Yazarlar minnetle Prof. William Muller ve Dr Clare Westhorpe iş geliştirme, önceki yineleme bu modelin içindeki anahtar rolü için kabul. Yazarlar ayrıca monosit sıralama için AMREP Akış Sitometresi çekirdek teşekkür etmek istiyorum alt kümeleri ve Alfred hastane bulaşıcı hastalık birimi klinik araştırma hemşireler bireylerin HIV + bazı çalışmalar için işe alım için. Yazarlar bu çalışmaya katkı Victoria operasyonel altyapı desteği Burnet Enstitüsü tarafından alınan programın minnetle kabul etmiş oluyorsunuz. TAA bir RMIT Üniversitesi-Şansölye Yardımcısı'nın doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. Bu eser NHMRC proje desteği AJ ve AH 1108792 tarafından desteklenmiştir. TK tarafından desteklenmektedir NIH NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124 verir.

Not: tüm deneylerin insan biyolojik örnekler kullanarak Alfred hastane insan Etik Komitesi, Melbourne etik onayı ile gerçekleştirilmiştir. Tüm deneyler sınıf II Biyogüvenlik kabinleri içinde belirtilmediği sürece yapıldı. &#34; Prewarmed &#34; bir waterbath 37 ° C'de ısındı reaktifler başvurduğu.
 1. hazırlık tip ı fibröz kollajen jeller: gün 1 <ol><li>hazırla polimerli kollajen jelleri sırayla ekleme ve 35.7 mM NaOH karıştırma, 0.71 M199, 4,58 mM Asetik asit ve 1,71 mg/mL x tip ı fibröz kollajen 5 mL polistiren tüp başı olarak Tablo 1. 
	Not: hafifçe yukarı ve aşağı 5 kere kollajen oluşumunu durdurmak için pipetting tarafından kollajen iyi karışık olduğundan emin olun &#39; cepler &#39; jel karışımı. 4-6 jelleri sınama koşulu mikroskopi için ücret veya test koşul için Akış Sitometresi başına 15 jelleri hazırlayın.</li>
	<li>Bir kez bir steril düz oturaklı 96-iyi doku kültürü tabak her kuyunun içine karışık, aliquot 50 µL kollajen jel karışımı iyi. Dış satır ve sütun kullanmayın ama 1 200 µL bunlarla doldurmak x Dubecco &#39; s fosfat tamponlu tuz (PBS) kuruma jelleri korumak için. Tabak 37 °C/5% CO 2 polimerize kollajen izin vermek 2 h için kuluçkaya. 
	Not: tabakları doğrudan bile ısı dağılımı sağlamak için kuluçka temiz metal raflar yerleştirin.</li>
	<li>Kuluçka 1 İlave M199 x 150 µL ile jelleri yerleşimi (Tablo malzemeleri görmek) ve 5 gün öncesine kadar kullanım için kuluçkaya.</li>
</ol> 2. Genişletme saklı HUVEC: gün 1 <ol><li>etiket ve kat 10 cm çapında Petri kabına 1 mL 50 µg/mL fibronektin ile 1 x PBS içinde seyreltilmiş ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya</li>
	Cryopreserved birincil insan göbek <li>tezcan aliquots damar endotel hücrelerinde (HUVEC, 1.0 x 10 6 hücreler) 10 mL M20. 
	Not: HUVEC daha önce açıklanan 21 ve düşük geçiş numaradan kullanılan hazırlanmalıdır (&#60; geçiş 4). HUVEC burada insan koroner arter endotel hücreleri ile yerine.</li>
	<li>Resuspend HUVEC 10 mL M20 ve gün 3 medyada yerine aşırı fibronektin ek hücreleri ve kültür için izdiham (yaklaşık 5 gün), önce alıyorum fibronektin kaplı yemek, eklemek.</li>
</ol> 3. HUVEC Monolayer kollajen jeller üzerinde kültür: gün 5 <ol><li>5 günde kültür Petri kabına süpernatant alıyorum ve uzakta yıkama ile serum-Alerjik M199 10 mL serum içeren medya tarafından HUVEC ayırmak.</li>
	<li>5 mL % 0.05 tripsin/0,53 EDTA M199 içinde HUVEC için ekleyip 1-2 dakika kadar hücreleri ayırma hafifçe sallayarak oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Müstakil bir kez hızlı bir şekilde Petri kabına 5 mL M20 ile durulayın ve 10 mL tüp hücrelere içeren medya transfer.</li>
	<li>Santrifüj örnekler 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de süpernatant Aspire edin, M20 200 µL hücrelerde resuspend ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>2.0 10 5 hücre/mL M20 x hücrelere resuspend, 96-şey plaka (Adım 1.3) jeller üzerinde M199 Aspire edin ve resuspended HUVEC (2.0 x 10 4 hücreleri) 100 µL (yukarıdaki adım 1.2) hazırlanan her kollajen jel ekleyin. Daha fazla 3 gün 37 °C/5% CO 2 tabak kültür. 
	Not: HUVEC monolayer bütünlüğünü 3 gün sonra gümüş nitrat 22 veya immünhistokimya sıkı kavşak proteinler 23 bu aşamada boyama tarafından teyit. Ek jelleri bu amaçla hazırlanan.</li>
</ol> 4. HUVEC Monolayer ve yalıtım/monosit hicret için aktivasyonu aktivasyonu: günü 8 <ol><li>doğum günü 8, M20 aspirating tarafından her HUVEC monolayer monosit eklenmesi önce harekete geçirmek jeller overlaying ve 10 ng/mL, 100 µL ekleyerek medya insan TNFα M20 jel başına içinde. 37 °C/5% kuluçkaya CO 2 4 h için 
	Not: Sigara-harekete geçirmek HUVEC koşulları denetimleri gerekirse de içerebilir.</li>
	<li>Sırasında 4 s HUVEC harekete geçirmek adım, ayrı tutulan monosit manyetik kullanarak PBMCs gelen olumsuz hücrelerin üretici göre seçmek için teknikleri boncuk &#39; s yönergeleri. 6,5 x 10 6 PBMCs en az bu adımda monosit genellikle PBMCs yaklaşık % 10-15 hesaba güvenilir bir koşul için gerekli 10 5 monosit x 3.0 kurtarmak amacıyla kullanılmalıdır. 
	Not: monosit etkinleştirme monosit hicret ve köpük hücre oluşumu önce etkisini değerlendirmek için monosit bu aşamada aktif hale getirebilirsiniz. Monosit (Yani, saklı hasta numuneleri) gerekirse çözdürülen PBMCs ayrılmış olabilir. Monosit alt kümeleri FACS sıralayarak izole jelleri (şekil 1) için ek için hazırlıklı ol.</li>
</ol> 5. Birincil insan monosit hicret: gün 8 monosit hicret ölçmek, TNFα içeren medyayı çıkarın ve jelleri iki kez 100 µL ile yıkamak için <ol><li>ekleyip kaldırarak medya M199. Çamaşır, ekleyin 2.0 x 10 taze izole veya çözdürülen ve yıkanmış 5 PBMCs veya 5.0 x 10 4 taze izole monosit cryopreserved veya saf monosit alt kümeleri için 100 µL HUVEC monolayers M20. Monosit ileri hicret jel içine izin vermek için 37 ° C ve % 5 CO 2 1 h için kuluçkaya. 6 kuyular muayene deneysel her koşul için izin vermek en iyisi. 
	Not: hicret ve köpük hücre oluşumu Otolog serum etkisini değerlendirmek için ısı inaktive donör serum istenen konsantrasyonu içeren hücreler M20 ile kuluçkaya ve koşulları için havuza alınan insan serumu kontrol ile karşılaştırın. Lökosit monosit dışında bu aşamada eklenebilir. Belirli lipidler/lipid türler (örneğin, HDL, oxHDL) etkisini araştıran, 20-50 µg/mL lipidler içeren serum-Ücretsiz medya ile tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Sonra ileriye doğru hicret s 1 jelleri prewarmed 1 mm EGTA 1 x PBS içinde 100 µL ile iki kez ve bir kez 100 µL ile yıkayarak sigara transmigrated hücreleri toplamak M199 (aynı santrifüj kapasitesi koşulları), aynı her kuyudan supernatants havuzu oluşturma deneysel durum (genellikle 6 kuyu) buz bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içine. 4 ° c, 300 x g 5 min için sigara transmigrated hücreleri santrifüj kapasitesi ve 30 µL 1 x PBS resuspend.</li>
	<li>İleri transmigrated hücreleri belirlemek için süpernatant içinde toplanan hücreleri saymak.</li>
	<li>İleri transmigrated hücre yüzdesi aşağıdaki gibi belirlenir: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq2.jpg" /> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq3.jpg" /></li> <li>yıkanmış kapak 100 µL ile transmigrated hücreleri içeren jeller M20 ve bir daha da 48 h. için kuluçkaya</li>
	<li>Sonra 48 h, süpernatant toplamak ve yıkama sigara transmigrated hücrelerle iki kez 100 µL 1 mM EGTA/PBS toplama ve süpernatant adım 5.2 olduğu gibi her durum Havuzu, prewarmed. 
	Not: Bu hücreler f ters transmigrated hücre fenotip test edilebilirollowing standart Akış Sitometresi protokolleri boyama.</li>
	<li>Hücreleri 4 ° c, 300 x g 5 dk santrifüj kapasitesi ve 30 µL 1 x PBS hücrelerde resuspend. Say hücreleri ve trypan mavi boyama yoluyla canlılık belirlemek.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak ters transmigrated hücreleri yüzdesini belirlemek: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq4.jpg" /> Not: olası ileri hicret olduğu gibi ileri transmigrated hücre toplam sayısı ters hicret daha doğru bir göstergesi verir için muhasebe olacak % 100.</li>
	<li>Her şey için 100 µL % 2 formaldehit (son konsantrasyonu) ekleyerek jelleri mikroskobu göre analiz düzeltmek için kapak levha alüminyum folyo ve analiz kadar 4 ° C'de depolayın. Akış Sitometresi için bu aşamada hücreleri tamir etmeyin. Aşağıda iletişim kuralları mikroskobu (Bölüm 6) veya Akış Sitometresi (Bölüm 7) çözümlemesi için bkz:. 
	Uyarı: Toksik ve aşındırıcı formaldehit; kişisel koruyucu donanım (PPE) kullanın. Formaldehit eklerken bakım alınmalıdır, ancak, bu adım bir duman başlıklı kullanılan düşük konsantrasyon nedeniyle gerçekleştirilmesi gerekmez.</li>
</ol> 6. Nefelometri köpük hücreleri ve makrofajlar tarafından mikroskobu (petrol-kırmızı O leke) <ol><li>formaldehit kaldırmak ve jelleri ile 100 µL % 50 (v/v) metanol 5 min için ve sonra 100 µL % 78 (v/v) metanol 15 dakika süreyle yıkayın 
	Not: Laboratuvar tezgah ve değil bir sınıf II Biohazard dolap boyama adımlar gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Leke için (bkz. Tablo reçetesi ayrıntılarını) lipid damlacıkları ekleyerek 100 µL % 0,2 taze hazırlanmış olan tarafından (w/v) yağ-kırmızı O oda sıcaklığında 1 h için.</li>
	<li>%78 (v/v) metanol, alıyorum ve süpernatant her yıkama sonra atarak 100 µL ile jelleri 4 yıkama tarafından Kaldır fazla leke kez</li>
	<li>İçin distile suda 1:10 Giemsa, 15 dk 100 µL ile oda sıcaklığında seyreltilmiş counterstain.</li>
	<li>Giemsa leke Aspire edin ve jelleri bir kez su ile yıka.</li>
	<li>Plaka jelleri ayırmak için dışa doğru jel kenarında karşı karşıya eğim ile 21 G iğne kullanarak wells jant.</li>
	<li>Jeller mikroskop slaytta, bağlayın çift taraflı bant 2,54 cm x 1,5 cm Şeridi'nde iki delik (6.35 mm çap) yumruk. Standart mikroskop yan teybe düzeltmek ve koruyucu kaplama en baştan çıkarmak.
	<ol><li>Ekle bir damla su transferi pipet kullanarak bant delikler için. Cımbız kullanarak, yavaşça jelleri teyp ve boyutu 1,5 cam coverslip ile kapak delik aktarın. Yavaşça teybe uymaları coverslip basın.</li>
	</ol></li> <li>40 X amaç üzerinde ters bir mikroskop kullanarak fark girişim kontrast parlak alan mikroskobu ile inceleyin.
	<ol><li>Bring HUVEC monolayer 40 X odak haline büyütme ve kaydırma &#39; içine &#39; makrofaj köpük hücreleri jel tüm derinliği boyunca sayma jel. Üç farklı alanları mümkün kenar etkileri en aza indirmek için jel kenarından benzer mesafelerde bulunan görüntülemek için yineleyin. Bu jel derinliğidir bölgeler sayım arasında tutarlı sağlayacaktır. 
		Not: jel hücrelerde Puan edinildi olarak köpük hücreleri (içeren hücreleri tanımlanan &#62; 1/3 olarak petrol-kırmızı O onların sitoplazma lekeli lipid damlacıkları) veya makrofajlar içinde 2 h montaj slaytlarda ( Şekil 2). Köpük hücre oluşumu geçirilen hücrelerin toplam sayısına oranla köpük hücre yüzdesi olarak ifade edilir ve muayene 3 alanları bakış medyan sayar koşul, başına 6 jeller için bu nedenle koşul başına 18 ölçümleri ortancası olarak ifade edilir. Tipik bir deney gelen ham hücre sayısı bir örnek Tablo 2 ' de gösterildiği. 
		Not: bir hücre köpük hücre vs makrofaj mikroskobu tarafından sınıflandırma özneldir ve sonuç olarak araştırmacı bağımlı olabilir. Klinik çalışmalarda, uzun bir zaman aralığı içinde deneyler yapıldığı, bu tek bir dedektif tarafından kör gerçekleştirilecek tüm sayım için önemlidir. Köpük hücreleri ve makrofajlar jelleri örnekleri Şekil 2 ' de sağlanan.</li>
	</ol></li></ol> 7. Transmigrated hücreleri tarafından Akış Sitometresi Analizi phenotypically köpük hücreleri ve makrofajlar transendothelial geçiş takip karakterize, 37 ° C prewarmed 1 mg/mL collagenase M199 için seyreltilmiş D 100 µL ekleyerek jelleri sindirmek için <ol><li> Her şey ve 20 dk 37 °C/5% CO 2 için kuluçkaya. 
	Not: 96-şey plakaları doğrudan bile ısı dağılımı sağlamak için kuluçka temiz metal raflar yerleştirin.</li>
	<li>Kuluçka, 200 µL pipet ucu kullanarak jelleri macerate ve bir daha da 20 dk 37 °C/5% CO 2 için kuluçkaya.</li>
	Bir kez tam olarak <li>sindirilmiş, filtre ve havuzu buza, yer kaplama FACS tüpler sindirilir Çoğalt jelleri 35 µm naylon ile mesh ve yıkama bir kez FACS ile yıkayın (malzemelerin tabloya bakın) 4 ° C'de, 300 x g. Resuspend FACS 100 µL hücrelerde yıkama</li>
	<li>Kuluçkaya antikorlar belirli fluorophore Birleşik elde edilen hücrelerle CD45, canlı/ölü hücre işaretçisi ve standart Akış Sitometresi protokolleri kullanarak ilgi yüzey/hücre içi fenotipik veya işlev işaretçileri için. 
	Not: Denetim hazırlamak tüpler uygun fluorophores ve IG tazminat boncuk kullanarak tazminat. Ayıklanan hücreleri, ayrıca cytospinning tarafından ayirt mikroskopi için cam slayta toplanabilir. Alternatif olarak, başarılı bir şekilde Akış Sitometresi Imaging üzerinden değerlendirme için bu iletişim kuralını kullanan hücreleri topladık.</li>
	<li>Akış Sitometresi kullanarak hücreleri elde etmek ve gerektiği gibi tazminat gerçekleştirmek. 
	Not: köpük hücreleri/makrofajlar bireysel nüfus ışık saçılım özelliklerini kullanarak oluşturabilir değil ve büyüklüğü ve şekli oldukça farklı olabilir, liberal ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) gates gösterildiği gibi geçirilen hücrelerin tümünü yakalamak için ayarlamak < güçlü sınıfı "xfig" = > şekil 3A.</li>
	<li>Satın alma, Akış Sitometresi yazılım kullanarak veri çözümlemesi gerçekleştirin. Geçirilen hücrelerini tanımlamak için ilk olarak negatif canlı/ölü işaretleyici şekil 3B ' gösterildiği gibi hücre seçin. Ardından, tek hücreli ayrımcılık SSC-alan vs SSC-yükseklik arsa üzerinde gösterilen hücrelerin etrafındaki sıkı bir kapı oluşturarak gerçekleştirmek.</li>
	<li>Seçin CD45 + hücreleri ve bu makrofajlar/köpük hücreleri olarak geçirilen hücrelerin FSC/SSC mezarlığına mevcut büyük nüfusu kapısı.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Napoli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+streak+formation+occurs+in+human+fetal+aortas+and+is+greatly+enhanced+by+maternal+hypercholesterolemia.+Intimal+accumulation+of+low+density+lipoprotein+and+its+oxidation+precede+monocyte+recruitment+into+early+atherosclerotic+lesions.">Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).</li><li>Woollard, K. J., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+in+atherosclerosis:+subsets+and+functions.">Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.</a> Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foamy+Monocytes+Form+Early+and+Contribute+to+Nascent+Atherosclerosis+in+Mice+With+Hypercholesterolemia.">Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).</li><li>Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very-low+and+low-density+lipoproteins+induce+neutral+lipid+accumulation+and+impair+migration+in+monocyte+subsets.">Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets.</a> Scientific Reports. 6, 20038 (2016).</li><li>Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+foam+cell+formation+in+chronic+inflammatory+disease.">Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease.</a> Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).</li><li>Llodr&#225;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emigration+of+monocyte-derived+cells+from+atherosclerotic+lesions+characterizes+regressive,+but+not+progressive,+plaques.">Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).</li><li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atherosclerosis.">Animal Models of Atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).</li><li>Meir, K. S., Leitersdorf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+in+the+Apolipoprotein+E-Deficient+Mouse.+A+Decade+of+Progress.">Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).</li><li>Hilgendorf, I., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+difference:+Monocyte+Heterogeneity+in+Cardiovascular+Disease.">Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease.</a> Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+Apo+A-I+and+Lower+HDL-C+Levels+Are+Associated+With+Higher+Intermediate+CD14++CD16++Monocyte+Counts+That+Predict+Cardiovascular+Events+in+Chronic+Kidney+Disease.">Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++Monocytes+Independently+Predict+Cardiovascular+Events:+A+Cohort+Study+of+951+Patients+Referred+for+Elective+Coronary+Angiography.">CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046 (2014).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chemotactic+Effect+Of+Mixtures+Of+Antibody+And+Antigen+On+Polymorphonuclear+Leucocytes.">The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li><li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+activation+promotes+foam+cell+formation+by+monocytes+following+transendothelial+migration+in+an+in+vitro+model.">Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model.</a> Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).</li><li>Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidatively+modified+low+density+lipoproteins:+a+potential+role+in+recruitment+and+retention+of+monocyte/macrophages+during+atherogenesis.">Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).</li><li>Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+macrophage+degradation+of+biologically+modified+low+density+lipoprotein.">Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).</li><li>Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+Low-Density+Lipoprotein.">Oxidized Low-Density Lipoprotein.</a> Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).</li><li>Muller, W. A., Weigl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-selective+transendothelial+migration:+dissection+of+the+binding+and+transmigration+phases+by+an+in+vitro+assay.">Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay.</a> J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).</li><li>Maisa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+from+HIV-infected+individuals+show+impaired+cholesterol+efflux+and+increased+foam+cell+formation+after+transendothelial+migration.">Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration.</a> AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).</li><li>Angelovich, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+foam+cell+formation+is+enhanced+in+monocytes+from+older+individuals+by+both+extrinsic+and+intrinsic+mechanisms.">Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms.</a> Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).</li><li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HIV-1+infection+in+vitro+on+transendothelial+migration+by+monocytes+and+monocyte-derived+macrophages.">Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages.</a> J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).</li><li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current.">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).</li><li>M&#252;ller, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Endothelial+Markers+PECAM-1,+vWf,+and+CD34+in+Vivo+and+in+Vitro.">Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro.</a> Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).</li><li>Kelesidis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+impaired+HDL+function+in+HIV-1+infected+compared+to+uninfected+individuals.">Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis.">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li><li>Gacka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+and+atherogenic+activity+of+monocytes+in+Type+2+diabetes.">Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes.</a> J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).</li><li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++CD16++monocytes+and+cardiovascular+outcome+in+patients+with+chronic+kidney+disease.">CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease.</a> Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan protokol monosit hicret ve köpük hücre oluşumu birleştirerek monosit insan klinik tabur, üzerinden atherogenicity değerlendirmek için çok yönlü ve fizyolojik olarak uygun bir yöntem sunar. Bu monosit hicret köpük hücre oluşumu üzerine etkisi dikkate alır ve geriye doğru hicret6 ek olarak içsel ölçüm sağlar gibi bu model köpük hücre oluşumu alternatif yöntemler avantaj sunar eksojen faktörler içinde köpük hücrelerine olgunlaşmaya monosit eğilim...

Monosit hicret tromboz, kontur ve miyokard infarktüsü yol açabilecek aterosklerotik plak gelişiminde çok önemli bir adımdır. Yağlı çizgiler, nerede yatırılan lipid endotel harekete geçirmek katkıda bulunur ve iltihap1yerelleştirilmiş büyük arter için ortamda genellikle mevcut düşük salınım kan akımı sitelerinde üzerinden aterosklerotik plaklar gelişir. Monosit monosit kemotaktik protein (örneğin CCL2) üzerinden yağlı çizgiler bulunan endotel hücrelere işe ve intima2' ye transmigrate. Hicret, monosit köpük hücrede lipit alımı, lipit sentezi, aşağı-kolesterol sızma düzenlenmesi veya yukarıdaki faktörlerin birleşimi sonucu olarak adlandırılan aterojenik, lipid yüklü makrofajlar oluşabilir. Monosit da dolaşımda bulunan lipidler birikir ve muhtemelen hücre köpük hücre oluşumu3,4için predispozan bir 'köpüklü' fenotip var. Köpük hücreleri yağlı çizgiler ve aşamasındaki aterosklerotik plaklar belirleyici özelliği vardır ve onların oluşumu lipid ve inflamatuar aracılar5tarafından etkilenir. Alternatif olarak, monosit tersine çevirmek için yeteneğine sahip arterin intima ve damar sağlığını korumak için oyunculuk böylece lipid kaldırma kan dolaşımına6, içine transmigrate.
Monosit için eğilimi belirlemede damar endotel arasında transmigrate ve form köpük hücreleri intima veya tersine çevirmek için transmigrate, monosit harekete geçirmek artan rolünün anlaşılması için temel bir gereksinimdir ve lipid plak dışarı taşımak aterosklerotik risk. CADs fare modelleri ateroskleroz gibi yağlı çizgi/aterosklerotik plak geliştirme hakkında gerçek zamanlı vivo içinde bilgi elucidating önemlidir. Ancak, bu modeller işleme yetenekleri genellikle böylece diyet (ApoE/Batı tipi beslenme modeli gibi)7,8, köklü değişiklikler ile birleştiğinde bu hayvanların doğal kolesterol bir genetik değişiklik gerektirir, Dolaşımdaki lipid fizyolojik olmayan birikimi inducing hangi sürücü plak gelişim düzeyleri. Bu modeller alaka kolesterol ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) düzeyleri dolaşan artış ile ilişkili olmayan kronik inflamatuar insan koşullara HIV enfeksiyonu gibi sınırlı olabilir. Ayrıca, monosit Biyoloji fareler ve insanlar arasındaki farkları monosit altgrupları ilgili alaka immünolojik sorular test yapmak (ara monosit gibi (CD14++CD16+))9 zor. Bu ara monosit sayar bağımsız olarak kardiyovasküler olaylar10,11tahmin gibi kardiyovasküler hastalık sürüş mekanizmaları okurken önemlidir. Sırayla her iki monosit hicret veya köpük hücre oluşumu izolasyon ölçmek için deneyleri mevcut iken, hiçbir vitro tahlil erken atherogenesis klinik tabur aynı hücrelerden kullanarak hem yönlerini miktarının için doğrulandı. Transwell modelleri sayede hücreler üst odanın içine yüklenir ve genellikle chemoattractant12 ile ortamı içeren bir alt odasına bir gözenekli plastik bariyer veya hücre monolayer arasında transmigrate tarihinde bir Boyden iki-odası sistemi kullanmak , 13. lökosit hicret analiz etmek için yaygın olarak kullanılan iken, bu modeller genellikle transmigrated hücreleri çözümde, geçiş sonuçlanan intima temsil eden bir katman dahil değil ve köpük hücre ölçüm için izin verme oluşumu veya aynı hücre ters hicret. Bunun tersi olarak, köpük hücre oluşumu modellerinin monosit veya hücre oluşumu14köpük için katkıda bulunmak için bilinen endotel harekete geçirmek etkileri transmigratory kaynaklı değişiklikleri için hesap değil. Ayrıca, bu sistemlerin köpük neden hücre oluşumu makrofajlar üzerinden eksojen oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (oxLDL)15,16, bir anahtar uyarıcı konsantrasyonları doyurarak ek hücre kültür tabakaları bana yapıştırılır köpük hücre oluşumu. Bu modelleri kullanılan LDL kez CuSO4 tedavi17, fizyolojik-ilgili işlemler tarafından bu nedenle, bu modelleri kullanarak çalışmalar fizyolojik önemini sorgulamak okside.
Burada biz monosit hicret ve hangi does değil istemek eksojen oxLDL ilavesi köpük hücre oluşumu aynı hücre quantifies bir tahlil böylece daha iyi modelleme monosit köpük hücre oluşumunda rol tanımlamak. Bu model Aslında Profesör William Muller (Northwestern Üniversitesi, Chicago)18tarafından geliştirildi ve daha fazla ex vivo monosit altında sigara aktive izole atherogenicity değerlendirmek için bizim laboratuvar rafine HIV enfeksiyonu19 gibi hastalıkların eşlik yanı sıra20yaşlanma temel inflamatuar koşulları ile koşulları bireylerin bu ateroskleroz riski ile ilişkilidir. Bu model da sağlamak a peron için köpük hücreleri formu20, endotel etkinleştirme tarafından TNF gibi sitokinler köpük hücre oluşumu14 üzerinde etkisi farklı monosit alt kümeleri eğilimi ile ilgili temel biyolojik sorular cevap için ve monosit derinliği gibi göçmen özelliklerini ve Hicret jelleri19hızını. Ayrıca, monosit hicret ve köpük hücre oluşumu standart mikroskobu kullanarak sayısal, hücre görüntüleme yaşamak, monosit atherogenesis rolünü değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlayan sitometresi ve görüntüleme Akış Sitometresi, bu nedenle, akış.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Gel preparation reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-500G</td><td>0.1 M NaOH diluted in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>10x M199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td></td></tr><tr><td>AcCOOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td>20 mM Acetic acid diluted in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>Cultrex Bovine Collagen I</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3442-050-01</td><td>Type I Fibrous Collagen</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>M199 media containing Earle&#039;s salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate.&lt;br/&gt; Media supplemented with 100 &amp;micro;g/mL L-glutamine&amp;nbsp; and 100 U/mL penicillin/streptomycin&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M20</td><td></td><td></td><td>Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum.&lt;br/&gt; Individual lipid species such as LDL can be added to M199.</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.</td></tr><tr><td>Human coronary artery endothelial cells</td><td></td><td></td><td>Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BDH Merck</td><td>10093.5V</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-500G</td><td>Ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0</td></tr><tr><td>0.05% trypsin EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 &amp;micro;g/mL Streptomycin)</td></tr><tr><td>New born calf serum</td><td>Gibco</td><td>16010-142</td><td>New born calf serum: New Zealand origin</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056-1MG</td><td>Fibronectin - 50 &amp;micro;g/mL aliquots prepared and stored</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>0.1% TNF</td><td>Gibco</td><td>PHC3015</td><td>Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 &amp;micro;g/mL aliquots</td></tr><tr><td>Low-density lipoprotein</td><td>Merck Millipore</td><td>LP2-2MG</td><td>Low-density lipoprotein (LDL)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 or 2% formaldehyde</td><td>Polysciences</td><td>4018</td><td>1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>50% and 78% methanol</td><td>Ajax Finechem</td><td>318-2.5L GL</td><td>50% or 78% v/v methanol, diluted with H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>Oil Red O stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Mikro-Glass</td><td>S41104AMK</td><td>Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)</td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>MENCS224015GP</td><td>22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips</td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>3M Scotch</td><td>4011</td><td>Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)</td></tr><tr><td>Giemsa stain</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09204.0500</td><td>Giemsa&#039;s azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0)</td></tr><tr><td>Hole punch</td><td></td><td></td><td>Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flow cytometry&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td>Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>35 &amp;micro;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>35 &amp;micro;m nylon mesh capped polystyrene FACS tubes</td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td><td>Life Technologies</td><td>L34959</td><td>Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain</td></tr><tr><td>FACS wash</td><td></td><td></td><td>Prepare by mixing 1 X PBS&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Nunclon</td><td>167008</td><td>Delta surface flat-bottomed 96 well plate</td></tr><tr><td>10 cm Petri Dish</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Sterile 10 cm Petri dish</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>Eppendorf tubes</td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco Scientific</td><td>222-20S</td><td>Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)</td></tr></tbody></table>

quantification of monocyte transmigration and foam cell formation from individuals with chronic inflammatory conditions

Koroner arter hastalığı (CAD) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen nedenidir. Ateroskleroz, önde gelen CAD neden, doğuştan gelen bağışıklık monosit için büyük arter orta atardamar duvarlarında bulunan yağlı çizgiler olarak adlandırılan yatırılan lipid inflamatuvar sitelerine hicret tarafından başlatılır. Ana patojenik lezyonlar ateroskleroz bu erken aşamada köpük hücreleri veya lipid yüklü makrofajlar oluşturmak için damar göç monosit olgunlaşma özelliğidir. Önemli kanıt romatoid artrit ve HIV yanı sıra genel yaşlanma gibi hastalıkların eşlik eden kronik inflamatuar koşulları ateroskleroz riski artar ve bu riski monosit tarafından öngörülmektedir hipotezi destekler harekete geçirmek. Fare modelleri atherogenesis in vivomonosit rolünü araştırmak için iyi bir platform sağlarken, onlar doğal kolesterol metabolizmasının genetik değişiklik ve normal fare diyetler köklü değişiklik gerektirir ve uygunluğu için sınırlı çalışma insan hastalarının hastalıkların aterojenik etkiler. Bu bize ile tanımlanan hastalık durumlarında bireyler izole monosit aterojenik potansiyelini ölçmek için bir insan vitro model geliştirmek için motive. Şu anda, onlar yalıtım monosit hicret ve köpük hücre oluşumu değerlendirmek o insan vitro modelleri sınırlı hale gelir. Burada biz bir protokol hangi tarif monosit hasta kan izole transmigrate insan endotel hücreleri arasında bir tip 1 kollajen Matrix'e ve eksojen lipid içinde köpük hücre içine olgun için onların eğilimi ölçülür. Protokol insan monosit HIV enfeksiyonu olan bireyler ve yaşlı bulaşmamış HIV bireyler saf kullanımı için doğrulandı. Bu model çok yönlü ve her iki mikroskobu kullanılarak değerlendirilecek monosit hicret ve köpük hücre oluşumu sağlar veya aterojenik faktörlerin değerlendirilmesi izin yanı sıra Akış Sitometresi serum veya plazma göstermek.

Monosit hicret miktarının
Monosit şekil 1' de açıklandığı gibi modeline eklenir ve altı jeller her koşul için hazırlanır. Monosit donör başına 6 jeller için (Yani, 5.0 x 104 monosit jel 6 jelleri başına 3.0 105 monosit başına donör x =) son hacmi 600 µL gerekli serum/izole lipid içeren M199 medya için resuspended. Hücreleri (<...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions at JoVE.com

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Biz hicret monosit karşısında insan endotel monolayers tarafından ve onların sonraki olgunlaşma köpük hücrelerine ölçmek için bir protokol tanımlamak. Bu farklı hastalık koşullara sahip insanlardan izole monosit aterojenik özelliklerini değerlendirmek için ve bu eğilimi geliştirmek kan faktörleri değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

quantification-monocyte-transmigration-foam-cell-formation-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Görüntüleme.  Burnet Institute. Biz hicret monosit karşısında insan endotel monolayers tarafından ve onların sonraki olgunlaşma köpük hücrelerine ölçmek için bir protokol tanımlamak. Bu farklı hastalık koşullara sahip insanlardan izole monosit aterojenik özelliklerini değerlendirmek için ve bu eğilimi geliştirmek kan faktörleri değerlendirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Video: Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Biyomühendislik

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Tıp

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

İn Vivo Monosit Kemotaktik Aktivitenin Ölçülmesi ve Kan Monosit Türevi Makrofajların Karakterizasyonu

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler