Yazarlar Chantal Cros yararlı teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma gelen hibe tarafından finanse edildi "Komiserliği à l'Energie Atomique et aux enerji alternatifleri" (URANOs - programı enine de Toxicologie du CEA ve CPRR CEA-AREVA) ve ANR üzerinden (uranyum toksisite: biomineralization çok düzeyli yaklaşım «««işlem) kemik, ANR-16-CE34-0003. Bu eser de CNRS ve güzel Sophia Antipolis Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Uranyl asetat çözüm hazırlanması
<ol><li>Uranyl asetat (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; 85 mg 2 mL 100 mM uranyl asetat çözeltisi hazırlamak için Ekle M 424 g.mol-1=) 5 mL plastik tüp için sağlam durumda.</li>
	<li>Plastik tüp 2 mL distile su ekleyin ve plastik bir tıpa ile uygun.</li>
	<li>Tüp katı toplam dağılmasına kadar şiddetle çalkalanır. Çözüm 24 h için buzdolabına koyun. Dikkat: Uranyl [U(VI)] manipülasyonu bazı kimyasal ve radyolojik tehlike sunar. Tüm örneklerini hazırlanan ve belirli laboratuarlarında özel ekipman ile karakterize. Tüm U VI içeren sıvılar ve özel olarak atanan atık kaplarda toplanan olmalıdır zehirli atık bertaraf. Kuru atık (pipets, tüpler, vb) 0.1 N HNO3 çözüm ile solubilize ve U(VI) kaldırmak yıkanmış.</li>
	<li>Bir elektrot ve pH-metre kullanarak çözüm pH doğrulayın. Not: Elektrot daha önce ticari tampon çözeltiler kullanarak ayarlanması (pH = 4 ve pH = 7).</li>
</ol>2. ham 264.7 hücre kültürü
<ol><li>
Bakım hücre.
	<ol>
<li>75 cm2 şişeler aşağıdaki büyüme orta ham 264.7 hücreler (ATCC, TIB-71) yetiştirmek: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %5 Fetal sığır Serum ve antibiyotik ile desteklenmiş: 100 IU/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin. Kuluçka 37 ° c, % 5 CO2hücreleri korumak.</li>
		<li>Orta 2-3 günde değiştirin. Hücreleri % 85-90 birleşmesi olduğunuzda, mekanik bir hücre kazıyıcı (ATCC tarafından önerilen gibi) kullanarak kültür şişeye onları kaldırmak ve 1:6 oranında bölüp. Not: yalnızca hücreleri pasajlar 3 ile 10 arasındaki farklılaşma denemeleri için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deneyler için hücreleri hazırlanması
	<ol>
<li>Yukarıda açıklandığı gibi şişesi substrat hücrelerden çıkarmak ve steril 50 mL tüp aktarabilirsiniz. Hücreleri yukarı ve aşağı kümeleri kırmaya pipetting tarafından karıştırın. Bir hemasitometre ile Sayın. 75 cm2 şişe başına 35-40 milyon hücre bekliyoruz.</li>
		<li>Birim hücre süspansiyon her deneme için gerekli, aşağıdaki gibi hesaplar: Deneysel sayısı x 3 (triplicates) x 1 mL/iyi + 3-4 mL (pipetting zararları) koşulları. Not: Bu protokol için açıklanan tüm deneyleri için yoğunluğu tohum 5000 hücre/cm2' dir. Bu nedenle, bir 24-şey plaka orta 1 mL bir kuyu başına 10.000 hücre anlamına gelir, ve hücre süspansiyon böylece 10.000 hücre/mL yoğunluğudur.</li>
		<li>Gerekli hacmi 10.000 hücre/mL hücre süspansiyon hazırlamak ve hücreleri 24-şey kalıplara temel olarak belirler. Sitotoksisite deneyleri için normal büyüme aracı kullanın. Farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri için en az gerekli orta (2 mM L-glutamin, 5 ile desteklenmiş αMEM) kullanım Alfa değiştiren % FBS ve GST-RANKL1750 ng/mL. Not: GST-RANKL şirket içinde üretilen protein herhangi bir ticari olarak mevcut RANKL sitokin tarafından değiştirilebilir. Yeni bir RANKL toplu işlemi ile çalışırken, 20 ila 150 ng/mL aralığında değişen RANKL konsantrasyon ile bir doz yanıt deney yaparak osteoclastogenesis inducing etkinliğini test etmek yararlı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kültür orta 100 mM Uranyl asetat çözümde seyreltme
Not: Uranyl iyonu [U(VI)] kültür orta onun hücresel toksisite18,19,20,21değiştirebilir orta diğer bileşenleri ile birden fazla kompleksler oluşturur. Bu nedenle, uranyl içeren medya altercations atlama veya denge adımları kısaltmak hazırlanmalıdır.
<ol><li>Pozlama konsantrasyonları uranyl seçti ve kültür (her koşul nüsha gerçekleştirilir dikkate alarak) deney için gerekli ortam birimleri hesaplamak.</li>
	<li>Steril hücre kültüründen başlayarak test % 7.5 sodyum bikarbonat sulu çözüm ([HCO3-] = 893 mM), 100 mM HCO3- çözüm su hazırlamak ve buz üzerinde sakin ol.</li>
	<li>Damla damla 1 birim uranyl asetat 100 mM hisse senedi çözüm buz gibi 100 mM HCO3- çözüm, hafifçe sallayarak karıştırma tüp 9 birimleri için ekleyin. Bu işlem uranyl asetat hisse senedi çözüm seyreltik ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) 10 mm ve pH 7'ye getir.</li>
