Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (NSFC) tarafından desteklenmiştir: 31301950 ve 31671288.

Geçerli yöntem kurulmuş ve hasat ve laboratuvarımızda histolojik boyama için 1.000 &#39;den fazla kas örnekleri saklamak için valide edilmiştir. Hayvan bakım ve kullanımını içeren tüm uygulamalar Çin Tarım Bakanlığı tarafından kurulan yönergelere izledi. Örnek Toplama 1. Ekipmanları <ol><li> Her bir kriyojenik şişe ile ilgili örnek bir kimlik etiketleyin. Not: Derin dondurucudaki şişe özel cryosection prosedür (Şekil 1A) taze doku numuneleri dondurma için tasarlanmıştır. Deney şişeleri, bir kalıp fabrikası (Şekil 1C) polipropilen imal edilmektedir. </li><li> uygun bir sıvı azot tankında sıvı azot, gözlükler veya bir yüz kalkanı, derin dondurucu eldiven, 10 cm forseps, 25 cm cımbız, plastik bir soğutucu (iç boyutları: 20 cm uzunluk x 12 cm genişlik x 13.5 cm yüksekliğinde, aşağıdaki malzemelerin temin ; dış boyutları: genişlik x 15 cm yükseklik, 24 cm uzunluk x 16 cm), bir plastik filmin (genişlik x 0.1 mm kalınlığında 2.5 cm uzunluğunda x 0.8 cm),bir bisturi ve A4 PVC bağlayıcı kapaklar (21 cm x 29.5 cm) (Şekil 1B). </li></ol> Kas Örneklerinde 2. Hazırlık <ol><li> önde numune ile birlikte, sıvı azot, 5 dakika ile köpük soğutucu doldurun. Not: sıvı azot parçası edn ve yeni hazırlanmış numunelerin, dokunma zaman gaz haline geçer, çünkü sıvı azotun büyük bir kolon gerekmektedir. kaybını önlemek için sıvı azot devri sıklığını azaltmak için, uygun boyutta bir köpük soğutucu numune sayısına göre önceden kazanılmış olması gerekir. </li><li> Bir örnek alındığında, nazikçe A4 PVC bağlayıcı kapağın bir parçasına koyun ve kas liflerinin yönüne dikkat. NOT: Burada, domuzlarda son bel omur birinciden longissimus Doris kasının kesiti kullanılır. Numuneler yaklaşık 12 cm uzunluğunda, 8 cm genişliğinde ve 5 cm yüksekliğinde bulunmaktadır. </li><li> numune i ile iki paralel kesiler yapmak için bir neşter kullanınn, kas liflerinin doğrultusu, uzunluk olarak yaklaşık 3 cm, birbirinden 0.6 cm. Yaklaşık 0.6 cm genişliğinde x 0.6 cm x 1.5 x yükseklik cm uzunluğunda bir dikdörtgen kazınmış kas kesin. Not: kas liflerinin enine kesit alanı ölçülerek güvenilirliği çok kazıma kas lif oryantasyonuna bağlıdır. </li><li> Yavaşça film (Şekil 2A) uzun kenarına kazıma kas paralel uzunlamasına ekseni ile, plastik film bir parça örneği koymak için, 10 cm forseps kullanın. Not: kas liflerinin yönelim ve nedeniyle hızlı dondurma numunedeki çatlaklar engelleyen bir yapışma işlevi sabitleme yardımcı olan bir tutma işlevi: plastik film iki işlevi vardır. </li><li> Forseps kullanarak, sadece giriş delikleri arasında, etiketlenmiş bir kriyojenik şişe alt ortasına kas dokusunu yerleştirin ve ampul sıkıca (Şekil 2B) kap. </li></ol> 3. Dondurma ve Depolama kas Örneks <ol><li> 25 cm cımbız kullanarak, hızlı bir şekilde sıvı azot (yaklaşık 10-20 s) kaynatın etmez bekleyerek, önceden soğutulmuş köpük soğutucu sıvı azot içinde bütün kriyojenik şişe daldırın. Not: sıvı azot kaynama zaman dondurarak saklamaya uygun vialler dikkatli bir şekilde 10-20 saniye kaynatılarak sıvı azot içinde şişe sokmak, yüzer. </li><li> bir sıvı azot depolama tankı ya da uzun süreli depolama için bir -80 ° C dondurucu kas örnekleri aktarın. </li></ol> 4. Slayt Hazırlama <ol><li> -20 ° C ve -22 ° C arasında bir kriyostat ön soğutma. </li><li> Çıkarın ve eski mikrotom bıçak atmak kriyostat bıçak tutucusu ve devrilme önleyici levha aşağı silin, kriyostat, yeni bir mikrotom bıçağı yükleme ve 8 um kesme kalınlığını ayarlamak. </li><li> Sıvı azot depolama tankı kriyojenik şişede kas örnek aktarın veya -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya kriostada, sıvı azot içinde veya kuru buz üzerinde taşınması. </li&gt; <li> örnek kriyostatının sıcaklığına dengelenmeye için 30 dakika bekleyin. NOT: Bir yüksek sıcaklık numunede buz kristallerinin oluşmasını neden olabilir çünkü örnek dokunmatik olabilecek herhangi ekipman, önceden soğutulması gerekir. </li><li> suda çözünür glikoller ve reçineler (OCT) optimum kesme ısısı formülasyon altında numune tutucu örnek monte edin. 8-mikron bölümleri kesilir. Not: ÇSAF kas liflerinin kesit alanı olduğu için, kas liflerinin yönelimine dik bir kesme açısı ayarlayın. </li><li> Bir oda sıcaklık mikroslayd merkezine doğru bölümlerini monte edin. Derhal bir -80 ° C dondurucu içinde bir slayt kutusu içine slayt yerleştirin. slayt RT&#39;de kurumasına izin vermeyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics.">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li><li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality.">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li><li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Muscling+in+Cattle:+Genes,+Husbandry,+Carcasses+and+Meat.">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li><li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep.">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).</li><li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RYR1+g.1843C&gt;T+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G&gt;A+mutation+on+muscle+hypertrophy.">The RYR1 g.1843C&gt;T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G&gt;A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li><li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation.">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li><li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation.">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li><li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease.">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793 (2015).</li><li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria.">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li><li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Freezing+Temperature+and+Water+Activity+on+Microstructure,+Color,+and+Protein+Conformation+of+Freeze-Dried+Bluefin+Tuna+(Thunnus+orientalis).">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).</li><li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).</li><li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubbles+Size+Estimation+in+Liquid+Flow+Through+a+Vertical+Pipe.">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li><li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+A+Flow+through+Small+Apertures+:+2nd+Report,+Experiments+on+The+Velocity+Field.">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li><li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+flow+through+an+orifice+meter:+CFD+simulation.">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması, mali veya başka türlü, yazarlar tarafından bildirilmiştir.

Burada, dondurma ve kas fonksiyonunun histolojik ölçümler yapmak kas dokuları depolamak için yeni, çok delikli cryovial tarif eder. Bu protokol kritik modifiye bir çok delikli cryovial örnek, doğrudan sıvı azot içine daldırılmış olmasıdır. Bildiğimiz kadarıyla, bu mevcut dondurma yöntemleri arasında kas cryosectioning mükemmel donmuş örnekleri (temsili sonuçları görmek) elde etmek için en basit ve rapidest yoludur. kas araştırmacılar karşılaştığı teknik ...

İskelet kası bakış beslenme ve işleme noktasından bir et üreten hayvan en değerli bileşenidir. kas büyümesi verimliliği ve ortaya çıkan etin kalitesi: Et endüstrisinde, iki özellikle kritik yönleri vardır. Kas ana bileşen olarak, kas lifleri büyüme performansı ve hayvanlarda 1 taze et kalitesini doğrudan ilişkilidir. Örneğin, Liflerin toplam sayısı (TNF) ve Liflerin çapraz kesit alanı (ÇSAF) daha çok kas kitlesi ve et kalitesini belirler; Ayrıca, Elyaf Tipi Kompozisyon (FTC) kuvvetle taze et kalitesini 2. etkiler. Bu nedenle, hayvanlarda kas lifi özelliklerinin manipülasyon çekirdek karlılık ve çiftliklerin 1 rekabet gücünü artırmak için son derece etkili bir yöntemdir. Bugüne kadar birçok içsel ve dışsal faktörler kas lifi characterist manipüle etmek tespit edilmiştirICS 1. Bu manipülasyon, domuzlar 5 sığırlarda 3 Miyostatin gen, koyun 4 Callipyge geni ve RyR1&#39;in ve IGF2 genleri gibi spesifik genleri, hayvanların hedef seçimi ile elde edilebilir. Ayrıca, diyet kontrolü ve spesifik hormonlarla tedaviler kas lifi özelliklerine 6 önemli rol oynamaktadır. Böylece, genetik ve beslenme faktörleri birleştiren bir yaklaşım yağsız et içeriğini ve et kalitesini arttırmak mümkün olabilir. kas liflerinin yapısının aydınlatılması hala bir sorun olduğundan, ancak kas liflerinde çalışmalar et endüstrisinde sınırlıdır. Kas lifi özellikleri, bu miyozin adenosin trifosfat (ATP) deneyi gibi histokimyasal yöntemler kullanılarak tespit edilir. Bu yöntem, dondurulmuş (6-8 um) ince bölümleri içinde yer enzimler gerçeğine dayanırkas lifleri kimyasal bazı ürünleri ile reaksiyona sokulabilir. Bununla birlikte, kas su içeriği ne olursa olsun, bir konumda (yani, sırt, karın veya arka bacak) 7, domuzlar, tavşanlar, fareler ve insanlarda% 75&#39;den daha büyük olduğunu. Daha önce 8, 9 tarif edildiği gibi, cryosections hazırlanması sırasında - eserler dondurma - kas içinde bu ölçüde yüksek nem içeriği, sık görülen bir sorun neden olur. Çoğu durumda, uygun deneyimlerimizi göre, bir mezbaha üretim hattında kas dokularını dondurmak için neredeyse imkansızdır. Burada sunulan protokol, yüksek verimli bir şekilde cryosectioning için kas dokularını dondurmak için laboratuvarda kullanılan basit ve etkili bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntemin vurgulamak sıvı azot içinde hızlı dondurma kas dokuları için tasarlanmış yeni bir gelmekteydi olup. mevcut iş akışı eşzamanlı olarak doku kolaylaştırabiliraçıkça görülebilir bir sitoplazmik bölüm ve çevredeki dokuya kas liflerine sıkı appozisyon ile mükemmel bir kas cryosection donma ve işlenmesi. Sıvı azot dokularıyla karışmaz Buna ek olarak, bu protokol, doku analizi için geniş bir seçenek dizisine uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:140px;">Cryostat Microtome</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Leica</td>
			<td style="width:111px;">Leica CM1950</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon DS-U3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:140px;">&#160;Cryogenic Vial&#160;&#160; Plastic film</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Designed by ourself</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cm-forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25cm-tweezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Safety glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezer gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Commomly-used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

iskelet kası fizyolojisi üzerinde çalışmalar uygun şekilde açıkça görünür sitoplazmik bölmelerle bölümleri elde etmek için numuneler işleme teknik sorunuyla karşı karşıya. Başka engel çevreleyen dokulara miyofiberlerindeki sıkı appozisyon olduğunu. doku fiksasyon ve parafine işlemidir kas lifleri büzülme yol açtığı için, donma kesit için kas dokusu sertleştirme optimal bir araçtır. Bununla birlikte, sık karşılaşılan bir sorun, buz kristallerinin oluşumu nedeniyle kas yüksek su içeriği Dondurulmuş kesitlerin hazırlanması sırasında meydana gelir. Burada sunulan protokol önce sıvı azot içine daldırılarak, kas dokuları dondurulması için basit ve etkili bir yöntem tarif etmektedir. tek başına sıvı azot kullanılarak sorun, aşağıdaki bir yalıtıcı olarak hareket eder ve dokuların soğutma inhibe doku, bir nitrojen gaz bariyeri oluşumuna neden olmasıdır. Bir NE bu &quot;buğu örtüsü&quot; etkisini önlemek içinw dondurarak saklamaya uygun vialler doku yüzeyi çevresinde, sıvı akış hızını arttırmak için tasarlanmıştır. Bu şişe duvarında 14 giriş deliklerinin toplam delme ile elde edilmiştir. Kabarcık dinamiklerine göre, küçük kabarcıklar ve daha az şansa sıvı akış sonuçlarının daha yüksek bir oranı, bir gaz bariyeri oluşturulur. Sıvı azot giriş deliklerinden dondurarak saklama viali içine aktığında, doku etrafında akış hızlı gaz bariyeri ortadan kaldırmak için yeterince hızlıdır. Önceden soğutulmuş izopentan kullanılarak, kas dokuları dondurma yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu protokol daha basit ve daha etkili ve bir verimli bir şekilde kas dondurmak için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem oda sıcaklığında son derece yanıcı olan izopentan, erişimi yok kurumlar için en uygunudur.

Dondurarak saklamaya uygun vialler örnekleme ve dondurulmuş bölümleri hazırlanması sırasında kas dondurma için ortak laboratuar ekipmanları, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. cryovials bir kalıp fabrikasında polipropilenden yapılmıştır. Her şişe, 14, giriş delikleri toplam vardır: bir açık olduğunu göstermektedir; Başka bir alt olduğu; ve geri kalan 12 formu, dört paralel hat, birbirine 90 ° &#39;de dört delik her biri. Bu giriş delikleri z...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen at JoVE.com

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Bu protokol, doğrudan sıvı azot içine sokulup çıkartılarak kas dokuları dondurarak için bir prosedür tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, azot gazı &quot;battaniye etkisi&quot; önlemek yeni cryovial vurguladığında sıvı azot temas bir numunenin doku yüzeyi.

Kas Dokular doğrudan sıvı azot içine girdikleri zaman Artifacts Donma bir çoklu-delikli dondurarak saklamaya uygun vialler ortadan kaldırır

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

a-multi-hole-cryovial-eliminates-freezing-artifacts-when-muscle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Görüntüleme.  Jiangxi Agricultural University.  Bu protokol, doğrudan sıvı azot içine sokulup çıkartılarak kas dokuları dondurarak için bir prosedür tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, azot gazı "battaniye etkisi" önlemek yeni cryovial vurguladığında sıvı azot temas bir numunenin doku yüzeyi. 

Video: A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove residual media that could otherwise quench the Trypsin reaction.  Warmed 0.05% Trypsin-EDTA is then added to cover the cells, and the plate allowed to incubate for up to 5 mins at room temperature.  During this time cells can be observed rounding, and colonies lifting off the plate surface.  Gentle repeated pipetting will remove cells and colonies from the plate surface.  Trypsinized cells are placed in a standard conical tube containing pre-warmed hES cell media to quench remaining trypsin, and then spun.  Cells are resuspended growth media at a concentration of approximately one million cells in one mL of media, a concentration such that one frozen aliquot is sufficient to resurrect a culture on a 10cm plate.  After cells are adequately resuspended, ice cold freezing media is added at equal volume.  Cell suspensions are mixed thoroughly, aliquoted into freezing vials, and allowed to slowly freeze to -80C over 24 hours.  Frozen cells can then moved to the vapor phase of liquid nitrogen for long term storage, or remain at -80 for approximately six months.

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.

Donma İnsan ES Hücreler

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Biyoloji

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Demonstrated in this video are the techniques for flash freezing and sectioning embryonic brain tissue from mouse. Useful tips for using the cryostat are given, including troubleshooting methods that can be used while cutting to ensure that the resultant tissues sections are free of cracks and other distortions.

Flaş Dondurma ve E12.5 Fare Beyin Cryosectioning

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Donma Çözülme ve Ulaştırma Ambalaj Hücreler

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of fluorescently tagged proteins using total internal fluorescence (TIRF) microscopy is used to visualize and quantify changes in cytoskeletal dynamics. TIRF microscopy and the use of fluorescent tags also allows for quantification of the changes in cytoskeletal dynamics caused by mutations in actin. Using this technique, quantification of cytoskeletal function in live cells valuably complements in vitro studies of protein function. As an example, missense mutations affecting the actin residue R256 have been identified in three human actin isoforms suggesting this amino acid plays an important role in regulatory interactions. The effects of the actin mutation R256H on cytoskeletal movements were studied using the yeast model. The protein, Aip1, which is known to assist cofilin in actin depolymerization, was tagged with green fluorescent protein (GFP) at the N-terminus and tracked in vivo using TIRF microscopy. The rate of Aip1p movement in both wild type and mutant strains was quantified. In cells expressing R256H mutant actin, Aip1p motion is restricted and the rate of movement is nearly half the speed measured in wild type cells (0.88 &#177; 0.30 &#956;m/sec in R256H cells compared to 1.60 &#177; 0.42 &#956;m/sec in wild type cells, p &#60; 0.005).

Disease-causing mutations in actin can alter cytoskeletal function. Cytoskeletal dynamics are quantified through imaging of fluorescently tagged proteins using total internal fluorescence microscopy. As an example, the cytoskeletal protein, Aip1p, has altered localization and movement in cells expressing the mutant actin isoform, R256H.

Aip1p Dynamics Aktin de R256H Mutasyon tarafından Altered Hazır

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

Floresan, sindirim böceklerde sıvı alımını yeteneklerini belirlemek için manyetik nano tanecikleri

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...