAMs onların kimyasal çeşitlilik ve moieties, besteleri, boyut, şekil ve yüzey functionalization22çeşitli uyum yeteneği nedeniyle avantajlı. "Bir hidrofobik kuyruğuna olan genellikle lipidler; bağlı bir hidrofilik, peptid headgroup" peptid amphiphiles (PAs) oluşur Bu amfifilik yapı kendi kendine montaj yetenekleri confers ve peptidler parçacık22,23,24yüzeyinde multivalent bir görünümünü sağlar. Peptid headgroups parçacık şekil katlama ve peptidler25arasında hidrojen ile etkileyebilir. β-yapraklık etkileşim yoluyla kat peptidler Helisel α onayı hem küresel ve uzun micelles22,23,24, oluşabilir iken uzun micelles, oluşturmak için gösterilmiştir 25,26,27. Hidrofilik peptid ve sistemik dolaşım28, nanopartikül kullanılabilirliği artırmanın PAMs, hidrofobik kuyruk arasında peptid yüzey ücretten kalkan polietilen glikol (PEG) halkalı yerleştirilebilir 29 , 30 , 31. Biyouyumlu ve çok çeşitli uygulamalar32,33için göstermiştir çünkü PAMs da avantajlı. Micelles su çözünürlük bazı polimerik nano tanecikleri suda çözünür olmayan ve solubilizers enjeksiyonları34için askıya zorunda gibi diğer nanoparçacık tabanlı sistemler üzerinde bir avantaj sunuyor. Ayrıca, belirli uyaranlara yanıt olarak sökmeye PAMs oluşturma yeteneği PAMs kontrollü hücre içi uyuşturucu teslim35için çekici bir aday yapar.
CCR2 reseptör bağlama ve aort içinde biriken, PAMs daha önce monosit aort9aterosklerotik lezyonların farklı aşamaları izlemek için hedefleme için geliştirilmiştir. ApoE- / - fareler monosit birikimi plak ilerleme36için orantılı olarak artar. Ayrıca, bu hastalarda rüptür eğilimli, son aşama plaklar monosit37daha yüksek miktarda içerir bulundu. Bu nedenle, PAMs MCP-1 dahil etmek için değişikliği daha fazla hedefleme özgüllük ve farklılaşma ve geç-aşamasındaki aterosklerotik lezyonları arasında izin veren bir yayın için yararlıdır. Bu kanıtı-of-concept çalışmalar Ayrıca PAMs pre-clinically kullanılmak üzere güvenli ve renally38temizlenir doğrulanmadı. Monosit ve inflamasyon karakteristik diğer hastalıklar için olduğundan, MCP-1 PAMs ateroskleroz8,39,40 ötesinde diğer hastalıkların tedavi ve teşhis uygulamalarında kullanılmak üzere potansiyel var , 41.
Burada, biz son derece ölçeklenebilir ve kendi kendine monte MCP-1 gösterdi parçacığın en uygun boyutu, yüzey ücret ve monosit ateroskleroz'Gelişmiş görüntüleme uygulamaları için seçici hedefleme PAMs imalatı raporu.

<table><tbody><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>10 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes, polypropylene</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>for MALDI</td></tr><tr><td>25 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>5 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>75 cm2 culture flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>75 mL reaction vessel</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>96-wells cell culture plate</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>for MTS assay</td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Borosilicate glass, 1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>for PAM synthesis</td></tr><tr><td>Borosillicate glass pipet, Long tips</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Cy5 amine</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>Diethyl ether, ACS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>for peptide precipitation</td></tr><tr><td>Disposable syringes, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Double neubauer ruled hemocytometer</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) amine</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) maleimide</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS ester&amp;nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>for conjugation to Cy5</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium-high glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Formic acid, optima LC/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Hand tally counter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Magnetic stir bars, egg-shaped</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>Methanol, ACS certified</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>for PAM synthesis</td></tr><tr><td>MTS cell proliferation colorimetric assay kit</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>for MTS assay</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide, sequencing grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>for fixing cells</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Peptide synthesis vessel, 25 mL&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Phosphotungstic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Spectrum</td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Plain glass microscope slide 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Reagent reservoirs, sterile&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Self-closing tweezer</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>TEM support film</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>for peptide cleavage and HPLC purification</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>for peptide cleavage</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Tweezer, general purpose-serrated</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;CRL-1679</td><td>murine monocyte</td></tr><tr><td>automated benchtop peptide synthesizer</td><td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 Benchtop Peptide Synthesizer</td></tr><tr><td>&amp;alpha;- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>for MALDI</td></tr></tbody></table>

synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis

Ateroskleroz hangi 17.3 milyon kişinin hayatına her yıl kalp-damar hastalıkları, dünya çapında, ölüm önde gelen nedenidir için büyük bir katkıda bulunuyor. Ateroskleroz da miyokard infarktüsü, rüptürü ve damar uyarmadan tıkamanın kararsız plaklardan tarafından teşvik ve ani ölüm önde gelen nedenidir. Geçerli görüntüleme yöntemleri rüptürü istikrarlı ve kararsız plaklar arasında ayırt edemez. Özellikle hastalıklı doku için bağlamak moieties hedefleyen çeşitli ile değiştirilebilir gibi peptid amphiphiles micelles (PAMs) bu dezavantaj üstesinden gelebilir. Monosit monosit büyük birikimi rüptürü eğilimli plaklar ile ilişkili olmakla birlikte ateroskleroz, erken işaretler olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, monosit hedefleyebilirsiniz nano tanecikleri ateroskleroz farklı aşamalarında ayırımcılık için kullanılabilir. Bu amaçla, biz burada, monosit hedefleme-PAMs hazırlık için bir protokol tarif (monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs kendinden 15 formu nano tanecikleri için hafif koşullarda sentez yoluyla monte nm ile çapı nötr yüzey şarj yakınındaki. Vitro, PAMs Biyouyumlu bulundu ve monosit için yüksek bağlama ilgi vardı. Burada açıklanan yöntemleri ateroskleroz yanı sıra diğer inflamatuar hastalıklar geniş bir uygulama yelpazesi için umut verici.

MCP-1 PAM hazırlanması MCP-1 protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] veya şifreli peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] CCR2-bağlama motif (artıkları 13-35) N-terminus üzerinde bir sistein kalıntı ekleyerek güncellenmiştir. MCP-1 peptid bir Fmoc-aracılı katı faz yöntemiyle bir otomatik peptid synthesizer kullanarak sentez. Ham peptid ters fazlı HPLC C8 sütun kullanarak %0,1 50 ° C'de tarafından saflaştırıldı TFA Asetonitril/su karışımları ve maldı kütl...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis at JoVE.com

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Bu kağıt malzemelerin ve monosit hedefleme peptid Amfifil micelles içeren bir yöntem sunar ve Biyouyumluluk ve monosit için bağlamak için micelle yeteneğini sınamak için ilgili deneyleri.

Monosit hedefleme peptid Amfifil Micelles için düşsel ateroskleroz sentezi

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

synthesis-monocyte-targeting-peptide-amphiphile-micelles-for-imaging

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Görüntüleme.  University of Southern California. Bu kağıt malzemelerin ve monosit hedefleme peptid Amfifil micelles içeren bir yöntem sunar ve Biyouyumluluk ve monosit için bağlamak için micelle yeteneğini sınamak için ilgili deneyleri.

Video: Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

An example of a nano drug based on polymalic acid is presented towards the rational design of personalized medicine that is applicable to cancer. It describes the synthesis of a nano drug to treat Her2-positive human breast cancer in a nude mouse.

Çoklu Tümör Belirteçleri Hedefleme için Polymalic Asit bazlı Nano Biopolymers: Kişiselleştirilmiş Tıp için Bir Fırsat?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

Kimya

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Biyokimya

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

Küçük Moleküler CLT1 Peptide Hedefli Kontrast Agent ile Prostat Kanseri MR Moleküler Görüntüleme

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Tıp

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

1,2-Dithiolane malzemelerin ve kendi kendine montaj peptidler değiştirilme tarihi

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Altın nanorods İçeren Hücresel Araçların Hazırlama ve foto akustik Analizi

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Biyomühendislik

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Ateroskleroz Hızlı Algılama Demir Oksit Nanopartiküller Mikrodalga odaklı sentezi

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Endotel hedefleme için Functionalized 10-nm polimer kaplı altın parçacıkları ve ilaç dağıtım sentezi

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Preparation and Characterization of Targeted Microbubbles

Targeting of microbubbles (ultrasound contrast agents for molecular imaging) has been researched for more than two decades. However, methods of microbubble preparation and targeting ligand attachment are cumbersome, complicated, and lengthy. Therefore, there is a need to simplify the targeted microbubble preparation procedure to bring it closer to clinical translation. The purpose of this publication is to provide a detailed description and explanation of the steps necessary for targeted microbubble preparation, functional characterization and testing. A sequence of the optimized and simplified procedures is presented for two systems: a biotin-streptavidin targeting pair model, and a cyclic RGD peptide targeting the recombinant &#945;v&#946;3 protein, which is overexpressed on the endothelial lining of the tumor neovasculature.
Here, we show the following: covalent coupling of the targeting ligand to a lipid anchor, assessment of the reagent quality, and tests that confirm the successful completion of the reaction; preparation of the aqueous precursor medium containing microbubble shell components, followed by microbubble preparation via amalgamation; assessment of the efficacy of lipid transfer onto the microbubble stabilizer shell; adjustment of microbubble size distribution by flotation at normal gravity to remove larger microbubbles that might be detrimental for in vivo use; assessment of microbubble size distribution by electrozone sensing; evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a static binding assay test (in an inverted dish); and evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a parallel plate flow chamber test.

The goal of this protocol is to prepare, purify and characterize gas-filled microbubbles (targeted contrast agents for ultrasound molecular imaging). Two targeting systems are described: biotinylated bubbles adherent to streptavidin, and cyclic RGD peptide microbubbles that bind to &#945;v&#946;3, a known tumor neovasculature biomarker.