Yazarlar Meng Pan el yazması proofreading için teşekkür ederiz. Bu eser tarafından Singapur Bakanlığı, eğitim akademik araştırma fonu Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) J.Y. için desteklenir; J.Y. Mechanobiology Enstitüsü Singapur'a aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı; Ulusal Araştırma Vakfı, Başbakan'ın Office, Singapur, onun NMG Investigatorship programı (NMK Investigatorship Ödülü No altında NATO Mukabele Gücü-NRFI2016-03 J.Y. için; Temel Araştırma Fonu (2017KFYXJJ153) Merkez üniversitelere H. Y için.

1. hazırlık G4 DNA tek molekül Stretching için <ol><li>hazırla 5 &#39;-etiketli thiol ve 5 &#39;-dsDNA kolları tarafından PCR DDNA polimeraz 5 kullanarak lambda fajının DNA şablonunda kullanarak etiketli biotin &#39;-thiol ve 5 &#39;-biotin astar 14 ( şekil 1). Her iki dsDNA kolları yüksek GC içeriğe sahip (&#62; % 60'ı) DNA önlemek için erime DNA yüksek güçler veya DNA esneme sırasında tutulduğu zaman geçiş 15.</li>
	<li>Arındırmak PCR ürünleri üretici göre BstXI restriksiyon enzimi ile ticari arıtma kit ve Özet kullanarak &#39; s protokolü.</li>
	<li>Ligate G4 şekillendirme ssDNA ve yan ssDNA ve dsDNA tutamaçları T4 DNA ligaz üreticiye göre kullanarak &#39; s protokolü. Üreticiye göre ticari arıtma seti kullanarak jel çıkarma tarafından ve birleştirilmiş ürün arındırmak &#39; s protokolü.</li>
</ol> 2. Akış kanal hazırlanması <ol><li>Coverslip temizlik ve yüzey functionalization <ol><li>yer Cam Kavanoz (her kavanoz tutabilir coverslips, 7 adet boyama alt coverslips (#1.5, 22 mm × 32 mm) ve en iyi coverslips (#1.5, 20 x 20 mm) birim ~ 20 mL). Coverslips 2 - 5 kez kavanoz distile su ile durulama.</li>
		<li>Ekle ~ 20 mL % 5-40 deterjan solüsyonu her kavanoz ve bir ultrasonik Temizleme banyo 30 dk. sonra yerde durulama için distile su ile &#62; deterjan kaldırmak için 10 kez.</li>
		<li>Kuru kavanozlara fırında coverslips (~ 150 ° C; Dikkat, sıcak), veya N 2 gaz tarafından. Kurutulmuş en iyi coverslips kuru bir dolapta saklamak.</li>
		<li>Coverslips 10 dk için kavanoza temizlemek için kullanım plazma (O 2 gaz). 10 dk 20 mL metanol içinde %1 (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) çözeltisi hazırlamak (dikkat, toksik/yanıcı). APTES metanol içinde çözülmeye kimyasal duman başlığı kullan. 
		Not: APTES çözüm saklarken nem kaçının. Eski APTES kez neden olan sorun yüzey coverslips functionalizing içinde.</li>
		<li>Sonra hemen plazma temizlik, tüm % 1 APTES çözüm kavanoz eklemek ve 1 h. dökmek için % 1 APTES metanol için belirli atık şişe içine atık kuluçkaya. Yanıcı kimyasallar için duman başlıklı metanol ile ilgili adımları gerçekleştirin.</li>
		<li>Kavanoz metanol ile durulayın ve &#62; 10 kat ile distile su ve sonra kuru tarafından fırın (~ 150 ° C; Dikkat, sıcak). Kuru bir kabine değilse kullanım için ilâ iki hafta APTES kaplı alt coverslips mağaza. 
		Not: her alt adımından sonra 2.1.1 2.1.4 için temizleme işlemi Sonraki adımdan önce duraklatılmış.</li>
	</ol></li> <li>Araya akışı kanal <ol><li>iki hazırlamak &#34; çubukları &#34;, Yani, parafilm ya da çift taraflı bant (~ 4 mm × 20 mm) her kanal için. Bir alt coverslip uzun kenarı boyunca uzanan çubukları iki adet yerleştirin. En iyi coverslip arasında bir akış hücre şekillendirme spacer üzerinde yer (~ 10 mm × 20 mm alan, şekil 2A , B).</li>
		Parafilm bir yer açıcı kullanılır, <li>akışı kanal bir ısıtıcı (60-120 ° C; koyun. Dikkat, sıcak) iki coverslips birbirine parafilm tarafından destek için en iyi coverslip kenarlarına hafifçe basarken 5-10 s. Elde edilen akışı kanal yüksekliği vardır ~ 100 µm, ve böylece kanal birimdir ~ 20 µL.</li>
		<li>Kaçağı önlemek için silikon yapıştırıcı ile kanal uzun kenarını kapatın. Bir giriş ve bir çıkış çözüm hizmet akışı kanal açık her kenarında küçük bir lavabo gibi yapı yapmak için silikon yapıştırıcı kullanın. 
		Not: Giriş ve çıkış da diğer yolları tarafından örneğin, tarafından yapışan küçük plastik halkalar balmumu kullanarak yapılabilir.</li>
		<li>4 hafta kadar kuru bir dolapta saklamak kanalları.</li>
	</ol></li> <li>Urgan DNA akışı Kanal alt yüzeyinin <ol><li>amino-kaplı polistren boncuk seyreltik (çapı: 3 µm) 200 X distile 1 X tarafından serum fizyolojik (PBS) arabellek fosfat tamponlu. Girdap boncuk çözüm ve sonra akış kanalları içine. Kanallar için boncuk çözümde kuluçkaya ~ 30 dk. kaldırmak herhangi bir ipin ucundaki boncuk 1 X PBS arabellek 200 µL ile yıkayarak.</li>