	<li>Buz gibi 100 mM HCO3- çözüm denetimi hazırlamak için hizmet edecek 90 mM HCO3- (HCO3- konsantrasyonu 10 mM uranyl çözümünde eşit), ulaşmak için 9 birimlerine steril su 1 birim ekleme Orta.</li>
	<li>Denge için (RT) oda sıcaklığında 3 h için durmak hazırlanan çözümleri sağlar.</li>
	<li>Bu arada, temel pozlama orta hazırlamak: 2 mM L-glutamin ve % 5 ile αMEM FBS. Not: farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri için temel pozlama orta GST-RANKL 50 ng/mL ekleyin.</li>
	<li>3 saat sonra uygun miktarda 10 mM uranyl çözüm konsantrasyonları çalışma istenilen uranyl elde etmek için pozlama ortamda damla damla seyreltik. Aynı anda kontrol orta pozlama orta en yoğun uranyl tedavi durumda kullanılan bikarbonat miktarının ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>Denge için RT, 3 h için durmak hazırlanan medya izin.</li>
	<li>Kuyulardan büyüme ortamını çıkarın ve denetimi ve uranyl içeren medya ile değiştirin.</li>
</ol>4. analiz ham 264.7 öncüleri canlılık U(VI) (ÇMT sitotoksik deneyleri) huzurunda
Dikkat: Her iki MTT ve DMSO cilt neden ve tahriş göz. Eldiven ve göz koruma onları ele alırken giymek. Atık ürünler özel olarak atanan atık konteyner içinde toplamak.
<ol><li>Uygun bir miktar 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) toz içinde 5 mg/mL, 10 x hisse senedi çözüm elde etmek için PBS çözülür. 0,22 µm filtrenin filtrasyon tarafından sterilize ve aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>24-şey plakaları (deneysel koşul plaka başına başına 3 Kuyu) plaka hücreleri. Spektrofotometre bulunmasını içeren sorulardan plaka başına 3 boş wells rezerve etmek unutmayın.</li>
	<li>22-24 h önce hücreleri eklemek bildirmek için uranyum pozlama için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Uranyl içeren medya madde 3 te açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Uranyl ile içeren hücre numaralı seribaşı plakaları büyüme orta yerine medya. 24 saat kuluçkaya.</li>
	<li>1 x MTT çözüm gerekli hacmi aşağıdaki gibi hesaplar: (Deneysel koşullar + boşluk sayısı) x 3 (triplicates) x 0.4 mL/iyi + % 10 birim pipetting kayıplar için.</li>
	<li>1 x MTT çözüm gerekli hacmi 10 x hisse senedi MTT çözüm içinde kartal'ın en az gerekli orta (EMEM) fenol red olmadan sulandrarak hazırlayın. Not: başarılı bir Renkölçer tahlil için MTT ışıktan korunmalıdır. Bu arka plan sinyal sınırlamak için MTT EMEM içine DMEM ziyade sulandırmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Kuyulardan uranyl içeren medyayı çıkarın, PBS ile yıka ve 400 µL MTT çözüm (3 boş kuyular için boşluklar da dahil olmak üzere) her şey ekleyin. Karanlıkta 37 ° C'de 2,5 h kuluçkaya. Mikroskop altında koyu mor formazan kristalleri hücrelerin içinde oluşmuş doğrulayın.</li>
	<li>MTT çözüm atın ve dimetil sülfoksit iyi (DMSO) 220 µL ekleyin. Tabak gelen ışık onları korumak ve yavaşça formazan kristalleri çözülmeye 10 dakikadır kışkırtmak alüminyum folyo şal.</li>
	<li>Mikroplaka Spektrometre okuyucu 570, optik yoğunluk (OD) belirlemek için kullanın nm (formazan özel) ve 690 nm (arka plan). Her şey için olası belirsiz OD değer dalgalanma nedeniyle çizik veya bulanıklık22için ayarlamak için 570 nm OD dan 690 nm OD çıkarma.</li>
	<li>Her şey için boş düzeltilmiş OD önceki adımda elde OD dan boş demek OD çıkararak hesaplar. Demek OD değeri deneysel her koşul için belirleyin.</li>
	<li>Ayarla denetim durumu kötü OD ([UO22 +] = 0 mM) için % 100 canlılık ve hücre canlılığı diğer test uranyl konsantrasyonları için karşılık gelen yüzdesini hesaplamak. Bir doz-yanıt eğrisi çizmek. Sitotoksisite dizin 50 (CI50), uranyl konsantrasyonu % 50 hücre ölümüne 24 h maruz kaldıktan sonra lider olarak tanımlanan değerlendirin.</li>
</ol>5. analiz U(VI) huzurunda Osteoklast farklılaşma
<ol><li>
HAM 264.7 farklılaşma hücreleri uranyl ve tuzak varlığında (tartarat-dayanıklı asit fosfataz) boyama.
	<ol>
<li>Plaka ham 264.7 hücreleri deneysel koşul başına 3 Kuyu 24-şey tabakta. Yaklaşık 6 h, 37 ° C'de kuluçkaya hazırlamak ve uranyl içeren pozlama medya equilibrate vakti.</li>
		<li>Farklılaşma medya bölümünde 3 (GST-RANKL ortamına Ekle unutmayın) açıklandığı gibi istenen uranyl konsantrasyonları ile hazırlayın.</li>
		<li>Yavaşça uranyl içeren ile Wells temel orta yerine orta. Bu gün mediatörlerin farklılaşma günü 0 olarak kabul edilir.</li>
		<li>Orta günde 2 veya 3 mediatörlerin farklılaşma 5.1.2 ve 5.1.3 adımları yineleyerek değiştirin. Multinucleated Osteoklastlar 3 ve 4 gün arasında görünmelidir.</li>
		<li>TUZAK üreticinin yönergeleri izleyerek ticari olarak mevcut lökosit asit fosfataz kiti ile boyama gerçekleştirmek. Not: tartarat-asit fosfataz 5, tartarat dayanıklı (ACP5) olarak da adlandırılan dayanıklı asit fosfataz (tuzak) son derece olgun Osteoklastlar dile getirdi ve yoğun Osteoklast farklılaşma avans olarak kullanılan. Bu nedenle, tuzak boyama Osteoklastlar görselleştirmek için gerçekleştirilir. Deneysel koşullar ve osteoclastogenesis hızına bağlı olarak, 4 gün veya gün 5 farklılaşma süreci üzerinde yapılabilir.</li>
		<li>TUZAK lekeli wells (onlar 3 veya 4 hafta kadar bu koşullarda muhafaza edilebilir) daha fazla çözümleme için 4 ° C'de PBS içinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoklast boyutu/Morfoloji analizi.
	<ol>
<li>Her şey bütün yüzeyi görüntüsünü elde etmek. Resmin çözünürlüğünü hücre çekirdeği ayırt etmek için yeterli olmalıdır. TUZAK-pozitif hücreler ile 3 veya daha fazla hücre çekirdeği, Osteoklastlar düşünün.</li>
		<li>ImageJ yazılımında bir şey görüntüsünü açın: "Dosya" → "Aç".</li>
		<li>Görüntünün sol üst köşesinde ölçek birimlerini doğrulayın. Göreli miktar için herhangi bir birimi kullanılabilir. Osteoklast boyutu mutlak değerini gerekli ise, µm için ölçek birimlerini dönüştürün: "Resim" → "özellikleri". Daha sonra tüm resimlere uygulanan yeni ölçek birimler için açılan pencerede "küresel" kutuyu işaretleyin. Not: mikroskop resim alma için kullanıldıysa, düşsel bilgisayar yazılımı her amaç için µm piksel boyutunda gösterilir.</li>
		<li>Çözümlenmesi için ölçüm parametreleri belirtin: "→"ölçümleri ayarla"analiz". Ölçümler ayarla penceresinde "Alan" ve "Etiketi göster" kutuları işaretleyin ve diğerleri uncheck kutuları.</li>
		<li>Yatırım Getirisi (faiz bölgesi) Yöneticisi'ni açın: "→"Araçlar"analiz" → "ROI Yöneticisi".</li>
		<li>Ana penceresinde, dikdörtgen seçim aracını seçin. Yaklaşık 1000 x 1000 µm bir sektör anahat için görüntünün içinde her yerde kullanın. Bu seçim şimdi hangi Osteoklast boyutu analiz edilecek ilk bölge tanımlar.</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde, yörenin ilgi ROI Yöneticisi'ne ekleyin ve "Daha fazla" → "Kaydet" tıklayarak kaydetmek için "Ekle" düğmesini tıklayın. Kaydedilmiş ROI şimdi ROI Yöneticisi her zaman "Daha fazla" → "Aç" ı tıklatarak yeniden yüklenebilir.</li>
		<li>Aygıtlarından 5.2.5 - Osteoklast boyut analizi için 4 ek bölge tanımlamak için 5.2.6 (şekil 2A ve 2D). Not: Tüm görüntüleri boyutlarda Osteoklast çözümlemek için tanımlanmış bölgeleri kullanılacaktır.</li>
		<li>Analiz edilecek 5 bölgelerinden biri bir kopyasını oluşturun: Bu ROI (karşılık gelen seçimi ana görüntü görünür) ROI Yöneticisi ana açmadı → seçimi → "Yinelenen" içinde sağ tıklatın. Bu yinelenen daha ayrıntılı bir çözümleme için kullanın.</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde kutuları "Göstermek Al" l ve "Etiketler" kontrol.</li>
		<li>Ana pencerede bir seçimdeki Osteoklastlar anahatlarını el ile belirlemeniz çokgen seçim aracını seçin. Bu anahat ROI Yöneticisi için "Ekle" ROI Yöneticisi penceresinde tıklatarak ekleyin. Benzer şekilde tamamen seçilen bölge içinde yalan tüm Osteoklastlar için devam (şekil 2B ve 2E).</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde tüm anahatlar seçin ve "Ölçü" tıklayarak onların yüzey ölçmek. Yeni bir pencere (sonuçları penceresi, şekil 2C ve 2F) göründüğü ölçümleri bir e-tabloya aktarmak. Not: Bu noktada, analiz Osteoklastlar anahatları ile bölge bağımsız bir resim olarak kaydedilmiş olabilir: "Dosya" → "Farklı Kaydet" tercih biçimi.</li>
		<li>5.2.8 - 5.2.12'den analiz geçerli görüntünün kalan bölgeler için yineleyin. Sonra tüm diğer resimler için tüm prosedürü tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoklast numara analizi ImageJ yazılımı ile. Not: Osteoklast dağıtım iyi nadiren homojen olduğu gibi bütün iyi yerine birkaç seçilen bölgeler üzerinde sayım gerçekleştirin. Osteoklastlar formu ve boyut, hücre yöntemi sayma Hayır otomatik olarak heterojen verilen uygulanabilir 's.<ol>
<li>Bütün iyi görüntü ImageJ yazılım (çözümlenmek kullanım imge--dan önceki alt bölümde) açın.</li>
		<li>Hücre sayaç penceresini açın: "Eklentiler" → "analiz" → "Hücre Counter". Tıklayın "Başlat" ve "tip 1" onay kutusunu (ya da her türlü sen tercih etmek sayı yazın). "Numarasını göster" onay kutusunun seçili olduğundan ve "Silme modu" kutusunun işaretli olmadığından emin olun.</li>
		<li>Resmin üzerine tıklayın bir Osteoklast: tıklandığında nerede renkli nokta ve bir sayı görünür. Benzer şekilde tüm Osteoklastlar için devam edin. Veri işaretleyicilerini düzenli olarak yanında tıkırtı üstünde "Kaydetmek işaretleri" hücre sayaç penceresinde Kaydet Not: son nokta sayımdan kaldırılacak ise, "Delete" hücre sayaç penceresinde tıklatın. Kaldırmak için birden fazla nokta ise, "Silme modu" kutuyu işaretleyin ve tüm geçersiz yanında tıkırtı üstünde onları gösteriyor. O zaman sayımı devam etmek için "Silme modu" kutunun işaretini kaldırın.</li>
		<li>Hücre sayaç penceresinde sonuçları tıklayarak sayım sonucu görüntüler. Son sayım sonuçları elektronik tabloya aktarmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Osteoklast işlevi U(VI) huzurunda analizi
<ol><li>
Çukur rezorpsiyonu tahlil.
	<ol>
<li>Plaka ham 264.7 hücreleri Osteoklastlar tarafından resorbed bir sentetik inorganik osteomimetic yüzey sağlar bir 24-şey osteo tahlil plaka üzerinde. Not: hücreleri biomimetic yüzeye eklemek amacıyla, bu kez onları farklılaşma orta eklemeden önce gün plaka daha iyi olur.</li>
		<li>HAM 246.7 hücre Osteoklastlar 5 (Adım 5.1.2 - 5.1.4) bölümünde açıklandığı gibi ayırt etmek</li>
		<li>Günü osteoclastogenesis 5, % 10 çamaşır suyu Çözümle uranyl içeren orta değiştirerek kemik mimetic yüzeyden Osteoklastlar kaldırın. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Wells iki kez deiyonize su ile yıkayın ve onlara kuruması.</li>
		<li>Bir % 1 Alizarin Red S sodyum tuz solüsyonu kalsiyum tuzları resorbed olmayan alanlarda leke wells ekleyin. Sonra 10-15 s, kuluçka alizarin çözümü kaldırmak ve yavaşça wells 3 - 4 kez su ile yıkayın. Kuyuları kurumasına izin verin. Not: yukarıda açıklanan boyama yordamı ardışık analiz kolaylaştırmak için resorbed ve resorbed olmayan alanları arasındaki kontrastı artırmak için tasarlanmıştır. Boyama önce kuyu tamamen kuru değilseniz, kalan kemik mimetic yüzey bölümlerini yanlışlıkla kaldırılmış olabilir çünkü bu yordamı dikkatle yapılmalıdır. Alizarin çözüm wells çok uzun süre bırakılırsa, Ayrıca, non-spesifik kalıcı bir boyama-ecek gözükmek. Bu bölümde anlatılan test uranyum etkisi mediatörlerin farklılaşma ve fonksiyonu ilişkili olduğu unutulmamalıdır. Uranyum etkisi rezorpsiyonu Osteoklast oluşumu bağımsız olarak çalışmaya, ham 264.7 hücreleri ile uranyl içeren tedavi edilebilir orta boy olgun Osteoklastlar (gününde 4 ya da 5 farklılaşma süreci) sadece oluşmuş bir kez 24 saat 23.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çukur rezorpsiyonu analizi.
	<ol>
<li>Her şey osteo tahlil plaka tüm yüzeyi görüntüsünü elde etmek. Not: Görüntü edinme yöntemleri değişebilir ancak Çoğalt deneyler tutarlı olmalıdır. Onlar sabit bir kamera, yüksek çözünürlüklü bir tarama veya bir otomatik yüksek işlem hacmi mikroskobu ile yapılan bir mozaik görüntü makro amacı ile çekilen bir resim içerebilir.</li>
		<li>5.2.2-5.2.4'ten önceki bölümdeki adımları yineleyerek çözümlemesi'ni başlatmak.</li>
		<li>RGB görüntüyü gri tonlama 8 bit biçimine dönüştürme: "Resim" → "Yazın" → "8 bit".</li>
		<li>Ana penceresinde, oval seçim aracını seçin. Rezorpsiyonu için analiz edilecek şey tüm yüzeyini özetleyen bir daire çizmek için kullanın.</li>
		<li>Bu yeni yatırım Getirisi olduğu gibi adım 5.2.6 kaydedin.</li>
		<li>Eşik seçimi kolaylaştırmak için tüm özellikleri dışında tanımlanmış ROI temizleyin: "Düzenle" → "Dış açık". Not: Bu noktada, bu kez bir kaç resim kopyalarının yapmak daha iyi olur: ROI seçilen bölge → sağ tıklayın görüntü → "Yinelenen" dışında tıklatarak seçimini kaldırın. Bu eylem bir sonraki adımda seçilen eşik tatmin edici ise yukarıda açıklanan resim tedavi tekrarı önlemek yardımcı olur.</li>
		<li>"Resim" → "Ayarlama" → "eşik" seçin. Eşik penceresinde, uygun bir eşik seçmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Tüm resorbed alanları (beyaz) eşiğin altına olmalıdır ve sigara-, (kırmızı) resorbed. Eşik seçimi sonuçlandırmak için "Uygula" eşik penceresinde tıklatın.</li>
		<li>Son ikili görüntü kaydetmek: "Dosya" → "Farklı Kaydet" → biçimini seçtiğiniz.</li>
		<li>Faiz bölgede alınacak ölçüler tanımlayın: "→"ölçümleri ayarla"analiz". Ölçümleri ayarla penceresinde "Alanı", "Alan kesir" ve "Eşik sınırı" kutuları kontrol edin ve diğerleri işaretini kaldırın.</li>
		<li>"Resorbed" alan sonuçları penceresinde doğrudan kısmını elde etmek için ("→"Ters"Edit") ikili görüntü tersine çevirin. Ana yatırım Getirisi üzerinde son ikili resim seçili olduğundan emin olun (aksi takdirde resorbed alan kesir hesaplanabilir dayalı tüm görüntü penceresinin yüzeyinde). Ölçü resorbed alan kesir yanında ikisinden biri "Ölçü" ROI Yöneticisi penceresinde tıkırtı üstünde ya da "→"Tedbir"analiz". Sonucu kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+profile+for+uranium.">Toxicological profile for uranium.</a> Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).</li><li>Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+early+disposition+of+inhaled+233UO2(NO3)2+and+232UO2(NO3)2+in+the+rat.">Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat.</a> Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).</li><li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual.">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water.">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li><li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+for+the+ICRP's+age-specific+biokinetic+model+for+uranium.">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li><li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+target+organ+for+metals:+the+case+of+f-elements.">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li><li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development.">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li><li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis.">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li><li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton.">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li><li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts.">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li><li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis.">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li><li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line:+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity.">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li><li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling.">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li><li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1,1-bisphosphonate+(EHBP)+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate.">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water.">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li><li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells.">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li><li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+poly(ADP-Ribose)+polymerase-1+and+JunD/Fra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis.">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li><li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium(VI)+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells.">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li><li>Carri&#232;re, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+(NRK-52E)+proximal+cell+cytotoxicity.">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation.">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation.">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li><li>Studzinski, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).</li><li>Gritsaenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+uranium+impairs+the+differentiation+and+the+resorbing+function+of+osteoclasts.">Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).</li><li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL:+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation.">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Bildiğimiz gibi doğal uranyum etkisi kemik hücreleri resorbing çalışmaya yönelik ayrıntılı yönerge açıklanan ilk kez bu. Bu yaklaşım uranyum etkisi kemik fizyolojisi üzerinde daha iyi bir anlayış elde etmek için yararlı olacağını ve uranyum şelatörlerin tarama için ilginç bir yeni bir araç sağlayabilir. Ayrıca, burada açıklanan protokol diğer ağır metaller osteoclatogenesis üzerinde etkisini incelemek için uygulanan olabilir inanıyoruz.
O uranyl complexed ...

Uranyum doğal olarak meydana gelen radyoaktif element toprak, hava ve su mevcut olduğunu; Bu nedenle, insan ve hayvanlar doğal uranyum besinlerinde maruz kalır. Doğal kaynaklara ek olarak, uranyum antropojenik aktiviteler hangi ortamda onun bereket artar kaynaklanır. Uranyum kimyasal ve radyolojik tehlike teşkil etmektedir. (Bu bir izotopik karışımı içeren %99.27 238U, %0,72 235U ve %0,006 234U) doğal uranyum düşük özel etkinlik (25.103 Bq.g-1) olduğundan, ancak, sağlık üzerinde etkileri atfedilir onun kimyasal toksisitesi.
Ne olursa olsun onun giriş rota (inhalasyon, yenmesi veya dermal pozlama), çoğu uranyum, vücut girerek dışkı ile atılır ve yalnızca küçük bir bölümü sistemik dolaşım ulaşır. Uranyum kan yaklaşık % 67 sırayla böbrekler tarafından süzülür ve vücut idrar 24 h1içinde bırakır. Geri kalan, çoğunlukla böbrek ve kemikler, iki ana hedef organlar uranyum toksisite2,3,4yatırılır. İskelet uranyum uzun süreli saklama2,3,4,5,6birincil site belirlenmiştir çünkü çeşitli çalışmalar keşfetmek için yapılmıştır kemik Fizyoloji7uranyum etkisi.
Ömrü sürekli remodeled mineralized doku kemiktir. Kemik remodeling özel hücre tipleri üzerinde bağlıdır ve çoğunlukla iki aşamadan oluşmaktadır karmaşık bir süreç olduğunu: rezorpsiyonu önceden varolan eski Matrix Osteoklastlar tarafından takip de novo kemik İnşaat tarafından dokusunu tarafından. Osteoklastlar nerede onlar8kemik eklemek rezorpsiyonu sitelere göç öncül hücreleri hematopoetik kökenli füzyonu kaynaklanan büyük multinuclear hücrelerdir. Kendi eki aynı anda onların sitoiskeleti9kapsamlı bir yeniden yapılanma ile oluşur. Bu yeniden yapılanma içine Osteoklast salgılar proton, hidroksiapatit ve proteaz bozulması dahil dağılmasına yol açan kemik yüzeyi arasındaki hücre izole bir bölme kurulması için gereklidir Organik matris. Ortaya çıkan bozulma ürünleri endocytosed, membran alanı kemik yüzeyine ters hücreye aracılığıyla taşınan ve salgılanan, transcytosis10,11adı verilen bir işlem.
Vivo ve in vitro çalışmalar sonuçları uranyum kemik oluşumunu engeller ve numarayı ve etkinlik dokusunu7,12değiştirir gösterir. Buna ek olarak, kemik rezorpsiyonu ve Osteoklastlar uranyum etkileri kötü araştırılmalıdır. Çeşitli in vivo çalışmalarda kemik rezorpsiyonu bir donanım, fare ya da sıçan13,14uranyl nitrat yönetimi sonra bildirdin. Ayrıca, bir epidemiyolojik araştırma uranyum alımı içme suyu ile artış erkekler15kemik rezorpsiyonu işaretleyicisinde serum düzeyinde bir artış ile ilişkili olma eğilimi önerdi. Birlikte ele alındığında, bu bulgular kemik içinde biriken uranyum kemik rezorpsiyonu teşvik verebilecek sonuca yol açtı. Ancak, hücresel mekanizmaları uranyum bu potansiyel etkisi içinde yer alan bir açık soru kalır. Bu nedenle, uranyum kemik hücreleri resorbing davranışı üzerinde etkisini incelemeye karar verdik.
Burada, biz biz kurduk Protokolü tarif karakterize ve doğal uranyum etkileri öncesi Osteoklastlar canlılığı, Osteoklastlar farklılaşma ve resorptive etkinliği ölçmek için. Hangi kolayca ne zaman 4 veya 5 gün boyunca sitokin RANKL huzurunda kültürlü Osteoklastlar içine ayırt edebilir ve hangi klasik incelemek için kullanılır ham 264.7 fare dönüştürülmüş makrofaj hücre satırıyla, burada açıklanan deneyler yapmış Osteoklast16farklılaşma ve işlev. Geliştirilen yordamlar güvenilir, vermek son derece tekrarlanabilir sonuçlar ve are için birincil Osteoklastlar tam olarak uygulanabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı bu metodoloji moleküler mekanizmaları kemik uranyum toksisite dahil daha iyi anlaşılmasını almak için yararlı olduğunu düşünüyoruz. Ayrıca, bu yaklaşım yeni uranyum şelat ajanlar tanımlamak için bir tarama aracı olarak adapte olabileceğini düşünüyorum.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>EMEM without phenol red</td><td>Lonza</td><td>12-668E</td><td></td></tr><tr><td>Water for cell culture</td><td>Lonza</td><td>BE17-724F</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;L-Glutamine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>HyClone fetal bovine serum</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>7.5% sodium bicarbonate aqueous solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol.</td><td>Alfa Aeros</td><td>42746</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 well plates</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Conical Tubes 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers 30 cm</td><td>TPP</td><td>90003</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis

Uranyum kemik fizyolojisi ile müdahale için gösterilmiştir ve de bu metal kemik içinde birikir kuruldu. Ancak, az kemik hücreleri davranışını doğal uranyum etkisi hakkında bilinir. Özellikle, uranyum Osteoklastlar, kemik matrisi rezorpsiyonu için sorumlu hücreler üzerinde etkisini belgelenmemiştir. Bu sorunu araştırmaya, uranyl asetat bir kaynak doğal uranyum ve fare ham 264.7 hücre satırı Osteoklast öncüleri bir model olarak kullanarak yeni bir protokol kurduk. Burada, uranyum sitotoksisite Osteoklast öncüleri üzerinde test etmek ve etkisini osteoclastogenesis ve olgun Osteoklastlar resorbing işlevini değerlendirmek için gerekli bütün testleri ayrıntılı. Koşullar biz geliştirdik, özellikle uranyl içeren kültür medya hazırlanması ve ham 264.7 tohum hücreleri güvenilir ve yüksek üreme sonuçları elde etmek için izin vermek. Ayrıca, Osteoklastlar boyutunu veya resorbed matris yüzdesi gibi çeşitli parametrelerin analiz kolaylaştırmak için yazılım araçları kullanımı optimize.

Tartarat dayanıklı asit fosfataz boyama Osteoklastlar 3 veya daha fazla hücre çekirdeği olan büyük mor hücreler olarak görselleştirmek için kullanıldı. Osteoklastlar temsilcisi görüntülerini RANKL huzurunda kültürlü ham 264.7 hücrelerden elde edilen ve uranyl iyonları şekil 1' de gösterilmiştir. Osteoklastlar uranyum yanıt boyutunu ve sayısını değişiklikleri bütün Wells bileşik görüntüler ve büyütülmüş resimler kolayca...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis at JoVE.com

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Uranyum kemik metabolizması etkilediği bilinmektedir. Burada, doğal uranyum pozlama etkisini canlılığı, farklılaşma ve Osteoklastlar, kemik rezorpsiyonu sorumlu hücrelerin fonksiyonlarını araştıran amaçlı bir iletişim kuralı mevcut.

Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

methods-for-analyzing-impacts-natural-uranium-on-vitro

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

8.1K Görüntüleme.  Université Nice Sophia-Antipolis. Uranyum kemik metabolizması etkilediği bilinmektedir. Burada, doğal uranyum pozlama etkisini canlılığı, farklılaşma ve Osteoklastlar, kemik rezorpsiyonu sorumlu hücrelerin fonksiyonlarını araştıran amaçlı bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

Uranyum dan Bakır Oksit Nanopartiküller tarafından İz Elementlerin çıkarılması<em&gt; In Situ</em&gt; Kurtarma Bleed Su ve Hücre Canlılığı Üzerine Etkisi

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

Çevre

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Kanser Araştırmaları

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Gelişim Biyolojisi

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

Bir Roman<em&gt; In vivo</em&gt; Gen Transferi Tekniği ve<em&gt; In vitro</emİskelet Hastalıkları Kemik Kaybı Çalışmaları&gt; Hücre Tabanlı Tahliller

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Tıp

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by osteoclasts in response to different stimuli. Osteoclast precursors differentiate into multinuclear osteoclasts in response to macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL). Under pathologic conditions, the cytokine profile is different and involves a mixture of inflammatory cytokines. Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) is one of the most important cytokines as it is found in large amounts in areas involved with inflammatory osteolysis. The purpose of this protocol is to provide a method by which murine bone marrow is isolated to generate osteoclasts through induction with M-CSF and either RANKL or TNF-&#945; which will be subsequently inhibited by increasing doses of anti-c-fms antibody, the receptor for M-CSF. This experiment highlights the therapeutic value of anti-c-fms antibody in diseases of inflammatory bone resorption.

This protocol includes dissection of murine long bones and bone marrow isolation, to generate bone marrow macrophages and produce osteoclasts using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL) or tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) and their arrest by anti-c-fms antibody, M-CSF receptor.

Osteoklast oluşumu ve hızla çoğalmak-in Vitro Osteoklast habercisi Anti-c-fms antikor etkisi

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Biyoloji

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases (e.g., osteoporosis and bone cancer) and are therefore important objects of research. In vitro, their activity can be analyzed by the formation of resorption pits. In this protocol, we describe a simple pit assay method using calcium phosphate (CaP) coated cell culture plates, which can be easily visualized and quantified. Osteoclast precursors derived from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured on the coated plates in the presence of osteoclastogenic stimuli. After 9 days of incubation, osteoclasts were fixed and stained for fluorescence imaging while the CaP coating was counterstained by calcein. To quantify the resorbed area, the CaP coating on plates was stained with 5% AgNO3 and visualized by brightfield imaging. The resorption pit area was quantified using ImageJ.

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Here, we present a simple and effective assay procedure for resorption pit assays using calcium phosphate coated cell culture plates.

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Resorption Pit Assay: An In Vitro Technique to Quantify Calcium Resorption Activity of Mature Osteoclasts using Calcium Phosphate-Coated Culture Plates

Source: Cen, W., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/64016">A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe an in vitro osteoclastic resorption assay on calcium phosphate-coated cell culture plates cultured with human peripheral blood mononuclear cell-derived osteoclasts. The osteoclasts form a characteristic actin ring on the calcium phosphate-coated matrix of the cell culture plate and degrade the matrix within the actin ring region to release calcium and phosphate ions, resulting in the formation of distinct resorption pits within the degraded matrix.

Rezorpsiyon Çukuru Deneyi: Kalsiyum Fosfat Kaplı Kültür Plakaları Kullanılarak Olgun Osteoklastların Kalsiyum Rezorpsiyon Aktivitesini Ölçmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Source: Cen, W., et al. A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

Tahlil Teknikleri

Hücre bazlı analizler

Effect of the Anti C-fms Antibody on Osteoclastogenesis in Mouse Bone Marrow Cells In Vitro

Source: Marahleh, A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59089">Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we demonstrate the effect of different anti-c-fms antibody concentrations on osteoclastogenesis, which is the process of osteoclast formation from osteoclast progenitors.

Anti C-fms Antikorunun Fare Kemik İliği Hücrelerinde Osteoklastogenez Üzerine Etkisi İn Vitro

Source: Marahleh, A., et al. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. 
...

Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Uranyum dan Bakır Oksit Nanopartiküller tarafından İz Elementlerin çıkarılması