Bu çalışma Doğa Bilimleri ve (MP NSERC, 401848-2011) Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. MP Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) bir kariyer ödülünü aldı. LE FRQ-S (FRQ-S 14D 29441) bir doktora burs alıcı oldu. Biz teknik yardım için Marie-Josée Wallman teşekkür ederim.

Etik Beyanı: hayvanların yer aldığı tüm protokoller Comité de Koruma des Animaux de l&#39;Université Laval tarafından onaylandı ve Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı (Ed 2.) Hayvan Bakımı Kılavuzu Kanada Konseyi çerçevesinde yapılmıştır. Burada açıklanan protokol yaklaşık 800 g yetişkin hayvanlar için optimize edildi. sabitleştirici hacimleri hayvanın büyüklüğüne göre ayarlanmalıdır. Transkardiyak perfüzyon için Çözümler hazırlanması 1. <ol><li> aşağıdaki aşamalara göre bir 50 mM sodyum fosfat-tamponlu salin (PBS) çözeltisi 1 L&#39;lik hazırlayın. perfüzyon önce en çok 24 saattir çözeltisi hazırlayın ve kullanılana kadar 4 ° C &#39;de devam edin. <ol><li> 1 L&#39;lik bir şişeye damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 5.87 g ekleme (Na2 HPO 4), monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 1.20 g (NaH2 4 · H2O) ve 9 grsodyum klorür (NaCI). çözülmeye karıştırınız. </li><li> 5 N NaOH eklenerek pH 7.4&#39;e ayarlanmıştır. 1 L&#39;lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle DİKKAT: NaOH aşındırıcı kimyasal bileşiktir. Uygun Kişisel Koruyucu Ekipman Wear (PPE;. Laboratuvar mont, eldiven, koruyucu gözlük, vs). </li></ol></li><li> aşağıdaki adımlara uygun olarak% 4 paraformaldehit (PFA) 2 L hazırlayın. Bu çözelti, ameliyattan önce en fazla 24 saat hazırlandı ve kullanılana kadar 4 ° C &#39;de tutulması gerekmektedir. <ol><li> 2 L&#39;lik bir kap içerisinde damıtılmış su, 1.5 L ölçülür. Dibazik susuz sodyum fosfat 23.48 g (Na2 HPO 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 4.80 g ekleme (NaH2 4 · H2O). çözülmeye karıştırınız. 2 L&#39;lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle </li><li> 55 ° C - sıcaklık yaklaşık 45 ulaşıncaya kadar bir havalandırma başlık altında çözelti ısıtılır. 60 ° C&#39;ye kadar ısıtın vermeyin. </li><li>Yavaş yavaş çözeltiye PFA 80 g ekleyin ve tümüyle çözülene kadar karıştırın (yaklaşık 30-60 dakika). 60 ° C&#39;nin altında tutmaya sıcaklığının kontrolü tutun. DİKKAT: PFA olarak toz formunda çok uçucudur. Gözler veya deri ile teması halinde çok zehirlidir ve solunum veya sindirim durumunda tehlikelidir. PPE Aşınma ve bir havalandırma başlık altında dikkatli bir şekilde kullanın. </li><li> 4 ° C ve filtreye çözeltiyi soğutun. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> aşağıdaki adımlara uygun olarak 0.1 M fosfat tampon (PB) içinde% 3 akrolein 1 L hazırlayın. PB solüsyon, perfüzyon en fazla 24 saat hazırlanmalıdır. DİKKAT: Acrolein teneffüs ve acil hasar meydana getirebilmektedir son derece toksiktir. Eğer deri yoluyla absorbe Ayrıca aşındırıcı ve son derece toksiktir. Bu kanserojen ve mutajen olduğunu. Uygun PPE giyin ve bir havalandırma başlık altında kullanın. <ol><li> damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 8.66 g ekleme (Na2 </alt&gt; HPO 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 5.38 g (NaH2 4 · H2O). Bütün tuzlar eriyene kadar karıştırın. 4 ° C&#39;de çözüm tutun 1 L&#39;lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle. </li><li> Ameliyat öncesi 1 L&#39;lik bir cam kaba PB çözeltisinden 900 mL kadar transferi ve bir havalandırma başlık altında% 97 akrolein çözeltisi 30.94 ml. 1 L ilave edin ve karıştırın toplam hacme ulaşmak için PB solüsyonu ekleyin. çözüm Filtre ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 2. transcardiac Perfüzyon ve Beyin Diseksiyon <ol><li> bütün cerrahi prosedür sırasında buz üzerinde çözüm tutun. (50 mM PBS) ve bir hava hortumu kalana kadar pompayı dönüm kullanılacak ilk çözelti içinde tüp yerleştirilmesi pompayı hazırlayın. bir makak maymunu transkardiyak perfüzyon için, bir 21 G iğne kullanımı ve çıkış yaklaşık 80 mL / dak ayarlayın. </li><li> bir karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile anestezi hayvanketamin (20 mg / kg), ksilazin (4 mg / kg) ve asepromazin (/ kg, 0.5 mg) Ture. izofluran (% 3) sedasyon altında hayvan bakımı. </li><li> Bir havalandırma masaya hayvanın uzuvları takın. </li><li> bir neşter ile, koltukaltı cilt kadar kaldırın. Karın kasları kesin. dikkatle hayati organlara kaçınarak yanal kaburga kesmek için ağır cerrahi makas kullanın. </li><li> Cerrahi makas ile diyafram kesip kalp açığa çıkarmak için göğüs kafesi yükseltmek. diyafram kesildiğinde kalp dakika içinde dayak durdurulmayacağından, hızla devam edin. </li><li> Bir neşter bıçağı ile perikard çıkarın ve sol ventrikül içine iğne takın. bir neşter ile, dikkatlice sağ atriyuma küçük eksizyonu olun. Hızlı bir şekilde 72 ml / dakika pompayı çalıştırmak ve iğneyi yerinde tutun. Mümkünse, kalp daha düşük düzeyde başını sahip olmak için hayvan yatırın. NOT: İğneyi eklerken interventriküler septumu delmek için dikkatli olun. <ol><li> rinsakciğer kadar PBS yaklaşık 300 mL &#39;si ile, e Kan, beyaz ve kan sağ atriyum gelir. </li></ol></li><li> hızlı, pompa durdurma% 3 akrolein çözeltisine hortumu / tüp transferi ve tekrar pompayı çalıştırın. Kalp atışını durduktan sonra yavaş yavaş 80 ml / dk pompalama hızını artırmak. akrolein çözeltisi yaklaşık 500 ml serpmek. </li><li> hızlı, pompayı durdurun% 4 PFA çözüm hortumu aktarmak ve tekrar pompayı başlatın. Bu adım, PFA, yaklaşık 1 L gerektirir. NOT: ön ayaklar bükülmezdir ve boyun sert olduğu zaman tespit tamamlanır. </li><li> kafasını kesip dikkatlice kafatasının dışında beyin teşrih. cerrahi aletlerle beyin zarar vermemeye özen gösterin. Beyin, uçuk (kan eser) ve katı (Şekil 1A) olduğu zaman perfüzyon en uygunudur. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 saat süresince% 4 PFA içinde sağlam beyin bırakın. </li><li> Seri olarak bir soğutma vibratome (4 ° C) ile beyin kesilmişve 50 um kalınlıkta bölümler halinde istenilen düzlemde PBS (0.1 M) (Şekil 1B) bunları toplamak. NOT: Bu adım, istenen protokole göre birçok yönden yapılabilir. Yarıküreleri kesme, ya da muhafaza bütün vibratome önce ayrılabilir. Beyin vibratome platformu için çok büyükse, daha küçük bloklar halinde kesilebilir. Bu aşamadan sonra, bölümler% 40 PB (50 mM),% 30 gliserol ve% 30 etilen glikol yapılmış bir antifriz solüsyonu içinde -30 ° C de, uzun bir süre boyunca saklanabilir. </li></ol> 3. İmünohistokimya Ön gömme (Şekil 1C) <ol><li> aşağıdaki gibi Tris-tamponlu salin içinde bir 4 L&#39;lik bir stok çözeltisi (TBS, 50 mM, pH 7.6) hazırlayın. <ol><li> , 4 L&#39;lik bir beher içinde damıtılmış su 2L ölçün trihidroksimetil aminometan ve 24.23 g ekleyin (THAM C 4H 11 NO 3) ve bir karıştırma çözülmesi için. </li><li> 1 N HCI, yaklaşık 148 mL &#39;si ile 7.6 arasında pH ayarlayın. asit cauti ile eklenmelidirile 7.6 altındaki bir pH değerine ulaşılana önlemek için. Toplam hacim olmalıdır 4 L DİKKAT: HCl aşındırıcı etkisi. Uygun PPE giyin. </li></ol></li><li> ilgi alanı ihtiva eden (aşama 2.11) bölümleri seçin EM imünohistokimya için işlenecek. </li><li> antifriz solüsyonu durulama, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde serbest yüzen bölümler 3x (0.1 M, pH 7.4) yıkanır. </li><li> PBS içinde seyreltilmiş NaBH4 bir% 0.5 çözelti hazırlayın. <ol><li> NaBH4 0.05 g tartın ve 10 ml PBS içinde seyreltin. Kapatma. Kullanımdan hemen önce bu çözelti hazırlayın. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için taze hazırlanmış NaBH4 çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. Kapatma. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle PBS içinde yıkama 3x, reaksiyon gazının hiçbiri kadar kuvvetli bir şekilde sallanan kalır. </li><li> % 2 göre normal serum ve PBS içinde sulandırılmış% 0.5 soğuk balık jelatininin EM için bloke edici bir çözelti hazırlayın. NOT: Miktar shouliçin hesaplanır d Aşağıdaki üç adım için yeterli olması. ikincil antikor barındıran aynı hayvan türlerinden oluşan bir serum kullanın. bu yöntemler, önemli ölçüde doku kalitesini tehlikeye antijen alma yöntemleri ya da Triton az miktarda ilave kullanımını önlemek, (antikorlar penetrasyonunu artırmak için). </li><li> Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici çözelti içinde bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. </li><li> bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş primer antikor çözeltisi hazırlayın. Not: Primer antikor konsantrasyonu, genel olarak LM immünohistokimya ile aynıdır, ancak bazı birincil antikorlar akrolein çalışmayabilir olarak, daha önce farklı bir antikor konsantrasyonları ile testler düşünün. (-% 2 0.1) ve transkardiyak perfüzyon için% 4 PFA ve benzer sonuçlar elde Eğer öyleyse, o glutaraldehit bir karışımını kullanmak da mümkündür. inkübasyon süresinin ve sıcaklığın yanı sıra duruma getirin. </li><li> Primer antikor solüsyonu içinde bölümleri inkübegece boyunca hafifçe çalkalanarak ilave edilir. önceden test edilmiş inkübasyon süresi ve sıcaklığı kullanın. </li><li> hafif sallama ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde bölümleri 3 kez yıkanır. </li><li> bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor 1000 çözeltisi: Bir 1 hazırlayın. NOT: ikincil antikor birincil bir antikor üretmek için kullanılan konakçı türlerine karşı yükseltilmelidir. </li><li> Oda sıcaklığında 1.5 saat için ikincil antikor çözeltisinin bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. </li><li> en az 60 dakika önce ikincil antikor inkübasyonun sonunda bir avidin-biyotin-peroksidaz (ABC) çözeltisi hazırlayın. <ol><li> A ve B solüsyonlarının 8.80 uL / ​​mL ölçmek ve PBS içinde seyreltilmesi, kalibre edilmiş bir pipet kullanın. </li><li> avidin ve biyotin molekülleri arasındaki bağlanma tamamlaması izin vermek için oda sıcaklığında en az 60 dakika boyunca hafif sallayın. </li></ol></li><li> İkincil antikor çözeltisi içinde inkübe edildikten sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde 3 kez yıkanır. </li><li> böylece ABC bölümleri inkübeOda sıcaklığında 1 saat boyunca Devriminin. hafifçe sallayın. </li><li> hafif sallama ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile TBS içinde bir kez PBS ile iki kez yıkanır. </li><li> TBS içinde seyreltilmiş% 0.005 H2O 2% 0.05 3,3&#39;-diaminobenzidin (DAB), taze bir çözelti hazırlayın. <ol><li> DAB 12.5 mg tartılır ve soğuk TBS 25 mL seyreltik. Işıktan koruyunuz. DİKKAT: Solunması DAB tozu çok uçucu ve zararlıdır. Bu karsinojenik ve teratojenik olduğunu. seyreltilmiş Dolayısıyla, hamile veya emziren kadınlar bile, bu ürünü manipüle olmamalıdır. işlenirken bir N95 maskesi kullanın ve PPE giyerler. </li><li> Çözelti süzülür ve kullanımdan hemen önce,% 30 H2O 2 4.5 uL ekleyin. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika ila 7 DAB çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. NOT: kahverengi çökelti arka plan boyama yüksek düzeyde önlemek için çok karanlık olmamalıdır. İnkübasyon süresi buna göre optimize edilmelidir. </li><li> hızla iki kez yıkayarak reaksiyonu durdurunSoğuk TBS içinde, daha sonra iki kez oda sıcaklığında, soğuk TBS içinde 10 dakika kadar hafif bir sallama ile PB iki kez 10 dakika, ardından. Not: PB (olup PBS) kullanımı, osmiyum ve form kristalleri ile tepkimeye gibi, NaCI izlerini ortadan kaldırmak için kritiktir. </li></ol> Elektron Mikroskobik Gözlem 4. Osmification ve katıştırma <ol><li> PB içerisinde seyreltilmiş,% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi (OsO 4) hazırlanması. Işıktan koruyunuz. DİKKAT: Osmiyum çok zehirlidir ve deri, gözler ve ağız ile temas etmemelidir ve teneffüs edilmemelidir. Şayet yutulursa ölüme neden olabilir. Sadece bir havalandırma başlık altında ve uygun KKD ile kullanılmalıdır. </li><li> (Çalkalama olmaksızın) havalandırma başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca OsO 4 çözelti içinde bölümleri inkübe ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapak. Tamamen OsO 4 çözümü eklemeden önce bölümleri dümdüz. NOT: bölümler çok karanlık ve ri halinegid ve bu adımda aşağıdaki dikkatle manipüle edilmelidir. </li><li> osmification sırasında su geçirmez bir epoksi reçinesi hazırlayın. <ol><li> büyük bir plastik bardağa epoksi reçine karışımı (epoksi reçinesi 20 g, sertleştirici 20 g, hızlandırıcı 0.6 g ve plastikleştirici 0.4 g) her bir bileşenin uygun miktarlarını ekleyin. homojen kahverengi bir renk elde edilene kadar ağaç dalını ya da plastik bir pipet ile karıştırılır. NOT: Her bileşenin kesin oranını kullanmak için kritik öneme sahiptir. </li><li> Uygun boyutlarda alüminyum bardak eşit miktarlarda transfer, bölümlerin sayısına bağlı olarak işlenecek. o dinlenmeye bırakın. </li></ol></li><li> osmificated bölümler düşük hızlı sallanarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PB 3 kez yıkanır. </li><li> 2 dakika her biri için derecelendirilmiştir etanol aşağıdaki dizi bölümleri kurutmak:% 35 etanol içinde 2 kez; 1 saat 50 içinde, her biri 70, 80, 90, ve% 95 etanol; ve% 100 etanol içinde 3 kat. </li><li> dehydrati tamamlamak için cam şişe için bölümleri aktarınpropilen oksit içinde 2 dakika boyunca bölümlerini 3 kez inkübe edilerek süreci. DİKKAT: Propilen oksit çok uçucu ve toksik organik çözücüdür. Bu temas etmesi halinde veya solunması veya yutulması gözlere veya deride ciddi hasara neden olabilir. Bu bir sınıf 2 kanserojen madde olarak sınıflandırılmıştır. Sadece bir havalandırma başlık altında ve KKD ile kullanılmalıdır. Ayrıca son derece yanıcı ve uzak herhangi bir ısı kaynağından tutulmalıdır. Not: propilen oksit, organik bir çözücü madde ve plastik ile uyumlu olduğu Bu aşamadan önce, bölümler dikkatle cam şişelere transfer edilmelidir. Bu noktada, bölümler çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir. Bölümler, alternatif olarak 4.5 aşamasından önce cam şişelere transfer edilebilir. </li><li> dikkatle Transferi bölümleri, alüminyum bardak birer birer ve mümkün olduğunca hava ile temasını engellemek. Düz gömmek önceden karıştırılmış olan su itici, epoksi reçinesi bölümleri ve VENTIN altında gece boyunca inkübeOda sıcaklığında g başlık. NOT: Bu adımda, bölümler tamamen susuz ve çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir. </li><li> mineral yağ kullanılarak, yağlanmış plastik lamelleri ile birlikte yağ kaplı cam slaytlar hazırlar. </li><li> en 12-15 dakika boyunca 60 ° C de, alüminyum bardak inkübe edilerek reçine yumuşatın. Dikkatle cam slayt yağlanmış tarafında bölümleri düzleştirmek. yağlanmış lamel yerleştirin ve dikkatlice kalan havayı dışarı itmek. </li><li> 48 saat boyunca 60 ° C &#39;de slaytlar inkübe edin. NOT: Reçine çok zor olacağından, 48 saat inkübasyon süresi aşmayacak şekilde Bu kritik öneme sahiptir. </li><li> plastik lamel çıkarın. </li></ol> Geçirimli Elektron Mikroskobu kullanılarak Ultra ince Kesit ve Gözlem 5. Numune Hazırlama <ol><li> Ilgi bölgeyi bulmak için dürbün kullanın ve bir neşter ile yaklaşık 1 mm 2 küçük dörtgen bir parça kesti. </li><li> bir reçine bloğun uç dosya ve qu tutkaladrangular bir parçanın üzerine (Şekil 1C). Tutkal, en azından 1 saat ya da kesit önce gece boyunca kurumaya bırakın. </li><li> Bir ultramikrotom kullanılarak, 80 um-kalınlıkta bölümler (Şekil 1D) içine dörtgen parça kesin. <ol><li> kademeli düz kenarlara sahip bir yamuk oluşturmak için reçine bloğun her tarafı kesilmiş, keskin bir tıraş bıçağı kullanılarak, dikey konumda bir ultramikrotom güverte reçine blok yerleştirin ve. </li><li> yatay konumda üst koyun ve trapezoidin uzun kenarı aşağı doğru bakan kadar blok döndürmek. </li><li> dörtgen parçanın yüzeyini kesmek için bir elmas kırpma aracı veya bir cam bıçak kullanın. ultramikrotom / s, 1 mm, 300 mikron kalınlığında kesitler kesilmiş olarak ayarlayın. dikey olarak dört köşeli bir parça olarak paralel ve yaklaşık olarak 1 ° &#39;lik bir çok küçük bir yatay açı göstermek için bıçak ayarlayın. NOT: Bu açı hemen hemen b yüzeyine paralel kullanıcı doku yaklaşım sağlayacakimmunolabeled elemanlar bulunabilir olasılığı daha yüksek olduğu, kilitleyin. Elmas kırparak aracıyla bu parametreleri kullanırken, reçine parlak beyaz rengi görüntüler. Doku kesiliyor olduğunda, mor ya da yeşilimsi bir renge dönüşür. </li><li> ksilen içinde uçlu emici kağıt bir parça ile üzerinden geçen bölümler arasında pürüzsüz, 80 um kalınlığında kesitler kesmek için damıtılmış su ile dolu bir tekne ile donatılmış bir Ultra 45 ° elmas bıçak kullanarak ve formvar kaplı nikel yuvası ızgaralar ya da seri bölümlerini toplamak çıplak 150 örgü bakır ızgaralar (Şekil 1 E). </li></ol></li><li> bir ızgara, muhafaza kutusu ızgaraları yerleştirin. </li><li> kurşun sitrat ile ızgaralar leke. <ol><li> 1 filtre kurşun sitrat stok çözeltisi çözeltisi ve filtre edilmiş, damıtılmış su: 5 ml şırınga ve bir 1 hazırlanması için bir 0.2 um şırınga filtresi kullanın. Işıktan koruyun. NOT: kurşun sitrat stok çözeltisi katı DEPOS oluşumunu önlemek için her ay taze yapılmalıdıronun. Stok tarifi için malzeme bir fiş bakınız. ızgaraları birçok dizi lekeli gerekiyorsa o sütlü hale Buna ek olarak, seyreltilmiş çözelti değiştirin. </li><li> çözelti ile temas halinde bölümü ile seyreltilmiş bir çözelti damla üzerine her bir ızgara yerleştirin. 3 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> ızgara tutmak için küçük cımbız kullanarak ve damıtık su içeren iki kap içinde durulayın. </li><li> hafifçe emici kağıt kullanarak fazla su çıkarın. bir ızgara kutusuna ızgaraları saklayın. (Şekil 1F TEM) Transmisyon Elektron Mikroskobu ile bölümleri incelenerek 30 dakika önce bekleyin. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu makalede, insan-olmayan primatlar ve EM örnek incelenmesi için uygun ön gömme immünohistokimya ile transkardiyak perfüzyon için güvenilir bir protokol mevcut. Örneğin CEMOVIS gibi tipik cryo-EM, beyin yapısı ile ilgili iyi bir koruma sağlar, ancak, aynı zamanda, immünohistokimya 12 kullanımını sınırlar. Kriyo-değiştirme ve Tokuyaso tekniği de dahil olmak üzere başka teknikler, immünohistokimya gömme sonrası sağlar, ancak bu teknikler, işlem sırasında gerekli ola...

Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Işık mikroskopisi, 2, diğer şeylerin 1 arasında vivo nöronal süreçlerde okuyan için etkin bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Işık Mikroskobik (LM) seviyesinde tipik uzamsal çözünürlük gibi aşırı ultraviyole ve yumuşak X-ışını mikroskopi için farklı ışık kaynaklarını kullanarak yaklaşık 200 nm, son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler olmasına rağmen, özellikle bir, yaklaşık 10 nm uzaysal çözünürlük 3, bu çözünürlük artmıştır , 4, 5. Görüntülemede Diğer teknolojik gelişmeler histoloji ile manyetik rezonans görüntüleme birleştirildi ve in vivo olarak miyelin kılıfının sadece Elektron Mikroskobik (EM) seviyesi 6, 7, geleneksel olarak ölçülebildiği bir parametre kalınlığının ölçülmesi için yeni bir yöntem sağlamaktır içerir. AlthouGH LM seviyesinde bu gelişmeler, örneğin, sinaptik temasların olarak yaşayan işlemleri, yapıları detaylı bir görünümünü ve karakterizasyon incelenmesi için mükemmel bir araç sağlar, 0.5 nm ulaşabilir çözünürlüğe sahip EM ile elde edilebilir. Bununla birlikte, EM seviyesinde gözlem hücre mimarisini korumak amacıyla, kimyasal tespit ve dehidrasyon işlemleri ile, bazı açılardan, ölü ve değiştirilmiş olduğu numuneler gerektirir. Bu nedenle, yüksek çözünürlükte biyolojik örneklerinin incelenmesi bağlı radyasyon elektron ışını hasar, düşük kontrast, membranların yapısal sapma, ya da 8, 9, 10 gömme aşağıdaki dehidrasyon ve epoksi oluşabilir eserler da varlığına zor olabilir. Yapısal analiz için kendi doğal biçiminde numuneler koruma &quot;Vitrifiye Kısımların Krio-EM&quot; kullanılarak veya CEMOVIS bir kesit bir yaklaşım ile elde edilebilirhızlı dondurma ve camsı buz numune yerleştirme ve bir kriyojenik sıcaklık 11, 12 EM bölümü altında incelenmesi ile. Onlar hala sağlam ve tam sulu iken Bu prosedür böylece dehidrasyon nedeniyle eserler ortadan kaldırarak 13 işlediğinde, numunelerin incelenmesi için izin verir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli ek harcamalar, çok düşük sıcaklıklarda, bu gözlem olanak sağlamak amacıyla, kriyo-ultramikrotom için ilave cihazlar, hem de standart EM ek aygıtları kapsamaktadır. Buna ek olarak, CEMOVIS yaklaşım antikorlar genellikle oda sıcaklığında inkübe edilmesi gerekir, çünkü teknikleri ile immün kullanımını engeller. Seçenek olarak ise, kriyo-koruyucu kimyasal immerged ve inci ise cryo sabit Numuneler çözülür sırasında dondurularak ikame yaklaşım kullanılarak immünohistokimyasal prosedürlere ultrastrüktürel analiz birleştirmek mümkündürtr Böyle Lowicryls gibi özel reçineler, gömülü. Post-gömme immunolabeling sonra böyle materyal 12 üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, dondurularak ikamesi ve cryo-sabitleme teknikleri zaman alıcıdır. Bunlar, ilave donanım takılmasını gerektirir ve düşük bir sıcaklıkta 14, 15 kullanımına rağmen, bir organik çözücü ve hücre mimarisini değiştirebilir kimyasal sabitleyici maruz kalması örnekleri gerektirir. Bu nedenle, özellikle akrolein LM ve EM DÜZEYİ, beyin dokusunun kimyasal sabitleme, her ikisi de tüm teknolojik ilerlemelere rağmen, EM 16 immünohistokimya birleştirmek için bir düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlayan bir yöntem olmaya devam etmektedir. Son birkaç on yılda, birçok girişimde iyi doku korunmasını sağlayan aldehitlerin karışımı bulmak için yapılmıştır. 1960&#39;lardan önce, EM için kabul edilebilir sonuçlar vermiştir sadece kimyasal sabitleyici ozmiyum tetroksit oldu. Bununla birlikte, ozmiyum tetroksit beyin gibi organları düzeltmek için damar sistemi aracılığıyla kullanımını engelleyen, son derece zehirli ve pahalıdır. Akrolein hücresel yapıların 17 EM, gözlem için uygun hayvan doku koruması için güvenilir bir yöntem olarak 1950&#39;lerin sonlarında tanıtıldı. Bu daha derin doku nüfuz eder ve daldırma ile fiksasyonu için ve doku 17 minimum çekme sitoplazmik bileşenlerin iyi bir koruma sağlar, diğer aldehitler daha hızlı bir şekilde tepki verir. Bu tür enzimler ve diğer proteinleri 18 gibi moleküler bileşiklerin, canlı daha doğru bir lokalizasyonu ile, taze doku kullanıldığında Böyle bir özellik akrolein fiksasyon başka aldehitlerle üzerinde açık bir avantaj sağlar. Gerçekten de, bu etkin bir stabilitesine sahip olarak, Kurbağa ve kemirgenler de dahil olmak üzere pek çok türde, EM seviyesinde görselleştirme için fiksasyon kolay, verimli ve düşük maliyetli bir yöntem olarak yıl boyunca doğrulanmıştırzes peptidler ve proteinler, antijenitesini muhafaza eden ve 16, 18, 19, 20, 21 tespit maddesi bir aldehit ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman nispeten sağlam ultrastrüktürel sağlar. Kemirgenlerde akrolein tespit için protokoller o zamandan beri standardize edilmiş ve EM 16, 22 için çift immunolabeling uygulamak, özellikle Pickel grup tarafından, yoğun kullandık. Birkaç grupları insan olmayan primat beyin dokusunda 23 akrolein fiksasyonunu kullandık. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, verimli EM 24 immunolabeling uyumlu insan olmayan primatlarda akrolein ile kimyasal fiksasyonunu açıklayan tek yayınlanmış protokol vardır. Bu makalede, verimli kimyasal olarak uğultu düzeltmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlamaktırile immün ve iletim EM inceleme öncesi gömme birlikte, potansiyel olarak uzun süreli korunması için izin akrolein bir primat beyinler.

<table><tbody><tr><td>Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>EM Science</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxymethyl aminomethane (THAM)</td><td>Fisher scientific</td><td>T370-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590-1</td><td>5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.</td></tr><tr><td>Acrolein (90%)</td><td>Sigma</td><td>110221</td><td>3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.</td></tr><tr><td>Autopsy venting table</td><td>Mopec</td><td>CE400</td><td></td></tr><tr><td>Electronic perfusion pump</td><td>cole parmer</td><td>masterflex L/S 7523-90</td><td></td></tr><tr><td>Needle (perfusion)</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>NN-1838R</td><td>18 G 11/2</td></tr><tr><td>Needle</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>NN-2713R</td><td>21 G 1/2</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td></td><td></td><td>20 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>4 mg/kg</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td></td><td></td><td>0.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Feather&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; lance</td><td>201011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; J9913</td><td>No.22 for surgery and No. 11 for EM</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td>Calibrate blade before each use, when the device allows it</td></tr><tr><td>Vibratome razor blade</td><td>Gillette</td><td>GIN 642107</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td>30% dilution</td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>Fisher scientific</td><td>E178-4</td><td>30% dilution</td></tr><tr><td>Sodium borohydride (NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S-9125</td><td></td></tr><tr><td>Normal horse serum (NHS)</td><td>Jackson immunoResearch Laboratories</td><td>008-000-121</td><td>2% dilution</td></tr><tr><td>Cold-fish gelatin</td><td>Aurion</td><td>900.033</td><td>0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%</td></tr><tr><td>Primary antibody, SERT</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>SC-1458</td><td>1/500 dilution</td></tr><tr><td>Primary antibody, ChAT</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>AB144P</td><td>1/25 dilution</td></tr><tr><td>Primary antibody, TH</td><td>ImmunoStar</td><td>22941</td><td>1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Biotinylated secondary antibody, goat</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-9500</td><td>1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Biotinylated secondary antibody, mouse</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-2000</td><td>1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Vectastain elite ABC kit</td><td>Vector laboratories</td><td>PK6100</td><td>8.8 &amp;micro;L/mL of A and B each</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td>0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.</td></tr><tr><td>Peroxide (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;) 30%</td><td>Fisher scientific</td><td>H-323</td><td>0.005% dilution</td></tr><tr><td>Osmium tetroxide (OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Electron microscopic science</td><td>2% 19152&lt;br /&gt;4% 19150&lt;br /&gt;</td><td>Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.</td></tr><tr><td>Durcupan water-repellent epoxy resin</td><td>Sigma</td><td>A: M epoxy resin (44611)&lt;br /&gt;B: hardener 964 (44612)&lt;br /&gt;C: accelerator 960 (DY 060) (44613)&lt;br /&gt;D: plasticizer (44614)&amp;nbsp;</td><td>Polymerize 48 h at 58 &amp;deg;C before throwing in waste.</td></tr><tr><td>Alumium cups</td><td>Electron microscopic science</td><td>70048-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>commercial alcohols</td><td>1019C</td><td>Dilute in distilled water with appropriate concentration</td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Electron microscopic science</td><td>20401</td><td>Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.</td></tr><tr><td>Non-coated medium glass slides</td><td>brain research laboratories</td><td>3875-FR</td><td>Grease surface with mineral oil</td></tr><tr><td>Plastic film (Aclar embedding film)</td><td>Electron microscopic science</td><td>50425-25</td><td>Grease surface with mineral oil</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica UC7</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Diamond trimming tool (ultratrim)</td><td>Diatome&amp;nbsp;</td><td>UT 1081</td><td>Can use glass knife alternatively</td></tr><tr><td>Ultra 45&amp;deg; Diatome Diamond knife</td><td>Diatome&amp;nbsp;</td><td>MC13437</td><td>equipped with a boat</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher scientific</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>150-mesh copper grids</td><td>Electron microscopic science</td><td>G150-cu</td><td></td></tr><tr><td>grid-box</td><td>Electron microscopic science</td><td>71138</td><td>Can store up to 100 grids</td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Anachemia</td><td>81983</td><td></td></tr><tr><td>Lead nitrate</td><td>Sigma</td><td>L-6258</td><td>Make a stock solution of lead citrate made of 1.33&amp;nbsp;g of lead nitrate and 1.76&amp;nbsp;g of sodium citrate diluted in 42&amp;nbsp;mL of preboiled and cooled distilled water to which 8&amp;nbsp;mL of 1&amp;nbsp;N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>terumo&amp;nbsp;</td><td>SS-05L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Corning</td><td>431222</td><td>0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Absorbing paper (bibulous paper)</td><td>Electron microscopic science</td><td>70086-1</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Laboratory film</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of non-human primate brain tissue for pre-embedding immunohistochemistry and electron microscopy

ışık mikroskobu düzeyinde tüm teknolojik gelişmelere rağmen, elektron mikroskobu böyle sinaptik kişiler gibi nöronların, ultrastrüktürel ve morfolojik ayrıntılarını incelemek ve karakterize edilmesi sinirbilimindeki tek uygulama. elektron mikroskobu için, beyin dokusunun iyi koruma titiz kriyo-sabitleme yöntemleri ile elde edilebilir, ancak bu teknikler oldukça maliyetlidir ve tanımlanan nöronal sistemler arasında bağlantı anlamak önemlidir immunolabeling kullanımını sınırlar. Dondurularak ikame yöntemleri immunolabeling ile kriyo-tespitin bileşimini sağlamak için geliştirilmiştir. Ancak bu metodolojik yaklaşımların tekrarlanabilirlik genellikle masraflı donma cihazlarda dayanır. Üstelik bu teknikle güvenilir sonuçlar elde çok zaman alıcı ve beceri zorlu olduğunu. Bu nedenle, özellikle akrolein sabitleyici geleneksel kimyasal sabit beyin, elektron birleştirmek için bir zaman etkili ve düşük maliyetli bir yöntem olmaya devam etmektedirimmünhistokimya ile mikroskopi. Burada, primat beyin dokusunun korunması yol açar ve immünohistokimya ve transmisyon elektron mikroskobik inceleme öncesi gömme uyumlu kimyasal akrolein fiksasyonu ile güvenilir bir deney protokolü sağlar.

Bu bölümde, kimyasal olarak% 3 akrolein karışımı% 4 PFA ile sabitlenmiş immüno primat beyin dokusu, iletim EM seviyesinde, gözlem yapıldıktan sonra elde edildi temsili sonuçları sunulmaktadır. Nispeten sağlam miyelin kılıfının ve çift zarlar (Şekil 2A) düzgün görselleştirme ile gösterildiği gibi, yapısı ile ilgili iyi bir koruma elde etti. Mikro nöronal maddelerle birlikte, sinaptik iletişim bilgileri, kolayca (Şekil 2B) t...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

preparation-non-human-primate-brain-tissue-for-pre-embedding

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K Görüntüleme.  Université Laval.  Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için. 

Video: Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nörobilim

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Biyomühendislik

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

Beyin Bankacılık: Araştırma Örneklerinin En iyi şekilde

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Biyoloji

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Gelişim Biyolojisi

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...