		<li>Ayarla (artış/50 x 50 mm alan başına 1-5 boncuk yüzey yoğunluğu elde etmek için kuluçka süresi azaltma). Başvuru boncuk ile 3 gün için yatırılır kanalları saklar.</li>
		<li>Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) Siklokekzan-1-karboksilat (Sulfo-SMCC) toz haline 1 X PBS çözüm (~ 0,5 mg/mL). Girdap çözüm ve sonra kanal akışına. 
		Not: kullanmadan önce taze Sulfo SMCC çözüm hazırlamak ve hemen SMCC hydrolyzation önlemek için kanala ekle.</li>
		<li>Incubate 30 dakika süreyle kanaldaki SMCC çözüm SMCC çözüm büyük bir miktar ile yıkayarak kaldırmak (1 mL, ~ 50 kanal birim X) 1 X PBS çözüm. 
		Not: aşırı SMCC dikkatli yıkayın. DNA bağlama üzerinde coverslip için çok önemli bir adımdır.</li>
		<li><ol><li>DNA hayvan zinciri seyreltik bir elde edilen DNA konsantrasyon ile 1 X PBS içine DNA etiketli thiol biotin ~ 0,3 nM. Yavaşça çözüm mix, DNA çözüm SMCC kaplı kanal içine akışı ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya pipet (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>Yavaşça ücretsiz DNA ile 10 mg/mL sığır serum albumin (BSA) ve %0.01 2-Mercaptoethanol ile 1 X PBS içeren çözüm engelleme 200 µL silsin.</li>
		<li>Blok kanal yüzey çözüm (10 mg/mL BSA, %0.01 2-Mercaptoethanol) kapatmaktır kanal kuluçka için &#62; 2 s; Bu adım sonra kanal deneyler için hazır. Hazır kanal-ebilmek saklanmak için 4 ° c ~ 1 gün. 
		Not: Engelleme non-spesifik bağlama DNA ve coverslips için manyetik boncuklar azaltmak için önemli bir adımdır.</li>
	</ol></li></ol> 3. Manyetik cımbız kurulum ve tek kimlik dsDNA urgan <ol><li>manyetik cımbız kurulum <ol><li>Başlangıç manyetik cımbız kontrol programı. Burada, manyetik cımbız bir all-in house yazılı LabVIEW program tarafından kontrol.</li>
		<li>Kanal montaj önce mıknatıs merkezleri hizalayın. X - ve y - ekseni mikroskop optik eksenindeki mıknatıslar ayarlamak için bir 4 X objektif lens kullanın.</li>
		<li>Z-yön ( şekil 2A) boyunca mıknatıslar hareket ve mesafe d ayarlamak için bir bilgisayar kontrollü motorlu manipülatör kullanın = 0 (d: mıknatıslar ve coverslip arasındaki mesafe) ne zaman mıknatıslar eklemek için mikroskop üzerinde bir coverslip.</li>
		<li>Program aracılığıyla kontrol gücünün sabit kuvvet (Yani, sabit d) dahil olmak üzere elde etmek için manipülatör mıknatıslar hareket ve zaman değişen kuvvet F (t) (Yani, zaman değişen d(t )).</li>
		<li>Parlak boncuk amacı ile geri dağınık aydınlatma için bir ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın. 100 Hz örnekleme hızında boncuk görüntüleri şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera. tarafından toplamak < / lBen ></ol></li> <li>tek dsDNA urgan tanımlamak ve kurulum örnek <ol><li>urgan oluşumu <ol><li>yavaşça 200 X akışında M-280, paramagnetic boncuk tahlil çözüm (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 içinde seyreltilmiş ) bir kanal içine. Biotin etiketli DNA molekülleri thiol etiketli sonuna SMCC kaplı yüzeyinde immobilize bağlamak boncuk izin vermek 10 min için kuluçkaya. Hafifçe un gergin boncuk 200 µL standart reaksiyon çözüm kullanarak silsin. 
			Not: M-280 boncuk alt non-spesifik bağlama diğer ticari manyetik boncuklar gibi M-270 göre yüzeye göster.</li>
		</ol></li> <li>Kanal mikroskop Sahne Alanı'na bağlayın. Arama 100 X yağı daldırma amacı istimal alt yüzeyinde boncuk için.</li>
		<li>Bir başvuru boncuk yüzeyi ve hareketli bir hayvan zinciri boncuk seçin. Başvuru boncuk ve farklı odak uçaklar, hayvan zinciri boncuk ilk görüntü kütüphaneler derlenir.</li>
		<li>Boncuk görüntü kalibrasyonu <ol><li>deneyler, daha önce başvuru ve iki ayrı boncuk görüntüsü olarak saklanan 20-50 nm tarafından aralıklı farklı odak uçaklar, hayvan zinciri boncuk görüntüleri elde etmek için bir objektif piezo aktüatör kullanın kütüphaneler ve are sırasıyla odak uzaklığı ( şekil 2B) ile dizine.</li>
		</ol></li> <li>x, y, z konumunu belirleme <ol><li>deneyler sırasında x-y uçak boncuk konumunu tarafından boncuk centroid belirlemek. Hayvan zinciri boncuk yükseklik değişikliği bu kitaplıkta depolanan geçerli boncuk görüntü karşılaştırarak belirle. Fourier dönüşümü boncuk görüntüleri 16 güç spektrumu auto-korelasyon işlevi analizini kullanın.</li>
		</ol></li> <li>Anti-drift geribildirim başvuru boncuk kullanarak <ol><li>deneyler sırasında kullanmak için piezo &#34; kilit &#34; amaç ve düşük frekans üzerinden kitaplığında depolanan belirli boncuk resmin arasındaki mesafe geribildirim kontrol, böylece sıkışmış boncuk görüntü ( 2D rakam) kitaplığında depolanan belirli bir görüntü ile en iyi korelasyon vardır.</li>
		</ol></li> <li>Uygulayarak urgan bir tek dsDNA molekül olup olmadığını belirlemek ~ 65 pN kuvvet belirlemek bir tek dsDNA molekül urgan geçiş 17 , esneme karakteristik DNA geçer 18 , 19. bir tek dsDNA urgan bulunana kadar bu işlemi yineleyin. (Lütfen güç kalibrasyon ve geçiş esneme DNA için sonraki bölüme bakın).</li>
	</ol></li></ol> 4. Manyetik cımbız kalibrasyon zorla <ol><li>doğrudan boncuk dalgalanma ile kullanarak uzun DNA (48,502 bp λ-DNA) molekülleri için kuvvet (ilâ 100 pN) belirler: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg" /> , Boltzmann sabiti k B nerede T sıcaklığı Kelvin ölçekte, δ 2 y boncuk dalgalanma manyetik alan ve kuvvet dik yönde varyansını yön. Bu yönde hareket boncuk l + nerede l uçtan uca mesafe boyunca DNA kuvvet yönünü (uzantısı) ve r 0 r 0, uzunluğu ile bir sarkaç dalgalanması olarak tanımlanabilir boncuk 10 ( şekil 3A) RADIUS.</li>
	<li>Karar vermek için kuvvet F boncuk mesafe mıknatıslar bir fonksiyonu olarak kalibrasyon eğrisi d ve F (d) için farklı boncuk uzun λ-DNA kullanarak. Genellikle, DNA urgan uzunluğu göz ardı edilemez mıknatıs ve coverslip arasındaki mesafe kullanılır. Uygun F-d eğri çift-üstel çürüme işlevi tarafından: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg" /> , nerede uygun parametreleri α1, α2, γ1, γ2 göre belirlenir Manyetik cımbız ve parametre C manyetik boncuklar türdeş olmayan özelliği tarafından belirlenir. C, F değişen tarafından-d eğri farklı boncuk elde-ebilmek var olmak örtüşen 10 ( şekil 3B).</li>
	<li>Kısa DNA için parametre C bireysel manyetik boncuklar için kalibrasyon deneyler.
	<ol><li>Üzerinde dalgalanma temel kuvvet belirleme gerektirir köşe sıklığı yüksek bir frekansta boncuk pozisyon kayıt: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg" /> , γ sürükle nerede boncuk katsayısı. Yüksek güç kısa DNA, 100 Hz daha hızlı kayıt frekans gerektirir, bu nedenle, kuvvet doğrudan fotoğraf makinesi ile dalgalanma üzerinde göre ölçülen olamaz. Ancak, C belirlenen bir düşük güç ölçerek parametre zorla aralığı (&#60; 15 pN) dalgalanma kullanarak ve kalibre edilmiş F verilerle montaj-parametre C 20 elde etmek için d eğri.</li>
		<li>Alternatif olarak, dsDNA ile deneyler için belirlemek parametre C geçiş bir kuvvet, esneme DNA'yı kullanarak ~ 65 pN ( şekil 3 c) 21 , 22 , hangi dsDNA gösterdi uzantısı atlama (kontur uzunluğu uzunluğu artış X 0,6) d konumunda kaydederek, 23. C parametresi belirledikten sonra gergin boncuk için güç hesaplamak.</li>
	</ol></li> <li>Yükleme hızı ters fonksiyon F (d) aracılığıyla mıknatıslar hareket programlama tarafından kontrol. Mıknatıs örnek Çift Kişilik katlanarak erişmeniz gerekir. 
	Not: Böyle bir ekstrapolasyon yöntemi tarafından belirlenen kuvvet göreli hatadır ~ % 10 ve esas olarak boncuk RADIUS heterojenite 20 tarafından neden olur.</li>
</ol> 5. Tek molekül manipülasyon G4 varlığı ve yokluğu bağlayıcı proteinler <ol><li>0.2 pN/s ve ardından yükleme hızında bir kuvvet-artış tarama gerçekleştirmek dsDNA urgan tanımlayan sonra kuvvet rampa deneyler <ol><li>bir -0.2 kuvvet-vefat tarama pN/s. Germe her döngüsü sonra DNA molekülünün 30 1 pN tutmak için G4 refold ssDNA izin vermek için s.</li>
	</ol></li> <li>Kuvvet-atlama deneyler <ol><li>30 54 pN arasında güç döngüsü s altında bir katlanmış G4 gelişeceğini olabilir ve 60s, altında bir katlanmış G4-15T refold için 1 pN.</li>
	</ol></li> <li>Flowing protein çözüm <ol><li>protein çözüm akış yönü ne zaman ~ 20 pN kuvvet coverslip boncuk eki önlemek için. G4 yapısı yüksek özgüllük gösterdi, DEAH-box RHAU helikaz kullanılan 24 oldu. Rekombinant Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helikaz Escherichia coli ifade edilen ve daha önce 25 açıklandığı gibi saf. DmRHAU besleyicisini etkinliği bir tetramolecular G4 DNA substrat 13 denetlesinler G4.</li>
	</ol></li> <li>Bir in-house kullanarak unfolding kuvvet Matlab programı 14 yazılı analiz.</li></ol>

<ol><li>Rhodes, D., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+and+their+regulatory+roles+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes and their regulatory roles in biology.</a> Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).</li>
<li>Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+quadruplex-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA quadruplex-binding proteins.</a> Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).</li>
<li>Gonzalez, V., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+nucleolin+promotes+the+formation+of+the+c-MYC+G-quadruplex+and+inhibits+c-MYC+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity.</a> Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((telomerase-interacting+protein+that+unfolds+telomere+G-quadruplex+and+promotes+telomere+extension+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+and+helicases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Schiavone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PrimPol+Is+Required+for+Replicative+Tolerance+of+G+Quadruplexes+in+Vertebrate+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells.</a> Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).</li>
<li>Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+kinetics+of+G-quadruplex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stability and kinetics of G-quadruplex structures.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).</li>
<li>Woodside, M. T., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+folding+energy+landscapes+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy.</a> Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+high-force+magnetic+tweezers+for+stretching+and+refolding+of+proteins+and+short+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA.</a> Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+equilibrium+folding+and+unfolding+transitions+of+titin+immunoglobulin+domain+under+constant+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces.</a> J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).</li>
<li>You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+kinetics+of+c-MYC+promoter+G-quadruplexes+studied+by+single-molecule+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation.</a> J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).</li>
<li>You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHAU+helicase+stabilizes+G4+in+its+nucleotide-free+state+and+destabilizes+G4+upon+ATP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).</li>
<li>You, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+stability+of+polymorphic+human+telomeric+G-quadruplex+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension.</a> Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).</li>
<li>Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+overstretched+DNA+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Two distinct overstretched DNA states.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).</li>
<li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA%2C+melting+bubbles%2C+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+High-Force+Magnetic+Tweezers+for+Stretching+and+Refolding+of+Proteins+and+Short+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA.</a> Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).</li>
<li>Fu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA%2C+melting+bubbles%2C+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-biophys-122311-100544?journalCode=biophys">Recent advances in magnetic tweezers.</a> Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).</li>
<li>Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-field-magnetic-tweezer+manipulation+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905(2004).</li>
<li>Le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbance-free+rapid+solution+exchange+for+magnetic+tweezers+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies.</a> Nucleic Acids Res. 43 (17), e113(2015).</li>
<li>Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadruplex+Nucleic+Acids+as+Novel+Therapeutic+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets.</a> J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).</li>
<li>Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes%3A+Emerging+roles+in+neurodegenerative+diseases+and+the+non-coding+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).</li>
<li>Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+G-quadruplexes+in+gene+promoters%3A+a+novel+anticancer+strategy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).</li>
<li>Amato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+Development+of+Specific+G-Quadruplex+Binders%3A+Synthesis%2C+Biophysical%2C+and+Biological+Studies+of+New+Hydrazone+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives.</a> J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).</li>
<li>Wells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-B+DNA+conformations%2C+mutagenesis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease.</a> Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıda, bir platform G4 DNA'ın mekanik sağlamlık ve G4 kullanarak için protein etkileşimleri çalışmak için açıklandığı gibi tek molekül manyetik cımbız bildirilmektedir. Platform refakat, G4 DNA urgan ve ölçüm katlama-unfolding dinamikler ve istikrar nanometre özel çözünürlük ile G4 yapısının bulma yüksek verimli iletişim kuralları geliştirilmiştir. Odak düzlemi kilitleme küçük yapı geçiş G4 gibi algılamak için önemlidir son derece kararlı Anti-drift denetim sağlar (adım ...

4 iplikçikli DNA veya RNA G4 yapıları birçok önemli biyolojik süreçlerin1' kritik rol oynarlar. Çoğu protein G4 bağlama ve yönetmelik, telomer proteinler (Revers, POT1, RPA, TEBPs, TRF2) dahil olmak üzere dahil olan1,2, transkripsiyon faktörleri (nucleolin, PARP1)3, RNA proteinleri (hnRNP A1, işleme hnRNP A2)4, helikazlar (BLM, FANCJ, RHAU, UYR, Dna2, Pif1)5ve DNA ikileşmesi proteinleri (Rif1, Değişiklik1, PrimPolymerase)6ile ilgili. Protein bağlayıcı stabilize veya G4 yapıları istikrarsızlaştırmak; Böylece sonraki Biyolojik işlevleri düzenleyen. G4 kararlılığını ultraviyole (UV) veya dairesel dichroism (CD) yöntemleri7kullanarak erime termal tarafından ölçüldü. Ancak, bu koşullar fizyolojik değildir ilgili ve proteinler7bağlama etkilerini eğitim için uygulamak zordur.
Tek molekül işleme teknolojilerinde hızlı geliştirme çalışmaları katlama ve DNA veya nanometre çözünürlük gerçek zamanlı8ile tek molekül düzeyinde bir protein gibi bir biomolecule, elinde tutmasına sağlamıştır. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM), optik cımbız ve manyetik cımbız en yaygın olarak kullanılan tek molekül manipülasyon yöntemleri vardır. AFM ve optik cımbız9ile karşılaştırıldığında, manyetik cımbız katlama-unfolding dinamikleri tek bir molekül istikrarlı ölçümleri gün içinde bir anti-drift tekniği10,11kullanarak izin.
Burada, bir tek molekül manipülasyon platform G4 istikrar Yönetmeliği proteinler bağlayarak çalışmaya manyetik cımbız kullanarak bildirilen12,13. Bu eser örnek ve akışı kanal hazırlanması, manyetik cımbız kurulum ve güç kalibrasyon dahil olmak üzere temel yaklaşımlar özetliyor. Kuvvet kontrolü ve anti-drift protokolleri açıklandığı adım 3 olarak uzun zaman ölçümleri sürekli gücü (kuvvet kelepçe) gibi çeşitli güç kontrolleri altında izin verir ve sabit yükleme (kuvvet-rampa) oranı ve kuvvet-ölçüm atlama. 4. adımda açıklanan güç kalibrasyon Protokolü güç kalibrasyonu sağlayan &#60; 1 µm kısa bağları üzerinde geniş bir güç aralığı 100 pN, % 10 içinde göreli bir hata ile. RNA helikaz kararlılığını düzenlenmesi örneği RNA G4 bu platform13uygulamaları göstermek için kullanılan çözümlenmesinde temel rol oynar AU-zengini eleman (RHAU) helikaz (diğer adı DHX36, G4R1) ile ilişkili.

<table><tbody><tr><td>DNA PCR primers</td><td>IDT</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>DNA PCR chemicals</td><td>NEB</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>restriction enzyme BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S</td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)</td><td>BMH.BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td></td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>M-280, paramganetic beads,streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11205D</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Polybead Amino Microspheres 3.00 &amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Olympus Microscopes IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Piezo-Z Stages P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>CCD/CMOS camera</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Translation linear stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Cubic Magnets</td><td>Supermagnete</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>Data analysis</td></tr></tbody></table>

single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers

Sigara-kurallı nükleik asit ikincil yapı G-quadruplexes (G4) DNA ikileşmesi, transkripsiyon, RNA işlenmesi ve telomer uzama gibi çeşitli hücresel süreçler söz konusu. Bu işlemler sırasında çeşitli proteinlerin bağlamak ve onların işlevi gerçekleştirmek için G4 yapıları gidermek. G4 fonksiyonu kez katlanmış yapısını istikrar üzerinde bağlı olarak, nasıl G4 proteinler G4 kararlılığını düzenleyen araştırmak önemlidir. Bu çalışma tek G4 molekülleri G4 proteinler G4 molekülünü gerçek zamanlı olarak düzenlenmesi çalışmaları sağlayan manyetik cımbız kullanarak işlemek için bir yöntem sunar. Genel olarak, bu yöntem çalışmaları uygulamalarında geniş bir kapsamı proteinler/ligandlar etkileşimleri ve çeşitli DNA veya RNA ikincil yapılar üzerinde düzenlemeler için uygundur.

Deneme kurulumu G4 molekülünü germe için şekil 4' te gösterilmiştir. Bir tek iplikçikli G4 şekillendirme sıra iki dsDNA kolları arasında yayılmış bir coverslip ve bir paramagnetic boncuk arasında gergin. Bir tek dsDNA gergin boncuk bulmak için overstretching bir tahlil kuvvet sabit yükleme hesaplı artırarak gerçekleştirildi. Ölçümleri üç tür katlama okuyan ve biomolecules unfolding için kez kullanılmıştır: (i) sabit kuvvet öl...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers at JoVE.com

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

single-molecule-manipulation-of-g-quadruplexes-by-magnetic-tweezers

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K Görüntüleme.  Huazhong University of Science and Technology. G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

Video: Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Biyokimya

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Biyomühendislik

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Mikroplaka formatında manyetik cımbız

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

Mikroplaka formatında manyetik cımbız

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

Kimyasal Haritalama Kullanarak Bir DNA Şablonundaki G-Dörtlülerini Tanımlama

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Yazar Spot Işığı: Bis-3-Kloropiperidin Bazlı Kimyasal Haritalama ile DNA G-Quadruplex'in Karakterize Edilmesi 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

Mikroplaka formatında manyetik cımbız

Mikroplaka formatında manyetik cımbız

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması