Name: dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum at JoVE.com

Bu araştırma Brigham &amp; Kadın Hastanesi ve Dimes Mart ayı tarafından desteklendi. Yazarlar, Whited Lab&#39;ın tüm üyelerine, destekleri ve tavsiyeleri için teşekkür etmek istiyorlar.

Tüm axolotl deneyleri Brigham ve Kadın Hastanesi (BWH) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi&#39;ne uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Perfüzyon Deneyi oluşturun <ol><li> Yetişkin bir aksolotu% 15 tricaine solüsyonu (MS222) ile dolu plastik bir kapta 15-20 dakika boyunca veya tamamen anestezi edilinceye kadar yerleştirin. Kabın, aksolotl tamamen suya batırılmış olacak şekilde yeterli tricaine solüsyonu ile doldurulduğundan emin olun. Not: Bütün prosedürler, kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmelidir. BWH&#39;de, bir ayak-sıkışması testinde başarısız olduğunda bir aksolot&#39;un tamamen anestezi altına alındığı düşünülür; yani, ayak hafifçe sıkıldığında refleksive bir hareket yoktur. Dikkat: Tricaine, suda yaşayan organizmalar için özel olarak kullanılan anestezik olmasına rağmen, tricaine solüsyonuyla doğrudan cilt temasından kaçınılmalıdır. </li><li> Axolotl perfüzyon istasyonunu kurun. <ol><li> YerleştirinEmici ped, emici taraf yukarı bakacak şekilde düz, düz bir yüzeye yerleştirilir. </li><li> Polystyrene foam çerçevesinde, anestezi uygulanmış axolotl&#39;un sırtüpe yerleştirilmesi için uygun boyut ve şekle sahip bir delik açın. Çerçeveyi emici ped üzerine yerleştirin. Not: İlave emici olması için bazı ilave kağıt havluları çerçevenin hemen altına yerleştirilebilir. </li><li> Peristaltik pompayı perfüzyon hortumu ile yükleyin. Pompayı, saat yönünde akan 0,7 ml / dakika akış hızına ayarlayın. </li><li> 1: 4 oranında 0.7x PBS ve% 5 glukoz ile seyreltici solüsyon yapın. </li><li> 10 mL seyreltici solüsyonu 50 mL&#39;lik konik bir tüp içerisinde 200 μL DiI stok solüsyonuyla karıştırın. Kap ve karıştırarak karıştırın. Işık solüsyonunu ışığa maruz kalmamak için alüminyum folyo kağıdıyla tüpü kapatın. Not: Ciltler orantılı olarak axolotl boyutuna göre değiştirilmelidir. Bu değerler, yaklaşık 15 cm&#39;lik bir aksolot (burun-kuyruk uzunluğu) içindir. birBu büyüklükteki nimals tam cinsel olgunluğa ulaşmamış olabilir, bu nedenle hayvan cinsiyeti şu anda belirlenemeyebilir. </li><li> 0.7x PBS ile 50 mL konik tüpe doldurun. Not: PBS döngü ve axolotl salınmasını önlemek için kullanılacaktır. </li><li> Perfüzyon borusunun çıkış ucuna 27 ayarlı kelebek iğne takın. Kelime kanatlarını birbirine katlayın ve kelepçe standına yerleştirin. </li><li> 0.7x PBS ile dolu 50 mL konik tüp içine perfüzyon tüpünün serbest ucunu yerleştirin ve tüm tüp çözelti dolana kadar perfüzyon pompası çalıştırın. Tüm hortum PBS ile doldurulduktan sonra pompayı duraklatın. Not: Tüpün daima hava kabarcığı olmadığından emin olun, aksi takdirde bunlar aksolotlun içindeki hava embolisine neden olur ve tam perfüzyonu önler. </li><li> Polistren köpük çerçevesindeki aksolot şeklindeki kalıba bir kağıt havlu yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak havluyu tricaine solüsyonuyla ıslatın. Not: Kağıt çekirken ortasında küçük bir kareyi kesinPerfüzyon prosedürü sırasında sıvıların drenajına izin vermek için. </li><li> Polestiren köpük çerçevenin içindeki kağıt havlu üzerine anestezi altındaki axolotl yatağını yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Axolotl Göğüsün Açılması <ol><li> Cerrahi forseps kullanarak cildi, omuzların çizgisinin hemen altındaki aksolot göğsünün merkez ekseni boyunca tutturun. Çekilin. </li><li> Derinin çekildiği küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. </li><li> İki kıkırdak tablası ortaya çıkarmak için göğüs üzerinde bir kare deri parçasını çıkarın. <ol><li> Kalbi açıkça görebilmek için yeterince büyük olan ve kalpten ayrılan yaklaşık 5 mm aorta göğüs boşluğunun üzerinde bir pencere açmak için cildi çıkarın. </li></ol></li><li> Büyük kan damarlarının kesilmesini önlemek için bağ dokusunu forseps veya kapalı makas kullanarak dikkatlice yırtın. </li><li> Her bir kıkırdak tablasını forseps kullanarak tek tek kaldırın ve onlarıCerrahi makasla </li><li> Dikkatle forseps ile perikard tutun, çekin ve cerrahi makas kullanarak delin; Bu kesik çok ince perikardı delmek için yeterince derin olmalıdır ve perikardın çıkarılmasına izin verecek kadar büyük olmalıdır. Kalbi kesmemeye özen gösterin. </li><li> Kalbi ve aortu ortaya çıkarmak için dikkatlice perikardı çıkarın. Not: Bir transfer pipeti kullanarak, periyodik olarak bölgeyi açık tutmak ve aksolotu anestezi altında tutmak için göğüs boşluğunu ve solungaçları tricaine solüsyonuyla yıkayın. </li></ol> 3. Axolotl&#39;ın perfüzyonu <ol><li> Yüklü kelebek iğne ile kelepçe standını polistiren köpük çerçevesinin yanına yerleştirin, böylece kelepçenin kolu iğneyi aksolotlu aortaya sokmak için kolaylıkla manipüle edilebilir. Ekleme esnasında iğnenin ucunu hayvanın rostral yönüne doğru tutun ve iğne boyunca delmeden kaçınmak için iğneyi aorta paralel tutunPosite tarafı. </li><li> Peristaltik pompayı açın. 0.7x PBS borudan akmaya devam etmelidir. </li><li> İğneyi aorta yerleştirin. <ol><li> Forsepsi aortik kemerin altına kaydırın ve kolay erişmek için hafifçe yukarı çekin. </li><li> İğne kelepçesi kombinasyonunu, iğnenin aortun uzunluğu boyunca kafaya doğru ilerlediği şekilde manevra edin. Aortun arkasındaki destek için forseps kullanırken iğneyi yerleştirin. Not: İğne, perfüzyon sırasında kaymayacağından emin olmak için aortun içine yeterince derin yerleştirilmelidir. Bu, 15 cm&#39;lik bir aksolot için yaklaşık 5 mm olabilir. Geminin tam delinmesini önlemek için iğnenin aort ile tam uyumlu olduğundan emin olun. Through-and-through delikleri büyük kanamalara neden olabilir ve perfüzyon başarı oranlarını düşürebilir. Başarılı yerleştirme, kalbin atriyumunun görünür biçimde genişlemesi ile teyit edilebilir. </li></ol></li><li> Bilimlerle bir atriyumu çabucak yaralayınSsors ve kan tahliye etmesine izin ver. <ol><li> Göğüs boşluğunda kan birikimi ve pıhtı oluşumunu önlemek için tricaine solüsyonu ile yıkayın. </li></ol></li><li> Aksolotiyi yaklaşık 20-30 mL PBS ile boşaltın. Hayvan, başarılı bir perfüzyonda açık pembeden beyaza beyaza dönüşmelidir. </li><li> Peristaltik pompayı duraklatın ve borunun serbest ucunu 15 mL DiI çözeltisindeki tüpün içine alın. Pompayı yeniden başlatın, hortumda hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin. </li><li> Aksolot&#39;u DiI&#39;nin tüm çalışma stokuyla arıtın. Not: Başarılı bir perfüzyonda, aksolotl DiI&#39;nin parlak pembe renge dönüşür. Solungaçlarda bu en belirgin olacaktır. </li><li> DiI ile perfüzyon tamamlandıktan sonra pompayı duraklatın ve dokuyu düzeltmek için hortumun serbest ucunu% 4 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi içine yerleştirin. Pompayı yeniden başlatın ve en az 10 mL PFA&#39;yı perfüze edin. Dikkat: PFA toksiktir ve ele alınmalı ve kullanılmamalıdır.Uygun bir şekilde sed. Eldiven ve koruyucu gözlük takılmalı ve çözümler bir davlumbazın içinde yapılmalıdır. Doku düzeltmek için aksolotlun PFA ile perfüzyonu hayvanın ölümüyle sonuçlanır. </li></ol> 4. Perfüzyonun ve Görselleştirme Hazırlığının Sona Erdirilmesi <ol><li> Peristaltik pompayı durdurun ve iğneyi aksolotlu aortadan çıkarın. </li><li> Aksolot&#39;u plastik bir plakaya yerleştirin. Not: Büyük bir Petri kabının yarısını kullanmanız iyi bir sonuçtur ve cildini ıslak tutmak ve görselleştirme kalitesini iyileştirmek için küçük miktarda Tricaine veya PBS&#39;yi axolotl üzerine dökmeye izin verir. </li><li> Kullanılmış tüm malzemeleri uygun çöp bidonlarına atın. % 70 etanol ile cerrahi aletleri temizleyin, hayvanlar arasında cam boncuk sterilizatör kullanarak dezenfekte edin ve prosedürü izleyen otoklavla sterilize edin. Boruyu PBS çözeltisiyle yıkayın ve daha sonra boşaltın, tamamen kurutun ve daha ileri bir kullanım için saklayın. </li></ol> 5. Perfused Axolotl&#39;ın görselleştirilmesi <ol&gt; <li> Aksolotl&#39;u floresan bir konfokal mikroskop altında yerleştirin. </li><li> Işıkla DiI lekeli kapların görselleştirilmesi engellendiği için ışıkları kapatın. </li><li> Aksolotlun vaskülatürünü görselleştirmek için konfokal mikroskop ile yeşil bir fluoresans emisyon filtresi küpü ( örn. ET-CY3) kullanın. 545 nm dalga boyundaki uyarılma ışığını kullanın. Not: Yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için aşağıdaki parametreler kullanılabilir: 1.1 s için pozlama, 1 kat artışı, 1.0 doygunluk, 2X büyütme. </li></ol>

<ol>
	<li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels.">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li><li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels.">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374 (2013).</li><li> Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Scanning+electron+microscopy+and+vascular+corrosion+casting+for+the+characterization+of+microvascular+networks+in+human+and+animal+tissues."> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li><li> Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+DiI+and+DiO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing."> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells.">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+TALEN-mediated+gene+editing+of+an+endogenous+locus+in+axolotl.">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li><li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine.">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li><li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration.">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Aksolotlun vaskülatürünün görselleştirilmesi lipofilik karbosiyanin boyası DiI ile perfüzyon yoluyla başarıyla başarılabilir. Bu çalışmada, bir peristaltik pompa kullanarak diolotl&#39;in diI ile perfüzyonu için yeni bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca bir floresan konfokal mikroskop kullanarak axolotl damar sisteminin daha sonraki görselleştirmesini gösteririz. Bu protokol, Li ve ark.&#39;ında görülen kemirgen DiI perfüzyon protokolünün bir uyarlamasıydı . <sup class="...

Vaskülatürün görselleştirilmesi, birçok canlıda organizmaların yapı ve işlevlerinin anlaşılmasında hayati bir rol oynamaktadır. 16. yüzyılda Leonardo da Vinci ile başlayan dolaşım modelleri ve grafik gösterimleri incelenmiştir. Balmumları ve kauçuk kalıpları kullanarak dokular, organogenez ve patogenez 1 , 2 çalışmasına izin veren vaskülatürün üç boyutlu modellerini oluşturmak için perfüze edildi. Reçineler ve mumlar Hindistan Mürekkebi veya karmin kırmızısı gibi boyalarla renklendirildi ve 1 , 2 kolay görselleştirmelerine izin verdi. Bununla birlikte, bu teknikler yüksek viskozite nedeniyle ilgi dokularının tam perfüzyonunu engellediğinden pek çok soruna neden olmuştur. Alan daha sofistike hale geldiğinde, konfokal ve elektron mikroskoplarının kullanımı, perfüzyon tekniğini<html> Döküm kalıplarından ve vaskülatürün sıvı perfüzyonlarına doğru uzanır, bazıları ilk dokuyu yok etmeden kan damarlarının perfüzyon ve görüntülemesine izin verir 3 . DiI, flüoresan bir karbosiyanin boyası, hayvanların vasküler dokuya zarar vermeden perfüzyonuna izin veren böyle bir leke oluşturmaktadır. Karbosiyanin boyaları, temas üzerine hücre zarlarına dahil edilen lipofilik boyalardır. Bu boyalar vasküler endotel hücrelerinin kolay ve anında lekelenmesine izin verir, bu da floresan bir konfokal mikroskop altında izlenebilir. Nöronların etiketlenmesinde ve izlenmesinde gösterildiği gibi DiI, yanal difüzyon yoluyla hücrelerin lipid zarında hareket eder 4 . Kimyasal olarak, DiI&#39;nin iki alkil zinciri boya hücre zarları için yüksek afiniteye sahipken, yeşil flüoresan ışık filtreleri tarafından uyarıldığında kırmızı bir dalga boyu yaymaktan sorumlu bir florokromdan iki eşlenik halka&gt; 4. DiI, plazma membranının başarılı bir şekilde etiketlenmesi ve nöronlarda anterograde ve retrograd etiketleme de dahil olmak üzere birçok kapasitede kullanılmıştır 5,6. DiI, daha önce, farelerin vaskülatürünü görselleştirirken perfüzyon protokollerinde kullanılmıştır 7 . Axolotls ( Ambystoma mexicanum ), Mexico City, Meksika yakınlarındaki hafif tuzlu gölde yaşayan tezahüratçılardır. Bu hayvanlar, tam ekstremiteler, kuyruk (sinir kablosu dahil), kalp ve diğer iç organların bölümlerini ve yetişkinler 8 , 9 gibi göz kısımlarını yenileyebildikleri için rejeneratif işlemleri anlamak için önemli bir model haline gelmiştir. Ayrıca, son zamanlarda aksolotlarda genetik araçların uygulanmasıyla, bu süreçleri yönlendiren moleküllere ve hücrelere benzeri görülmemiş bir fikir verilmesi artık mümkündür. Başarılı rejimTüm ekstremitenin rasyonunda, oksijen ve besin sağlanmasındaki kan damarlarının sadece geleneksel işlevlerinin ötesinde yenilemede önemli bir rol oynayabilecek kapsamlı bir revaskülarizasyon süreci gereklidir. Doku rejenerasyonu bağlamında revaskülarizasyonu anlamak zorunludur. Axolotl kan damarları daha önce Hindistan Mürekkebi kullanılarak görselleştirildi ve sonuç ilginç iken, sonraki süreçte bu süreç tekrar gözden geçirilmedi 10 . Memelilerde kullanılmak üzere geliştirilmiş bir DiI perfüzyon protokolünü tam bir perfüzyona ve axolotl vaskülatürünün görselleştirilmesine izin vermek için uyarlamaya çalıştık. Bu protokol, DiI boyama tekniği ile başarılı bir şekilde perfüzyon yapmak ve ardından aksolotil dolaşımı görselleştirmek için atılan adımları açıklar. Bu prosedür, homeostatik dokularda patent kan damarlarının hassas şekilde görüntülenmesine ve dokuların yenilenmesine olanak tanır ve görselleştirme için yeni bir yöntem sunarN ve axolotl&#39;deki revaskülarizasyon sürecinin analizi.

<table><tbody><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Marshall Scientific&amp;nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion tubing</td><td>Excelon Lab &amp;amp; Vacuum Tubing</td><td>436901705</td><td>size S1A</td></tr><tr><td>27g butterfly needle</td><td>EXELint Medical Products</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-Dioctadecyl-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (100% vol/vol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Surgical foreceps&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene foam frame</td><td></td><td></td><td>any polystyrene foam square with an axolotl-shaped&amp;nbsp; cut out</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>Absorbent underpad</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>Paper towels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard disposable transfer pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>Clamp stand</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricaine powder</td></tr><tr><td>Adult axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tanks</td><td></td><td></td><td>Varying size appropriate for the axolotl</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Axolotl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 Fluorescent Filter</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii perfusion as a method for vascular visualization in ambystoma mexicanum

Perfüzyon teknikleri dokuların dolaşımını görselleştirmek için yüzyıllar boyunca kullanılmıştır. Axolotl (Ambystoma mexicanum), rejenerasyon çalışmaları için önemli bir model olarak ortaya çıkan bir semender çeşididir. Bu hayvanlarda rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyonun nasıl gerçekleştiği hakkında pek az şey bilinmektedir. Burada 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) perfüzyonu ile axolotl vaskülatürün görselleştirilmesi için basit bir metodu sunuyoruz. DiI, endotel hücrelerinin plazma membranına anlık olarak giren bir lipofilik karbosiyanin boyadır. Perfüzyon, periyodik bir pompa kullanılarak gerçekleştirilir; böylece DiI, aort üzerinden dolaşıma girer. Perfüzyon sırasında, boya, aksolot&#39;un kan damarları boyunca akar ve temas üzerine vasküler endotel hücrelerin lipid iki katmanına dahil edilir. Perfüzyon işlemi sekiz inçlik bir aksolot için yaklaşık bir saat sürer. Perfüzyon sonrası hemenDiolotl, konfokal flüoresan mikroskop ile görselleştirilebilir. DiI, yeşil-floresan filtresi ile heyecanlandığında kırmızı-turuncu renkte ışık yayar. Bu DiI perfüzyon prosedürü aksolotların vasküler yapısını görselleştirmek veya rejenere dokularda revaskülarizasyon modelleri göstermek için kullanılabilir.

<html> DiI boyama ile, aksolotlu damar sistemi kolaylıkla görselleştirilebilir. Lipofilik boya ile perfüze edilen hayvanların kan damarları flüoresan konfokal mikroskop altında hemen görülebilir. Şekil 1..1-1.5 , perfüzyon protokolünün şematik bir temsilidir. Parlak pembe boya ile perfüzyon yapıldıktan sonra, başarılı bir şekilde akıtılmış bir aksolotl pembe görünür. Konfokal mikroskopta yeşil bir fluoresan filtr...

Watch this Scientific Journal Video about DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum at JoVE.com

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Bir lipofilik 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) boyama tekniği kullanarak, Ambystoma mexicanum vasküler yapının kolay görselleştirilmesini sağlamak için vasküler perfüzyona uğrayabilir.

Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

9.9K Görüntüleme.  Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital.  Bir lipofilik 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) boyama tekniği kullanarak, Ambystoma mexicanum vasküler yapının kolay görselleştirilmesini sağlamak için vasküler perfüzyona uğrayabilir. 

Video: DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Meksika Tetra Astyanax mexicanus analiz Post-larval fenotipleri ve bütün Dağı immünhistokimya için yetiştirme

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Genetik

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Gelişim Biyolojisi

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The cerebral vasculature dynamically responds to various pathophysiological states and it exhibits considerable differences between strains and under conditions of genetic manipulations. Essentially, a reliable technique for intracranial vessel staining is essential in order to study the pathogenesis of ischemic stroke. Until recently, a set of different techniques has been employed to visualize the cerebral vasculature including injection of low viscosity resin, araldite F, gelatin mixed with various dyes1 (i.e. carmine red, India ink) or latex with2 or without3 carbon black. Perfusion of white latex compound through the ascending aorta has been first reported by Coyle and Jokelainen3. Maeda et al.2 have modified the protocol by adding carbon black ink to the latex compound for improved contrast visualization of the vessels after saline perfusion of the brain. However, inefficient perfusion and inadequate filling of the vessels are frequently experienced due to high viscosity of the latex compound4. Therefore, we have described a simple and cost-effective technique using a mixture of two commercially available carbon black inks (CB1 and CB2) to visualize the cerebral vasculature in a reproducible manner5. We have shown that perfusion with CB1+CB2 in mice results in staining of significantly smaller cerebral vessels at a higher density in comparison to latex perfusion5. Here, we describe our protocol to identify the anastomotic points between the anterior (ACA) and middle cerebral arteries (MCA) to study vessel variations in mice with different genetic backgrounds. Finally, we demonstrate the feasibility of our technique in a transient focal cerebral ischemia model in mice by combining CB1+CB2-mediated vessel staining with TTC staining in various degrees of ischemic injuries.

Analysis of rodent cerebrovascular anatomy plays an important role in experimental stroke research. In this context, intravascular perfusion with colored latex has been considered as a standard tool for several years. However, this technique implies distinct technical limitations, which undermine its reproducibility. Here, we describe a simple method to visualize cerebral vessels in a reproducible manner. Injection of a mixture of two commercially available carbon black inks through the left myocardial ventricle results in adequate filling of cerebral vessels with high contrast visualization. We have successfully applied this technique to identify anastomotic points between cerebral vascular territories of mice with different genetic backgrounds. We finally give evidence that this novel and simple method for vessel staining can be combined with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining - a widely used tool to observe and analyze infarct volumes in mice.

Karbon Siyah Mürekkep İntravasküler Perfüzyon Serebral Gemiler Güvenilir Görselleştirme verir

The anatomical structure of cerebral vessels is a key determinant for brain hemodynamics as well as the severity of injury following ischemic insults. The ...

Nörobilim

Mikroakışkan Tabanlı Vaskülarize İnsan Mikro Tümör Modelinin Hazırlanması

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Yazar Spotlight: Translasyonel Kanser Araştırmaları için Model Olarak İnsan Vaskülarize Mikro Tümörleri Oluşturma 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Kanser Araştırmaları

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Biyomühendislik

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model species such as zebrafish and salamanders that are capable of intrinsic heart regeneration hold promise for future regenerative therapies for human patients. To evaluate the outcome of cardioregenerative experiments it is imperative that heart function can be monitored. The axolotl salamander (A. mexicanum) represents a well-established model species in regenerative biology attaining sizes that allows for evaluation of cardiac function. The purpose of this protocol is to establish methods to reproducibly measure cardiac function in the axolotl using echocardiography. The application of different anesthetics (benzocaine, MS-222, and propofol) is demonstrated, and the acquisition of two-dimensional (2D) echocardiographic data in both anesthetized and unanesthetized axolotls is described. 2D echocardiography of the three-dimensional (3D) heart can suffer from imprecision and subjectivity of measurements, and to alleviate this phenomenon a solid method, namely intra/inter-operator/observer analysis, to measure and minimize this bias is demonstrated. Finally, a method to acquire 3D echocardiographic data of the beating axolotl heart at a very high spatiotemporal resolution and with pronounced blood-to-tissue contrast is described. Overall, this protocol should provide the necessary methods to evaluate cardiac function and model anatomy, and flow dynamics in the axolotl using ultrasound imaging with applications in both regenerative biology and general physiological experiments.

2D and 3D Echocardiography in the Axolotl Ambystoma Mexicanum

Here we present echocardiography protocols for two-dimensional and three-dimensional image acquisition of the beating heart of the axolotl salamander (Ambystoma mexicanum), a model species in heart regeneration. These methods allow for longitudinal evaluation of cardiac function at a high spatiotemporal resolution.

Amfibi (Ambystoma Mexicanum) 2D ve 3D ekokardiyografinin yeri

Cardiac malfunction as a result of ischemic heart disease is a major challenge, and regenerative therapies to the heart are in high demand. A few model ...

Tıp

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Murin Arka Ekstremite Kangren Modelinde Footpad Vaskülatürünün Yüksek Çözünürlüklü Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Sıçan Cremaster&#39;ın Muscle arteriyollerde Hücre-serbest Katman Görselleştirme ve

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Meksika Tetra Astyanax mexicanus analiz Post-larval fenotipleri ve bütün Dağı immünhistokimya için yetiştirme

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi

Karbon Siyah Mürekkep İntravasküler Perfüzyon Serebral Gemiler Güvenilir Görselleştirme verir

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Amfibi (Ambystoma Mexicanum) 2D ve 3D ekokardiyografinin yeri

Murin Arka Ekstremite Kangren Modelinde Footpad Vaskülatürünün Yüksek Çözünürlüklü Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Sıçan Cremaster'ın Muscle arteriyollerde Hücre-serbest Katman Görselleştirme ve