Bu araştırma, Gaziler İşleri Kariyer Geliştirme Ödülü 1IK2BX001701, Ulusal Bilimsel Araştırma Vakfı İleri Düzeyde Ulusal Merkezi&#39;nden CTSA ödülü UL1TR000445, Ulusal Bilim Kurumu Ödül Numaraları 1547757 ve 1400969 ve NIH hibe GM05551 tarafından desteklendi. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Transaksiyonel Bilimler Geliştirme Ulusal Merkezi veya Ulusal Sağlık Enstitüleri&#39;nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. S100A12&#39;nin ifadesi <ol><li> Yetkili BL21 DE3 hücrelerini standart bir ısı şok protokolü kullanarak pGEMEX-S100a12 plazmid ile değiştirin 18 . Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde bakteri 50 mcL plazmid 1 ila 5 mcL ekleyin. 20 dakika inkübe edin. </li><li> Isı hücreleri 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca şoklanır. </li><li> Hücreleri 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Hücrelere 500 μL SOC ortamı ekleyin. 1 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda 250 dev / dak&#39;da çalkalayarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> LB-agar ortamında (100 ug / mL ampisilin ile takviye edilmiş) 150 μL transformasyon reaksiyonu plakası. 12-16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir koloni seç. 2 mL LB (100 μg / mL ampisilin takviyeli) aşılayın. </li><li> Orbital çalkalayıcıda (300 dev / dak.) 37 ° C&#39;de 4-6 saat inkübe edin. OD 600 , 1-3 absorbans birimi arasında okunmalıdır. </li><li> 50 mL ZYM-5052 autoindu&#39;ya başlangıç ​​kültürü 500 mcL ekleyinCtion media 26 , 100 μg / mL ampisilin ile takviye edilmiştir. En iyi havalandırma ve maksimum ekspresyon için, 250 mL&#39;lik şaşkın bir Erlenmeyer şişeyi kullanın. 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca çalkalayın (300 rpm). </li><li> Bakteri süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 4 ° C&#39;de santrifüj (4,000 xg, 10 dakika) ile peletleyin. </li><li> Ortamı süzün, numuneyi alın ve -80 ° C&#39;de hücre pastasını saklayın. Numune yıllarca istikrarlıdır. </li></ol> 2. Düşük Basınçlı Kromatografi Kullanılarak S100A12&#39;nin Saflaştırılması <ol><li> 30 mL 20 mM Tris, pH 8.0 içinde süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücreleri lize etmek için süspansiyonu son haline getirin. ~ 20 W çıkış, 5 sn açık ve 5 sn kapalı 5 sn kapalı kullanın. </li><li> Çözümü yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarın. Hücre lisatını 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle 20,000 xg santrifüjle açıklayın. </li><li> Yüzey maddeyi boşaltın ve temiz bir 100 mL polipropilen beherine aktarın. Çözeltiyi buz üzerinde bırakarak soğutun. Bir karıştırma ba ekleyinR karıştırın ve yavaş yavaş 11.20 g amonyum sülfat ekleyin. Çözeltinin buz üzerinde bir saat daha karıştırmasına izin verin. Bu,% 60 amonyum sülfat solüsyonu oluşturacak ve E. coli endojen proteinlerinin çoğunu çöktürecektir. S100A12 çözünebilir durumda kalır. </li><li> Çözeltiyi 4 ° C&#39;de, 20.000 xg&#39;de 20 dakika boyunca santrifüjden geçirerek çöktürülmüş proteinin pelet haline getirin. </li><li> Süpernatantı boşaltın ve diyaliz borusuna aktarın (MWCO 3,500 kDa). 4 ° C&#39;de 1 L 20 mM Tris, pH 8.0 karşısında dialize edin. Diyaliz tamponunu iki kez değiştir. Değişiklikler arasında 4 saat izin ver. </li><li> Anyon değişim kromatografisi <ol><li> Düşük basınçlı bir sistemde kromatografi uygulayın. Tipik akış hızı 1 mL / dak&#39;dır. </li><li> 5 mL Sepharose sütununu 10 mL 20 mM Tris, pH 8.0 ile dengeleyin. </li><li> ~ 40 mL S100A12 çözeltisini örnek pompayı kullanarak yükleyin (akışı toplayın). </li><li> Kolonu 10 mL 20 mM Tris, pH 8 ile yıkayın. </li><li> Sütunu% 0-30 gradyan ile geliştirin (BuFfer B, 20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCI&#39;dir) 19 sütun hacmi (CV, 95 mL) üzerinde. 5 mL&#39;lik fraksiyonları toplayın. </li><li> Her fraksiyonun 10 mcL kısımlarını alın ve Coomassie boyası ile MES SDS PAGE kullanarak analiz edin. 30 dakika süreyle sabit voltaj (20 V / cm) kullanarak jel çalıştırın. </li><li> S100A12 içeren havuz fraksiyonları. S100A12, bir denatüre edici jel üzerinde ~ 10 kDa protein ile çalışır. </li><li> Bir ultrafiltrasyon cihazı (MWCO 10 kDa) kullanarak fraksiyonları 5 mL&#39;ye konsantre edin. ~ 8 dakika boyunca 3000 xg&#39;de santrifüjleyin. En üstteki kesimi alın. </li></ol></li><li> Ebat-eksklüzyon kromatografisi <ol><li> S75 sütununu 1 CV (120 mL) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl ile dengeleyin. </li><li> &lt;5 mL konsantre S100A12 fraksiyonlarını enjekte edin (iyon değişim kromatografisinden). </li><li> Kolonu, 120 mL üzerinde 1 mL / m&#39;lik bir akış hızında geliştirin. 5 mL&#39;lik fraksiyonları toplayın. </li><li> Her fraksiyonun 10 uL&#39;lik bir alikotu alın ve Coomassie boyası ile SDS PAGE kullanarak analiz edin. Kullanarak protein kimliğini doğrulayınBatı leke veya kütle spektrometresi (10.575.0 Da monomerik alt biriminin hesaplanmış moleküler kütlesi, 10575.4 Da ölçülmüştür). </li></ol></li><li> Havuz fraksiyonları <ol><li> Bir spektrofotometre kullanarak A 280 proteininin absorbansını ölçün. SEC tamponunu boş olarak kullanın. S100A12 homodimeri için hesaplanan sönüm katsayısı 5960 M -1 cm &quot; 1&#39;dir. NOT: Tipik verim 50 mL kültür başına 35-45 mg S100A12&#39;dir. </li><li> Parçacık S100A12 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (1 mg / tüp) aktarılır, sıvı nitrojende flash dondurulur ve -80 ° C&#39;de saklanır. </li></ol></li></ol> 3. Antimikrobiyal Aktivite Testleri <ol><li> % 5 koyun kanı (kan agar plakaları) ile takviye edilmiş tamponlu soya agar plakalarına H. pylori suşu çizdirin. Oda havasındaki 37 ° C&#39;de% 5 karbon dioksit ile desteklenmiş 2-3 gün büyütün. </li><li> H. pylori&#39;yi 1x kolestrol ile desteklenmiş Brucella suyu içine aşılayın. Üzerinde kültürOda havasında 37 ° C sıcaklıkta gece sallayarak (250 dev / dak.)% 5 karbon dioksit ile takviye edilmiştir. </li><li> H. pylori 1: 10&#39;u% 50 Brucella suyu,% 50 kalprotein tamponu artı 1x kolesterol ve kültür ortamında tek başına veya 100 uM çinko klorür artı 0, 100 veya 1000 μg / mL arıtılmış S100A12 ile takviye haline getirin. Kültür oda sıcaklığında gece boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanarak (250 rpm)% 5 karbon dioksit ile takviye edildi. </li><li> Ertesi gün, seri seyreltmeler yapın ve kan agar plakalarına koyun. Bakteri kolonilerinin oda havasında 37 ° C&#39;de 2-3 gün boyunca% 5 karbon dioksit ile takviye edilmesine izin verin. S100A12 ve / veya eksojen çinko varlığında veya yokluğunda bakteri üremesini hesaplamak için koloni oluşum birimlerini numaralandırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A8+and+S100A9:+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity,+traditional+risk+factors,+and+cardiovascular+disease.">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+(DAMP)+receptors+in+vitro+and+in+vivo.">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).</li><li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves.">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li><li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines:+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells.">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li><li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins:+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes.">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li><li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling.">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li><li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+proteins+in+cancer.">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li><li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca2+/Zn2++signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine.">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li><li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-associated+S100+proteins:+new+mechanisms+that+regulate+function.">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li><li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+immunity+beyond+iron:+a+role+for+manganese+and+zinc.">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li><li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+Immunity:+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface.">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li><li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages.">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).</li><li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis.">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li><li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex:+implications+for+host-parasite+defence.">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li><li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc:+new+insights+into+S100A12+oligomerisation.">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li><li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+structural+states+of+S100A12:+A+key+to+its+functional+diversity.">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li><li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12.">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li><li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence.">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li><li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+in+health+and+disease.">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li><li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+genotypes,+host+factors,+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease.">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li><li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma.">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li><li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastric+precancerous+cascade.">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li><li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+cancer:+epidemiology+and+risk+factors.">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li><li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response.">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration.">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli.">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li><li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins.">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li><li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses.">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li><li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense,+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus.">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li><li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut.">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li><li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens.">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li><li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein.">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li><li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation.">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li><li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media.">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li><li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100+calgranulin+proteins+S100A8,+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children.">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li><li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

İnsan S100A12&#39;nin ekspresyonu ve saflaştırılması için etkili bir protokol sunulmuştur. E. coli ekspresyon sistemi, özellikle biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için mg miktarları gerektiğinde rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan en yaygın araçtır. Burada tarif edilen prosedürün anahtar geliştirilmesi, standart Luria besiyeri ortamı 18 ile ekspresyona kıyasla saflaştırılmış proteinin verimini neredeyse otuz kadar arttıran otomatik endük...

S100 proteinleri, çeşitli fonksiyon dizisine sahip 1 EF-el ailesi kalsiyum bağlayıcı proteinlerin bir sınıfıdır. Bunlar doku ve hücreye spesifik bir şekilde ifade edilir ve geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesini 2 , 3 düzenler. Kalsiyum bağlayıcı proteinlere özgü olan S100 proteinleri hem hücre içi hem de hücre dışı işlevleri gösterirler 4 , 5 . Hücre içinde, Ca 2 + bağlanması özellikle protein bağlama ortakları 6 hedefleyen bir hidrofobik yüzey ortaya bir yapısal değişiklik indüklenir. Bu hücre içi mekanizma hücre proliferasyonu, farklılaşma ve enerji metabolizması gibi önemli süreçleri düzenler. Ekstraselüler çevrede, S100 proteinleri iki işlev sergilemektedir 7 . Birinde, moleküler model (DAMP) proteinlerine hasar gibi davranırlar ve bir pro-inflammayı başlatırlarKalıp tanıma reseptörleri 8 , 9 ile etkileşim yoluyla bağışıklık cevabını ileri sürmek. Ek olarak, S100 protein sınıfının birkaç üyesi, geçiş metallerini, besleyici bağışıklık 10 , 11 olarak adlandırılan bir süreçte mikrobik patojenlere aç bırakmaya hizmet eden bir işlevi saklar. S100A12 (aynı zamanda calgranulin C ve EN-RAGE olarak da bilinir), makrofajlar ve nötrofillerde yüksek oranda eksprese edilir ve inflamatuar hastalıklar için potansiyel bir biyolojik belirteç olarak tanımlanmıştır 12,13. EF-Hand bölgelerinde kalsiyumu bağlamaya ek olarak, S100A12 dimer arayüzünün 14 , 15 karşı uçlarında bulunan iki yüksek afiniteli geçiş metali bağlama mevkisine sahiptir. Her bir bağlanma yeri, üç histidin kalıntısı ve bir aspartik asit kalıntısı içerir ve çinko veya bakır &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . Yakın zamanda, S100A12&#39;ye bağımlı çinko açlığın, Helicobacter pylori büyümesini ve pro-inflamatuar virulans faktörlerinin aktivitesini düzenleyen önemli olduğunu bildirdik. H. pylori , dünyadaki insan nüfusunun yaklaşık yarısının karnını enfekte eder; Bunu en başarılı bakteriyel patojenlerden biri haline getirir 19 . H. pylori ile enfeksiyon gastrit, peptik ve duodenal ülser, mukoza ilişkili lenfoid doku (MALT) lenfoma ve invaziv gastrik adenokarsinoma (mide kanseri) gibi önemli gastrik hastalık sonuçlarına yol açabilir. Karaciğer kanseri, dünyada kardiyovasküler kansere bağlı ölümlerin önde gelen sebebidir ve mide kanseri için tek büyük ilişkili risk faktörü H. pylori ile enfeksidir. H. pylori , gevrek olmasına rağmen mide nişinde devam ederBu bakteriyel enfeksiyonu kontrol altına almak için bağışıklık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç olduğunu vurguladı. H. pylori&#39;ye bağlı inflamasyon, enfeksiyon yeri 18 , 24 , 25&#39;de S100A12 de dahil olmak üzere antimikrobiyal proteinlerin bir repertuarını depolayan polimorfonükleer hücrelerin veya nötrofillerin derin infiltrasyonu ile karakterizedir. Ev sahibi ve patojen arasındaki karmaşık diyalogu anlamak için, S100A12&#39;yi saflaştırma tekniğini hassaslaştırmaya ve bu tıbbi açıdan ilgili patojene uyguladığı antimikrobiyal etkiyi incelemek için kullanmaya çalıştık. Aşağıdaki protokol, biyolojik açıdan aktif durumda S100A12 saflaştırması için geliştirilmiş bir tekniğin özetini vermektedir; Besleyici metalleri yüksek oranda bağlayabilenBunları işgal altındaki mikroorganizmalara toplayıp onları şelale haline getirin. Ayrıca, aşağıdaki yöntemler, bu proteinin, doğuştan gelen antimikrobiyal moleküllerin bakteriyel patojenlerin büyümesini sınırlandırdığı mekanizmayı incelemek için kritik bir reaktif olarak kullanılmasını vurgulamaktadır. S100A ailesindeki proteinler, konak savunmasının yanı sıra bağışıklık sinyalizasyonuna katılan doğal bir bağışıklık sistemi molekülünün önemli bir parçası olarak takdir kazanmışlardır. Bunların en iyi çalışılanı kalprotektindir (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin, dimer ara yüz 31&#39;de geçiş metallerini bağlayan S100A8 ve S100A9 alt birimlerinin bir heterodimeri oluşturan nötrofile bağlı bir proteindir. Calprotectin&#39;in iki metal bağlama sahasına sahip olduğu gösterilmiştir: Site 1, Zn 2+ , Mn 2+ veya Fe 2+ &#39;yi bağlayabilir ve Site 2,<html> Zn 2+ 31 , 32&#39;yi bağlayın . Calprotectinin, Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli ve H. pylori gibi çeşitli patojenlere karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini ve önleyici etkilerin calprotectin 25 , 28&#39;in metal şelasyon aktivitesinden kaynaklandığını gösteren çok sayıda rapor var. , 29 . Calprotectin, dış membrandaki lipit A yapısının değiştirilmesi, cag -Type IV salgılama sisteminin ( H. pylori içinde önemli bir proenflamatuar virulans faktörüdür) bastırılması, biyofilm oluşumuna neden olması ve bastırılması da dahil olmak üzere H. pylori üzerinde çok sayıda etkinlik sergilediğini gösterdi H. pylori büyümesi ve canlı dozu doza bağımlı bir şekildeClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Dahası, genetik ve biyokimyasal analizler, H. pylori&#39;ye karşı calprotectin&#39;in antibakteriyel etkisinin büyük oranda besleyici çinkoyu 25 bağlama yeteneğinden kaynaklandığını ortaya koymuştur. H. pylori , bu patojenin büyümesi ve çoğalması için mikrobesin gereksinimlerini belirlemek için kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam kullanan önceki araştırmalar tarafından belirlendiği üzere çinko gerektirir 34 . Buna ek olarak, kalprote- tein, H. pylori ile enfekte dokular içinde oldukça miktarda bulunur ve nötrofilik infiltratlarla ilişkili olup, konakçıya enfeksiyondan sonra inflamasyon sırasında kalprotektini antimikrobiyal bir strateji olarak kul- lanılabilir. Yansız proteomik tarama tekniklerinden elde edilen son bulgular, reaktif oksijen türlerinin bol olduğu koşullar altında, kalprotecKalay, hekza-histidin bağlanma yerini değiştiren, dolayısıyla proteinin metal bağlanma aktivitesini inhibe eden translasyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirir 36 . Bu nedenle, bu moleküllerin geniş repertuarındaki diğer S100A ailesindeki proteinlerin potansiyel olarak yardımcı metal-kıskaçlayıcılar olarak işlev görebileceğini varsaydık. Daha sonraki çalışma için S100A12&#39;yi seçtik çünkü söz konusu translasyon sonrası modifikasyon ekranı üzerinde tanımlanmadı, çinkoyu bağlama kapasitesine sahipti ve H. pylori ile enfekte olmuş kişilerden türetilen insan dokularında oldukça bol miktarda bulunur. Çalışmalarımız, S100A12&#39;nin, H. pylori&#39;nin G27 suşunda H. pylori büyümesini ve yaşayabilirliğini doza bağımlı bir şekilde inhibe edebildiğini ve bu proteinin antimikrobiyal aktivitesinin fazla besleyici çinko ilavesiyle tersine çevrilebileceğini gösteriyor. Bu çalışma, S100A12&#39;nin PMSS1 ve 7.1&#39;e karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini gösteren önceki çalışmamızı tamamlamaktadır3 suşu H. pylori , sayısız klinik izolelere ve laboratuara uyarlanmış H. pylori suşlarına karşı geniş antibakteriyel etkisini göstermektedir. Birlikte, bu sonuçlar S100A12&#39;nin besleyici bağışıklık yoluyla bakteri gelişimini ve proliferasyonunu kontrol eden bir mekanizma olarak önemini teyit eder. Bu önemli konak-bakteriyel etkileşimin gelecekteki çalışmaları arasında, konukçu dokulardaki bakteri yükünü azaltmak veya H. pylori enfeksiyonu bağlamında bu proteinin bağışıklık sinyalizasyonuna katkısını belirlemek için S100A12 aktivitesini kullanmak yer alabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 Expression&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Expression cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) competent cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Autoinduction medium components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Research Products International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>lactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Selection agent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 Purification&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start Chromatography System</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;H. pylori &lt;/em&gt;Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brucella broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

Calgranulin proteinleri doğal bağışıklığın önemli aracılarıdır ve EF el ailesinin kalsiyum bağlayıcı proteinlerin S100 sınıfının üyesidir. Bazı S100 proteinleri, geçiş metallerini yüksek afinite ile bağlama kapasitesine sahiptir ve bunları, &quot;beslenme bağışıklığı&quot; olarak adlandırılan bir süreçte mikrobiyal patojenlere işgal etmekten alıkoyar. S100A12 (EN-RAGE), hem çinko hem de bakırı bağlar ve makrofajlar ve nötrofiller gibi doğal immün hücrelerde oldukça bol miktarda bulunur. S100A12&#39;nin aktif, metal bağlayıcı konfigürasyonunda ekspresyon, zenginleştirme ve saflaştırma için rafine edilmiş bir metodu sunuyoruz. Bakteriyel büyüme ve canlılık analizlerinde bu proteinin kullanılması, S100A12&#39;nin bakteri patojeni Helicobacter pylori&#39;ye karşı antimikrobiyal etkinliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır . Antimikrobiyal aktivite, besleyici çinkoyu kenetleyen S100A12&#39;nin çinko bağlanma aktivitesine dayandığından, büyüme için çinko gerektiren H.pylori&#39;yi açlıktan besler ve proliferation.

S100A12 ifade ve saflaştırma Üç aşamalı bir saflaştırma 50 mL bakteri kültüründen ~ 40 mg rekombinant S100A12 üretti. İlk adım, endojen E. coli proteinlerinin amonyum sülfat çökeltilmesiydi. Bu aşamayı anyon değişim kromatografisi izledi ( Şekil 1A ). Protein, Coomassie Brilliant Blue ile boyanan bir SDS-PAGE ile izlenir ( Şekil 1B ). Saflaştırma...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12 at JoVE.com

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Burada, S100A12&#39;yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori&#39;ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biochemistry

Unit 1

Drugs for Peptic Ulcer Disease

SCIENTISTS IN ACTION

8.3K Görüntüleme.  Fisk University.  Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz. 

Video: Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, as well as interactions with several growth factors and cytokines. Overexpression of specific MMPs is responsible in several diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and cardiovascular disease. MMPs have been the center of attention recently as targets to develop therapeutics that can treat diseases correlated to MMP overexpression.
To study the MMP mechanism in solution, more facile and robust recombinant protein expression and purification methods are needed for the production of active, soluble MMPs. However, the catalytic domain of most MMPs cannot be expressed in Escherichia coli (E. coli) in soluble form due to lack of posttranslational machinery, whereas mammalian expression systems are usually costly and have lower yields. MMP inclusion bodies must undergo the tedious and laborious process of extensive purification and refolding, significantly reducing the yield of MMPs in native conformation. This paper presents a protocol using Rosetta2(DE3)pLysS (hereafter referred to as R2DP) cells to produce matrix metalloproteinase-3 catalytic domain (MMP-3cd), which contains an N-terminal His-tag followed by pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) for use in affinity purification. R2DP cells enhance the expression of eukaryotic proteins through a chloramphenicol-resistant plasmid containing codons normally rare in bacterial expression systems. Compared to the traditional cell line of choice for recombinant protein expression, BL21(DE3), purification using this new strain improved the yield of purified Hisx6-pro-MMP-3cd. Upon activation and desalting, the pro domain is cleaved along with the N-terminal His-tag, providing active MMP-3cd for immediate use in countless in vitro applications. This method does not require expensive equipment or complex fusion proteins and describes rapid production of recombinant human MMPs in bacteria.

His-tag purification, dialysis, and activation are employed to increase yields of soluble, active matrix metalloproteinase-3 catalytic domain protein expression in bacteria. Protein fractions are analyzed via SDS-PAGE gels.

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Biyokimya

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of sphingolipids in the cell membrane, is one of the best-characterized LPLs that regulates a variety of cellular physiological responses via signaling pathways mediated by sphingosine 1-phosphate receptors (S1PRs). This implicated that the S1P-S1PRs signaling system is a remarkable potential therapeutic target for disorders, including multiple sclerosis (MS), autoimmune disorders, cancer, inflammation, and even COVID-19. S1PRs, a small subset of the class A G-protein coupled receptor (GPCR) family, are composed of five subtypes: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, and S1PR5. The lack of detailed structural information, however, impedes the drug discovery targeting S1PRs. Here, we applied the cryo-electron microscopy method to solve the structure of the S1P-S1PRs complex, and elucidated the mechanism of activation, selective drug recognition, and G-protein coupling by using cell-based functional assays. Other lysophospholipid receptors (LPLRs) and GPCRs can also be studied using this strategy.

S1P exerts its diverse physiological effects through the S1P receptors (S1PRs) subfamily. Here, a pipeline is described to expound on the structures and function of S1PRs.

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fibrinolitik Bir Enzimin Sipunculus nudus'tan Afinite Kromatografisi ile Saflaştırılması

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

Yazar Spotlight: Sipunculus nudus'tan Fibrinolitik Bir Enzimin Afinite Saflaştırılması  

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Biyomühendislik

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for immune cell stimulations. This protocol is based on a two-step chromatography strategy, which comprises protein pre-purification on an anion-exchange chromatography column and a subsequent polishing step on a hydrophobic-interaction column. This strategy produces S100A12 protein of high purity and yield at manageable costs. For functional assays on immune cells eventual remnant endotoxin contamination requires careful monitoring and further cleaning steps to obtain endotoxin-free protein. The majority of endotoxin contaminations can be excluded by anion-exchange chromatography. To deplete residual contaminations, this protocol describes a removal step with centrifugal filters. Depending on the available ion-strength S100A12 can arrange into different homomultimers. To investigate the relationship between structure and function, this protocol further describes ion-treatment of S100A12 protein followed by chemical crosslinking to stabilize S100A12 oligomers and their subsequent separation by size-exclusion chromatography. Finally, we describe a cell-based assay that confirms the biological activity of the purified protein and confirms LPS-free preparation.

This protocol describes a purification method for recombinant tag-free calcium binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers for human monocyte stimulation assays.

İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Biyoloji

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

S100A12'nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Sfengozin 1-Fosfat Reseptörlerinin Yapılarını ve Sinyal Yollarını Araştırmak İçin Bir Boru Hattı

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme