Name: isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Robinson'ın laboratuarında araştırma hücresel stres yanıt Aging-Associated hastalıkları, Köln Üniversitesi, Almanya Köln mükemmellik kümede fon tarafından desteklenmektedir (CECAD; DFG içinde mükemmellik girişimi Alman Federal tarafından finanse edilen ve hükümetlerin devlet) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln servet ve Maria-Pesch Vakfı Üniversitesi Köln, Almanya dan gelen hibe.

patojen S. kullanımıyla ilgili tüm adımları Typhimurium BSL-2 veya daha yüksek biyolojik güvenlik seviye yapılmalıdır. Kültür ve S. kaplama Typhimurium gibi kemik iliği türevi makrofajlar (BMDMs) enfeksiyonu önlemek amacıyla laminar akış başlık altında gerçekleştirilmelidir. S. yalıtım Typhimurium-phagosomes içeren herhangi bir BSL-2 laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir.
 kemik iliği çıkarma fareler makrofajlar içine onun farklılaşma için hayvan refah kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve doğa, Kuzey Ren-Vestfalya Eyalet ajansı tarafından onaylanmış Çevre ve tüketici koruma [Landesamt für Natur, Umwelt ve Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Dosya no: 84-02.05.40.14.082 ve 84-02.04.2015.A443] ve Köln Üniversitesi.
 1. Culturing S. typhimurium <ol><li>Inoculate S. Typhimurium (SL1344 zorlanma) üzerinden 5 mL bakteriyel bir döngü kullanarak beyin kalp infüzyon (BHI) suyu içine bakteriyel bir koloni.</li>
	<li>Bakteriyel süspansiyon bir kuluçka 37 ° C'de gecede sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>19 mL konik bir şişesi BHI suyu içine 1 mL bakteriyel süspansiyon, ertesi gün, transfer ve sallayarak ile bir kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	S. <li>izlemek 600 optik yoğunluk (OD) ölçme tarafından typhimurium büyüme nm (OD 600) bir Spektrofotometre ile. Ölçümler yaklaşık her 30 dk. alınmalıdır</li>
	<li>Ne zaman OD 600 1.0 ulaşır, inkübatör ve transfer 50 mL tüp içine bakteriyel süspansiyon kaldırın. Santrifüj kapasitesi bakteri 5400 x g 15dk için de 4'te ° C.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 10 mL steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) resuspend.</li>
	<li>Vasıl 5400 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 4.9 mL steril PBS bakterilerde resuspend.</li>
</ol> 2. S. typhimurium NHS-Biotin/Streptavidin-Birleşik manyetik boncuklar ile kaplanması <ol><li>10 mg/ml eklemek 100 µL biotin (NHS-Biotin çözünmüş Dimetil sülfoksit, DMSO) çözüm taze hazırlanmış, bakteriyel süspansiyon bağlama önceki adımda hazırlanan. Örneğin, NHS-Biotin 5 mg 0.5 mL steril DMSO içine oranında seyreltin. Mix düzgün tarafından yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting.</li>
	<li>Karışımı beş 1,5 mL tüpler içine split.</li>
	<li>Incubate 2 h üzerinde bir termo (RT) oda sıcaklığında sabit 350 rpm'de sallayarak ile için.</li>
	<li>RT, 10 dak için 15.000 x g, tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
	<li>1 ml steril PBS, RT, 10 min için 15.000 x g, santrifüj resuspend ve süpernatant atın.</li>
	<li>Tekrar adım 2.5 iki kez daha çözüm bağlama fazlalığı biyotin tamamen çıkarmak.</li>
	<li>Sonra son yıkama, pelet 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>10 mg/mL manyetik boncuklar streptavidin Birleşik çözüm 1.5 mL tüp içine 100 µL transfer ve 5 dakika süreyle manyetik rafta bırakın</li>
	<li>Solvent bir pipet ile kaldırmak, streptavidin-Birleşik manyetik boncuklar çözüm manyetik raf almak ve 1 mL 2.7 adımda hazırlanan biotin kaplı-bakteriyel süspansiyon ile resuspend.</li>
	<li>Sürekli 350 rpm'de sallayarak ile 1s için RT, bir termo üzerinde Incubate.</li>
	<li>Çözüm manyetik raf yerleştirin; için 5 dakika bekleyin ve sonra bir pipet ile duvara uygun değil bakteri kaldırın (olarak etiketlenmiş bir tüp devam &#34; sigara kaplı bakteri &#34;). Tüp mıknatıs ile temas duvarına kalarak kesir biotin/streptavidin-kaplı bakteri olduğunu.</li>
	<li>Manyetik raf etiketli bakteri içeren tüpü çıkarması ve 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>Tekrar manyetik rafına yerleştirmek için 5 dakika bekleyin ve PBS kaldırmak için bir pipet kullanın.</li>
	<li>Adımları yineleyin 2,13 ve 2.14 iki kez daha streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplı değil tüm bakteriler kaldırmak için.</li>
	<li>Son yıkama sonra kaplı bakteri steril PBS 500 µL içinde resuspend ve tüp olarak etiket &#34; kaplı bakteri &#34;.</li>
	<li>Saymak birimleri (cfu) her iki oluşturan colony &#34; sigara kaplı bakteri &#34; ve &#34; kaplı bakteri &#34; tarafından BHI agar plakalar üzerinde seri dilutions kaplama çözümleri. Yaklaşık 2 x 10 8 cfu/mL kaplı-bakteri gelen ilk bakteriyel süspansiyon 20 mL OD 600 1.0 ile elde edilir. Ertesi gün makrofajlar bulaştırmak için kullanılmak üzere 4 ° C kaplı-bakteriyel süspansiyon devam.</li>
</ol> 3. Enfeksiyon BDMDs <ol><li>ne zaman bakteri kaplı biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile aynı günde tam 6 cm yemekler yemek başına 5 x 10 6 hücre yoğunluğu, farklılaşmış BMDMs 22 plaka.</li>
	<li>Bir sonraki günü kaplı-bakteriyel süspansiyon 5 dak için 15.000 x g, saat 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve % 10 fetal sığır serum ile (FBS) takıma Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta 10 x 10 6 cfu/mL konsantrasyonu resuspend.</li>
	Makrofajlar enfeksiyon (MOI) 10, çokluğu, bulaştırmak için <li>Orta BMDMs kaldırın ve hazırlanan kaplı-bakteriyel süspansiyon 5 mL ekleyin. En iyi MOI her hücre türü ya da izole phagosomes deneysel amacı için değerlendirildi.</li>
	<li>RT 10 dk fagositoz eşitlemek için Incubate.</li>
	<li>Incubate % 5 CO 2 kuluçka fagositoz başlatmak 30 dk 37 ° C'de. Diğer hücre tipleri farklı kuluçka kez bakteri içselleştirilmesi sağlamak için gerektirebilir.</li>
	<li>Bakteri içeren orta gelen yemekler kaldırmak ve sigara içselleştirilmiş bakteri kaldırmak için üç kez RPMI hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>Sonunda sigara phagocytized bakterileri öldürmek için RPMI %10 FBS ve 50 µg/mL viomisin içeren 10 mL ekleyin.</li>
	İstenen saat noktayı kadar <li>37 ° c % 5 CO 2 ile enfekte BMDMs kuluçkaya. İstenen saat noktası deneysel olarak bakteri ve hücre türü kullanılan ve analiz amacı göre belirlenmelidir. S. phagosome-endosome füzyon olaylarda erken çalışma için BMDMs, Typhimurium enfekte bir 30 dk kuluçka önerilir. Daha sonra olayları analiz için phagosomes 2 saat veya 4 h, kuluçka sonra elde edilebilir. Makrofajlar S. ile uzun süreli inkübasyon Typhimurium 24 h ötesinde makrofajlar ölümle sonuçlanır. Phagosome ayıklama muhtemelen biotin molekülleri düşmesine neden olabilir önce hücre içi enfeksiyon genişletilmiş. Ancak, biz kaybı biotin kaplı-bakteri kadar 24 h gözlemleme</li>
</ol> 4. S. yalıtım Typhimurium-Phagosomes içeren <ol><li>hazırla gerekli phagosome hacmi yalıtım arabellek (1 mM, Cytochalasin B bir final için son bir konsantrasyon dithiothreitol (DTT) ekleyerek bir 50 mM borular, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) üretici tarafından önerilen gibi 10 µM ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri konsantrasyon. 
	Not: DTT ve Cytochalasin B phagosome yalıtım arabellek A eklenmesi gerekir her zaman hemen önce kullanmak. Cytochalasin B hücre membran rüptürü kolaylaştırmak sitoiskeleti bozan.</li>
	<li>İstediğiniz zaman gelin, enfekte hücreleri ortamından çıkarmak ve steril PBS için RT. ısındı yıkayın</li>
	<li>Phagosom ekleyin 750 µLe yalıtım çanak A tampon ve buz üzerinde 20 dk kuluçkaya. Farklı hücre sayıları kullanırken, yalıtım arabellek A hacmi orantılı olarak ayarlanması.</li>
	<li>Ekleyin 250 µL phagosome yalıtım arabelleği B (50 mM borular, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM Mannitol ve 68 mM Sükroz). Rock arabellek yemeğin tam yüzey ulaştığından emin olmak için plaka. Farklı hücre sayıları kullanırken, yalıtım arabellek B hacmi orantılı olarak ayarlanması.</li>
	<li>Hücreleri nazikçe bir lastik polis kullanarak kazıma yemek kaldırmak ve önceden soğutulmuş 1,5 mL tüp transfer.</li>
	<li>26 G iğne (bir aspirasyon artı hücre süspansiyon sayısı bir fırlatma bir kez olarak) en az 15 kere 1 mL şırınga kullanarak hücre süspansiyon geçer. Bu BMDMs sitozolik içeriğini serbest bırakmak için yeterli. İğne geçer sayısı her hücre türü için optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Hücre süspansiyon manyetik raf yerleştirin ve 5 dakika bekleyin. Parçacıklardır mıknatıs için bağlı kaplı - S. içeren phagosomes Typhimurium. Süspansiyon hücresel bileşenleri geri kalanı içerir.</li>
	<li>Süspansiyon olarak etiketlenmiş bir 1,5 mL tüp içine transfer &#34; sitozol &#34;.</li>
	<li>İzole phagosomes ile tüp manyetik raf çıkarmak ve onları 1 mL steril PBS resuspend.</li>
	<li>Phagosome süspansiyon manyetik rafına yerleştirmek için 5 dakika bekleyin ve PBS kaldırın.</li>
	<li>Tekrarlama adım 4,9 ve izole S. yıkamayı 4.10 Typhimurium-phagosomes içeren.</li>
	<li>Son olarak PBS kaldırmak ve phagosomes resuspend gerekli arabellek; Örneğin, bir radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek protein analizi için. Yaklaşık 50-200 µg protein hücrelerinin başlangıç tutarı ve enfeksiyon MOI bağlı olarak bu protokol sonrası örnek başına elde edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization.">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758 (2008).</li><li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuolar+ATPases:+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology.">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes:+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium.">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases:+Physiology+and+pathophysiology.">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+Compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li><li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+A+few+bugs+in+the+system.">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li><li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+cathepsins:+From+structure,+function+and+regulation+to+new+frontiers.">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li><li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+MHC+molecules+and+peptide+complexes+appear+in+phagosomes+during+phagocytic+antigen+processing.">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li><li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response.">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li><li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7.">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread.">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outsmarting+the+host:+bacteria+modulating+the+immune+response.">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li><li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane.">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li><li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella:+A+model+for+bacterial+pathogenesis.">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li><li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li><li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium.">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li><li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li><li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes.">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells:+fluorescence+and+electron+microscopy.">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li><li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages.">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li><li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li><li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phagosomal+proteomes:+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes.">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li><li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections.">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li><li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum.">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

S. yalıtım için yeni bir yöntem Typhimurium-phagosomes bakterileri biotin ve streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren burada anlatılan. Hücre zarının nazik bozulma sonra bakteri içeren phagosomes kolayca bir manyetik raf kullanarak elde edilebilir. Gösterdiğimiz bakteri etiketleme iltihap ikna etmek için kapasite patojenin koruyan ve ana hücrenin fagositik özelliğini değiştirmez. Bakteri ve endosome/lysosome bu yöntemle elde edilen phagosomes önemlisi,...

Makrofajlar algılayan, yutmak ve herhangi bir yabancı parçacık mikroorganizmalar bakteri gibi işgal için apoptotik hücreler arasında değişen periferik dokularda mevcut aşağılamak özel fagositik hücreler dolaşmaktadır. Reseptör aracılı yüzey tanıma patojen belirli işaretleri (patojen ilişkili moleküler desen veya PAMPs da bilinir) mikroorganizmalar yüzeyinde yaygın olarak mevcut makrofajlar içinde hücresel membran karmaşık bir yeniden yapılanma başlatmak. sipariş surround ve patojen1işbirliği için.
Yutulmak patojen sonra phagosome bilinen bir hücre içi vezikül makrofaj tarafından yer alıyor. Diğer veziküller endosomes ve organellerin gibi olaylarla fisyon ve füzyon dizi sayesinde patojen içeren phagosome phagosomal içerik ortadan kaldırılması için gerekli proteinleri bir dizi satın aldı. Bu nedenle, phagosome enzimatik kompozisyon phagosome olgunlaşma2olarak bilinen bu işlem süresince son derece değişkendir.
Fagositoz kısa bir süre sonra karmaşık katmaninin ATPaz (v-ATPaz) Fusion endosomes3phagosome membran dahil multimeric. Bu karmaşık ATP sitozol phagosome4Lümen için gelen pompa proton için kullanır. Phagosome asitleştirme diğer veziküller5 füzyon olaylarla ve pH bağımlı degradative enzimler6çok sayıda aktivasyonu için gereklidir. Phagosome membran üzerinde hızlı bir şekilde monte başka bir multimeric enzimatik karmaşık NADPH-oksidaz (NOX) karmaşık değil. NOX karmaşık NADPH bu phagosome Lümen salgılanan ve bu önemli ölçüde katkı7yutulmak mikroorganizmaların öldürülmesi için Reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için oksitlenir.
Olgunlaşma ilk adımları uyguladığınızda, phagosomes işaretleri genellikle Rab5 ve erken ve geç endosomes v-ATPaz8V0 alt birim ile birlikte sırasıyla Rab7 gibi mevcut. Organellerin ve geç endosomes phagosomes füzyonu phagocytized patojen maruz hydrolytic enzimler cathepsin proteaz, lipaz ve β-galaktozidaz9gibi çok çeşitli sonuçlanır. Lümen asitleştirme da bu enzimlerin aktivasyonu için gereklidir. Örneğin, etkin kısa form üretmek için cathepsin D bölünme pH bağımlı10' dur. Bu enzimler patojen bozulmasına yol açar ve makrofaj MHC kompleksi (MHC) Sınıf II molekülleri bir adaptif immün yanıt11tetiklemek için T hücrelere tarafından sunulan kısa peptidler patojen kaynaklı üretim aracılık.
Bu nedenle, phagosome olgunlaşma doğuştan gelen bağışıklık yanıtı için çok önemlidir ve bağışıklık sisteminin doğuştan gelen ve edinilmiş silah bağlar. Patojenler ortadan kaldırılması phagosome olgunlaşma yukarıda açıklanan sürecinde makrofajlar tarafından üstesinden gelmek için stratejiler geliştirmişlerdir hiç de şaşırtıcı değil. Örneğin, hücre içi bakterilerin Mycobacterium tüberküloz ve Legionella pneumophila inhibe v-ATPaz derleme ve bunun sonucunda Lümen asitleştirme12,13 phagosome olgunlaşma önlemek . Listeria Monositogenez veya Shigella flexneri gibi diğer bakteri sitozol14,15kaçmak için phagosome membran gözenek oluşumu teşvik. Öte yandan Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) phagosome içinde onun çoğaltma16için uygun bir yer haline dönüştürmek için çarpıtma özelliklerini değiştirmek yapabiliyor. Bu yeteneği S. yapar typhimurium patojen-aracılı girişim phagosome olgunlaşma eğitim için çok ilginç bir model.
S. typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve phagosomes17içinde bulunan. Bazı raporlar daha önce o S. tarif var Typhimurium-içeren phagosomes vericiler için hem endosomes hem de organellerin18sunmak ve diğer çalışmalar phagosome-lysosome füzyon S. engelledi bulduk Typhimurium enfeksiyonu19.
Başlangıçta, phagosome olgunlaşma üzerine S. Typhimurium enfeksiyonu ayirt mikroskobu tarafından araştırmış. Bakteri içeren izolasyonu için yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde phagosomes etkin phagosome içerik endosome ve lysosome açısından daha doğru bir çalışma. Bugüne kadar bakteri içeren yalıtımı için kullanılan ana yöntem phagosomes hücre altı ayırma Sükroz adım degradeler18,20olduğunu. Ancak, bu yöntem phagosomes mekanik zarar verebilir, phagosomal bileşenleri (protein ve yağlar) kararlılığını etkileyebilir ve zaman alıcı birden fazla Santrifüjü adımları gerektirir. Ayrıca, bir ultracentrifuge kullanımını gerektirir: her laboratuvar için erişilebilir değil özel ekipman parçası.
Son zamanlarda, yeni bir yaklaşım bakteriyel içeren izolasyonu için uygulanmış olan bakteriyel patojenler biotinylated lipopetide (Lipobiotin) ile etiketlenir phagosomes, çıkarılan manyetik boncuklar21 streptavidin Birleşik kullanarak . Önerdiğimiz alternatif tamamlayıcı bir yöntem bakteriyel yüzey Amin içeren oluştururlar NHS-Biotin ile etiketleme tarafından streptavidin Birleşik manyetik boncuklar tarafından takip. Bu yöntemle elde edilen phagosomes son derece endosome ve lysosome işaretleyicilerini zenginleştirilmiş ve deneyleri, protein analizi omics analiz için geniş bir yelpazesi için kullanılır. Ayrıca, ultracentrifuges gibi özel ekipman gerektirmez. Ayrıca, Santrifüjü adımları ortadan kaldırarak, phagosomes mekanik hasar ve istihdam süreyi önemli ölçüde azalır. Bu yöntem gibi gram-pozitif Staphylococcus aureusda bu el yazması dahil, diğer bakteriler içeren phagosomes yalıtım için kolayca adapte edilebilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren bu basit, düşük maliyetli, ve daha az zaman klasik yalıtım Sükroz tarafından alıcı degrade-ultrasantrifüj son derece oluşturma, bakteri içeren phagosomes zenginleştirilmiş.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL or DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial loop (10&amp;micro;l)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta-actin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab5 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab7 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V0) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V1) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-cathepsin D antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-calnexin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages

Salmonella typhimurium insanlarda mide iltihabı neden olur fakültatif intraselüler bir bakteridir. Lamina propria, S. işgalinden sonra Typhimurium bakteriler hızla tespit ve makrofajlar tarafından phagocytized ve bozulmuş için phagosomes bilinen veziküller içinde bulunan. S. yalıtım Typhimurium-içeren phagosomes yaygın olarak kullanılan çalışma nasıl S. Typhimurium enfeksiyonu bakteriyel bozulma önlemek için phagosome olgunlaşma sürecinin değiştirir. Klasik, yalıtım bakteri içeren phagosomes Sükroz degrade Santrifüjü tarafından gerçekleştirilen. Ancak, bu işlem zaman alır ve özel ekipman ve belirli bir ölçüde beceri gerektirir. Burada açıklanan S. yalıtım için basit ve hızlı bir yöntem olduğunu Typhimurium-makrofajlar üzerinden phagosomes bakterileri biotin streptavidin Birleşik manyetik boncuklar ile kaplama tarafından içeren. Bu yöntemle elde edilen phagosomes deneyleri, protein, metaboliti ve lipid çözümlemesi gibi geniş bir yelpazesi için izole phagosomes kullanımını sağlayan seçtikleri herhangi bir arabellekte askıya alınabilir. Özet olarak, bu yöntem S. yalıtım için Typhimurium-phagosomes içeren belirli, verimli, hızlı, en az ekipman için ve yalıtım Sükroz degrade-ultrasantrifüj tarafından klasik yöntem'den daha çok yönlüdür.

Yalıtım bakteri içeren phagosomes bu iletişim kuralı tarafından bakteri biotinylation bir ilk adım olarak gerektirir. Biz bu nedenle S. etkinliği değerlendirilir Typhimurium biotinylation biotinylated ile enfekte BMDMs confocal mikroskobu analizi tarafından mCherry -S. typhimurium Cy5-Streptavidin ile Etiketlenmiş. Kısaca, BMDMs mCherry -Sbu iletişim kuralıyla açıklandığı gibi bulaşmış. Typhimurium daha önce biot...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages at JoVE.com

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

10.6K Görüntüleme.  University of Cologne. Biz burada Salmonella typhimuriumyalıtım için basit ve hızlı bir yöntem tarif-biotin ve streptavidin bakterilerle kaplama tarafından phagosomes üzerinden makrofajlar içeren.

Video: Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

Patojen Vakuoller saflaştırılması gelen<em&gt; Legionella</em&gt;-Enfekte Fagositler

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Fenotipinin yüksek verim Deneyi<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Derneği, Invasion, ve Makrofagların Çoğaltma

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Fagozomun Kapatma Deneyi&quot; kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize&#39;a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Salmonella Kültürlerinden Bakteriyofajları Ortadan Kaldırmak için Bakteriyel LPS Kullanma

Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures

Bacteriophages, or simply phages, play a vital role in microbial environments, impacting bacterial populations and shaping their evolution and interactions. These organisms are viruses that infect and replicate within bacterial hosts. Phages are ubiquitous on Earth, highly diverse, and very abundant. While bacteriophages have valuable roles in different environments and are a key area of research in microbiology and ecology, their presence can be undesirable in certain industrial processes or products. Considering the abundance and ubiquity of bacteriophages on Earth, the design of procedures for the removal of bacteriophages from bacterial cultures is crucial in diverse laboratory and industrial applications to preserve the integrity of the cultures and ensure accurate experimental results or product quality. Here, we have fine-tuned a protocol to eliminate the bacteriophages from infected Salmonella enterica cultures, using a strategy based on the use of lipopolysaccharides (LPS) located in the outer membrane of Gram-negative bacteria. Bacterial LPS plays an important role in host recognition by phages, and we make use of this property to design an effective procedure for the removal of phages, which use LPS as a receptor, in Salmonella bacterial cultures.

Yazar Spotlight: Lipopolisakkaritler Kullanarak Enfekte Salmonella Kültürlerinden Bakteriyofajların Verimli Bir Şekilde Ortadan Kaldırılması

Bacteriophages, ubiquitous and diverse on Earth, infect and replicate within bacterial hosts, playing a crucial role in microbial ecosystems. Despite their importance, their presence may disrupt industrial processes. We have developed a method using bacterial lipopolysaccharides to eliminate bacteriophages from Salmonella cultures.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yetişkin Karaciğer Hücrelerinin Karma İlköğretim Kültürler Makrofajlar yalıtın Basit ve Etkin Yöntem

Patojen Vakuoller saflaştırılması gelen

Fenotipinin yüksek verim Deneyi

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu

"Fagozomun Kapatma Deneyi" kullanma Üç Boyutta fagozomun Formasyonu Visualize'a Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM)

Farelerde Salmonella Typhimurium ile İndüklenen Septik Peritonitin Karakterizasyonu

Enfekte Salmonella Kültürlerinden Bakteriyofaj Giderimi

Enfekte Salmonella Kültürlerinden Bakteriyofaj Giderimi

Enfekte Salmonella Kültürlerinden Bakteriyofaj Giderimi