This paper is based on work supported by the National Health Research Institutes (NHRI) in Taiwan under the Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), the Taiwan Ministry of Science and Technology (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), the Academia Sinica Thematic Project (AS-105-TP-A06), and the Research Program in Nanoscience and Nanotechnology. The authors would like to thank Ms. Rachel A. Lucas for proofreading the manuscript.

Mikroakışkan Aygıt 1. Fabrikasyon NOT: Tüm mikroakışkan cihaz yumuşak litografi çoğaltma kalıplama işlemi 13 kullanılarak imal edilir. <ol><li> Mikroakışkan cihaz PDMS katmanları için kalıp imalatı <ol><li> mikroakışkan kanal desenleri piyasada mevcut illüstrasyon kullanarak veya çizim yazılımı tasarlayın. 14 baskı yüksek çözünürlüklü şeffaflık photomask için bir şirkete dosyayı gönderin. </li><li> Aseton (≥99.5%), izopropil alkol ile temiz silikon gofret (IPA, ≥99.9%) ve etch tamponlu oksit (boe; 6: 1 NH4 F.HF). deiyonize (DI) su ile durulayın ve bir azot tabancası ile gofret kurutmak. </li><li> Negatif sesi Fotorezist Spin kat yaklaşık 20 g, SU-8 2050, 15 saniye için 500 rpm&#39;de gofret üzerine ve daha sonra 2,000 rpm&#39;de 30 saniye için. NOT: spin kaplama koşulu SU-8 2050 fotoğraf vermelidiroptik litografi sonra yaklaşık 75 mikron gofret üzerinde bir kalınlığa sahip katmanları karşı. </li><li> Yumuşak fırında 65 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerindeki gofret 3 dakika boyunca ve daha sonra 9 dakika süreyle 95 ° C de. Yumuşak fırında sonra, UV ışığı altında tasarlanmış şeffaflık maskeleri ile bir maske hizalama kullanarak gofret maruz; toplam maruz kalma enerjisi yaklaşık 300 mJ / cm 2 olmalıdır. Maruz kalma sonrası fırında (PEB) 65 ° C &#39;de gofret, 2 dakika ve daha sonra da 7 dakika süre ile 95 ° C&#39; de. </li><li> PEB sonra mutlaka çalkalama ile ya da ultrasonik banyosuna 7 dakika boyunca (37 kHz ve 180 W etkili bir ultrasonik güç) SU-8 geliştirici gofret bırakın. Kalan SU-8 kaldırmak için aseton ve IPA ile gofret durulayın. </li><li> yonga ve silan 100 ul (1 H, 1 H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) istenmeyen yapışmayı önlemek için ince bisküvi yüzeyi silanizasyon bir diyaframlı vakum pompası ile bağlantılı bir desikatör içinde 6 cm çapında Petri kabı içine. , 15 dakika süreyle pompa açmak kapatmakVe 30 dakika boyunca bir vakum desikatörde mühür. </li><li> desikatöre dışına Silanlanmış gofret alın ve aşağıdaki ekran litografi işlemi için 15 cm çapında Petri onları bant: </li></ol></li><li> İmalat ve PDMS tabakalarının takımı <ol><li> PDMS nin önceden polimerin hazırlanması <ol><li> 10 PDMS monomer (baz) ve sertleştirme ajanı karıştırın: 1 oranında (hac / hac). 60 dakika desiccator kurulumunda karışımı Degas. </li></ol></li><li> PC-gömülü üst tabakanın imalatı <ol><li> Üst tabaka akışkan kanal desenleri ile kalıp üzerine PDMS pre-polimer transferi 2 gr PDMS ince bir tabaka yapmak. 60 dakika boyunca gazının PDMS desiccator kurulumunda kalıp yerleştirin. </li><li> PDMS kür için bir 60 ° C fırında kalıp gecede yerleştirin. Kalıp yatay bir düzlem üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Oda sıcaklığına kadar kalıp serinleyin. kalıp üzerine PDMS nin önceden polimer ek bir 13 g dökün ve th PDMS şekilde gaz60 dakika için e desiccator kurulumu. </li><li> Yavaş yavaş bir gaz difüzyon bariyeri olarak taze PDMS tabakası içine 1 mm kalınlığında PC filmi embed; Gerekirse kabarcıkları sınırdışı. </li><li> 60 ° C fırında kalıp gecede koymak ve yatay bir düzlem üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Oda sıcaklığına kadar tedavi PDMS serinleyin. Tüm kanal desenleri kapsayabilir yaklaşık 5,5 x 5 cm 2 &#39;lik bir alana, bir neşter cihazı kesti ve kalıp PDMS levha soyulabilir. </li><li> 2 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak giriş ve çıkışları için delikler. uzakta sonra montaj için ortamdaki toz imal üst PDMS-PC katmanı saklayın. </li></ol></li><li> alt PDMS tabakanın imalatı <ol><li> Alt tabaka için kalıp üzerine PDMS nin önceden polimerin 11 g dökün. 60 dakika boyunca gazdan arındırın PDMS desikatör içinde kalıp yerleştirin. PDMS tedavisi için bir 60 ° C fırın içinde, kalıp bir gece boyunca devam edin. yatay bir düzlemde olduğundan emin olun. </li><li> th soğumasınıOda sıcaklığına kadar e PDMS. Tüm kanal desenleri kapak ve kalıp kapalı soyulması yaklaşık olarak 5,5 x 5 cm 2 &#39;lik bir alana, cihazı kesin. uzakta sonra montaj için ortamdaki toz imal alt PDMS katmanı saklayın. </li></ol></li><li> PDMS membran imalat <ol><li> Spin kat, yaklaşık 4 90 sn için, 100 rpm&#39;de bir silanize boş gofret üzerine PDMS nin önceden g polimer ve daha sonra 4 saniye boyunca 3000 rpm. fırını içinde gece boyunca 60 ° C&#39;de spin kaplı gofret fırında. </li></ol></li><li> cihazın montajı <ol><li> Fabrikasyon PDMS-PC üst tabaka ve yapıştırma yüzeyleri yukarı bakacak şekilde bir O 2 plazma yüzey işleme makinesinde spin kaplı PDMS membran ile gofret yerleştirin. 40 sn için O2 plazma B 90 PDMS yüzeylerin muamele. </li><li> Sağ O 2 plazma yüzey tedaviden sonra PDMS membran üzerine üst katmanı bağlamak. gümrüklü katmanları üst üste bir ağırlık (yaklaşık 600 gr) yerleştirin ve onları koymakbağlanmayı teşvik etmek için 60 ° C fırın gece boyunca karıştırılmıştır. </li><li> Oda sıcaklığına tabakadan soğutun ve her kanal için kalıpları kapsayabilir yaklaşık 5,5 x 5 cm2&#39;lik bir alana, bir neşter ile üst katmana birleştirilmiş örtüyü kesmesi. silikon gofret bağlı bir yapı soyulabilir ve 2 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak kimyasal degrade kanal girişlerine ve çıkışında delikler. </li><li> 40 sn için 90 W plazma kullanılarak PDMS yüzeyler etkinleştirmek için, bağ yüzeyleri yukarı bakacak şekilde, O 2 plazma yüzey işleme makinesinde membran bağlı üst tabaka ve fabrikasyon PDMS alt tabaka yerleştirin. </li><li> yüzey işlemi hemen sonra bağlanması birlikte üst ve alt katmanları takın. tüm gümrüklü cihazın üstüne bir ağırlık (yaklaşık 600 gr) yerleştirin ve fırın gecede 60 ° C koydu. </li><li> fırın dışına tüm fabrikasyon cihazı alın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. mikroakışkan hücre gücü deneyi NOT: Bu yazıda örnek olarak yaygın olarak kullanılan bir hücre hattı, adenocarcinomic insan alveoler bazal epitel hücre (A549), ve bir kemokin, stromal hücre kaynaklı faktör (SDF-1α), kullanın. diğer hücrelere ve kemokin üzerinde çalışan araştırmacılar için, buna göre deneysel süreçler ayarlayın lütfen. <ol><li> Gün 0: Hücre hazırlığı <ol><li> Kültür DMEM F12 L-glutamin yerine,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h) Antimicrob antimikotik çözelti içeren tam büyüme ortamında A549 hücrelerinin hazır. % 0.25 tripsin-EDTA ile ayrışma ile alt kültür. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 140 x g&#39;de ayrışmış hücreler santrifüj ile deneyler için hücre süspansiyonları hazırlanır. Mikroakışkan cihaz deneyler için, hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı ve tam 10 ml T75 şişesi içinde en az 1 x 10 6 hücre tohumBüyüme ortamı. Not: Tüm hücre kültürü prosesleri, bir 37 ° C ve% 5 CO2 atmosferi ile bir kuluçka gerçekleştirilir. </li></ol></li><li> 1. Gün: Cihaz hazırlığı <ol><li> O 2 plazma makinenin içine yerleştiriniz ve mikroakışkan kanal hidrofilik yüzeyler işlemek için 40 saniye boyunca 90 W O 2 plazma ile tedavi. </li><li> Hemen yüzey işleminden sonra, doğrudan kimyasal degrade kanal girişlerindeki PDMS katman içine delikli 2 mm çaplı deliklere iğneler takarak iki 14 G künt iğne yükleyin. iğneler mikroakışkan kanallarını bloke etmediğinden emin olun. Künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile GKD 2 O 0.8 ml çizin. Su girişlerindeki hem iğnelerden akana kadar prizden kimyasal degrade kanala GKD 2 O enjekte edilir. </li><li> Dulbecco ve # ile fibronektin stok seyreltilmesi ile 50 ug / ml fibronektin çözeltisi 1 ml hazırlanması39 s Fosfat-Tamponlu Tuzu (DPBS). </li><li> Çözelti girişlerinde iki iğnelerden akana kadar künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak kimyasal gradyan kanalın çıkışından fibronektin çözeltisi infüzyonu. </li><li> bilinen bir hücre kültürü inkübatöründe tüm cihazın bir gece boyunca inkübe edilir. </li></ol></li><li> 2. Gün: Hücre tohumlama ve mikroskopi görüntüleme <ol><li> hücre tohumlama <ol><li> 0. günde yana kültürlenmiştir hücrelerden ortam aspire ve DPBS 5 mi 2 kez yıkama hücreleri. DPBS aspire tripsin-EDTA 2 ml ekleyin ve kap yüzeyinden hücreleri ayırmak için 5 dakika boyunca inkübatör hücrelerin inkübe edin. </li><li> şişeye hücreler ayrılmış ve çözelti içinde süspansiyona alınmış kadar bekleyin ve serumsuz ortam içinde 8 ml ekleyin (DMEM F12 +% 1 (h / h) Antimicrob antimikotik çözelti). 15 ml konik bir tüp içine tüm sıvı transferi ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 140 x g&#39;de santrifüj o. </li&gt; <li> Santrifüjden sonra süpernatan aspire ve nihai hücre yoğunluğu 1 x 10 6 hücre / ml yapmak için serumsuz ortam, uygun bir miktarda ilave edin. Hemasitometre veya başka otomatik hücre sayım cihazı kullanarak hücre sayımı 1. Günden hazırlanan mikroakışkan cihaz çıkar. </li><li> Orta girişlerinde iki iğnelerden akana kadar künt 14 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak kimyasal gradyan kanalın çıkışından serumsuz ortam enjekte edilir. Kimyasal gradyan kanalın çıkışından hücre süspansiyonu 200 ul enjekte edilir. </li><li> Hücreler mikroakışkan kanala girmiştir onaylamak için mikroskop altında cihazda hücre kültür odasının gözlemleyin. Nemli bir kap (örneğin, GKD 2 O içinde bir plastik kutu) içine Cihazı ve aygıt yüzeyi üzerine hücre yapışmasını sağlamak için 5 saat için bir hücre kültürü inkübatöründe tutun. </li></ol></li><li> Reaktifler hazırlanmasıKimyasal gradyan üretimi için hastalar <ol><li> Serum-barındırmayan ortam içinde istenen konsantrasyonda (100 ng / ml) kimyasal (SDF-1α) hazırlayın. ve yüksek saflıkta boru bağlı iki ayrı 3 mi şırıngalara kimyasal içermeyen serumsuz ortam çizin. daha sonra kullanmak için 1 ul / dk&#39;lık bir akış oranı ile, bir şırınga pompası şırınga ayarlayın. </li></ol></li><li> Oksijen degrade üretimi için reaktiflerin hazırlanması <ol><li> 1 M NaOH çözeltisi 15 ml ve 200 mg / ml pirogalol çözelti 15 ml olun. sırasıyla yüksek saflıkta PTFE tüp ve yüksek saflıkta boru, bağlı iki ayrı 15 ml şırınga içine NaOH ve pirogallol çözümleri çizin. daha sonra kullanmak için 5 ul / dakika akış oranı ile bir şırınga pompası şırınga ayarlayın. </li></ol></li><li> Mikroakışkan cihaz kurulumu <ol><li> 5 saat inkübasyondan sonra, tüm cihaz çıkar ve 15 cm çapında Petri kabı üzerine yerleştirin. yapışkan macun kullanılarak Petri kabındaki cihazı sabitleyin. TransferiBir inkübatör canlı hücre görüntüleme mikroskop Petri kabı. </li><li> Kimyasal degrade kanal girişlerine kimyasal degrade nesil için şırınga hortumunu bağlayın. Bir atık haznesine giden tüp için çıkışını bağlayın. Kimyasal degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın. </li><li> Oksijen degrade kanal girişlerine NaOH ve pyrorogallol içeren şırınga yüksek saflıkta tüp bağlayın. atık toplamak için prize hortumu bağlayın. Oksijen degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın. </li><li> Nemli cihazı tutmak için Petri kabı GKD 2 O yaklaşık 15 ml ekleyin. zaman lapsed görüntü yakalamak için canlı hücre görüntüleme mikroskobu kurmak ve bir görüntüyü her 15 dakika sürer. </li></ol></li></ol></li><li> 3. Gün: Veri toplama ve analizi <ol><li> Bir bilgisayara yakalanan görüntü dosyaları aktarın. açık kaynak kodlu bir görüntüsü, kullanarak görüntüleri analizalysis yazılım, ImageJ, Manuel İzleme için bir açık kaynak eklentisi (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) ve ücretsiz Kemotaksis Aracı yazılımı ile (http://ibidi.com/xtproducts / tr / Yazılım-ve-Görüntü-Analiz / Manuel Görüntü Analizi / Kemotaksis-ve-Göç-Aracı) 15, 16. </li></ol></li></ol> Gradyanların 3. Karakterizasyonu NOT: Kimyasal ve oksijen eğimleri önce veya hücre deneyleri sonrasında karakterize edilebilir. <ol><li> Kimyasal degrade sayısal simülasyon <ol><li> hesaplamalı akışkan dinamiği (CFD) simülasyonu kullanarak Mikroakiskan laminar flow doğasını tahmin edin. </li></ol></li><li> Oksijen degrade Deneysel karakterizasyonu <ol><li> 5 konsantrasyonda bir oksijen duyarlı fluoresan boya, tris (2,2&#39;-bipiridil) rutenyum (III) klorür heksahidrat, su içinde bir çözelti hazırlamakmg / ml olmuştur. </li><li> yüksek saflıkta boru bağlı iki ayrı 3 mi şırıngalara oksijene duyarlı boya çözeltisini çizin. (Kimyasal gradyan üretimi için kullanılan akış hızı ile aynı) 1 ul / dk akış oranı ile, bir şırınga pompası şırınga ayarlayın. </li><li> Kimyasal degrade kanal girişlerine şırıngalar hortumunu bağlayın. Bir atık haznesine giden tüp için çıkışını bağlayın. Kimyasal degrade üretimi için şırınga ile şırınga pompası açın. </li><li> 470 ± 20 nm optik filtreden geçen uyarım ışığı ile bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak fluoresans şiddetini ölçmek. serin bir CCD kamera kullanılarak 515 nm uzun geçiş emisyon filtresi aracılığıyla emisyon ışığı toplamak. </li><li> Oksijen degrade kanal girişlerine NaOH ve pyrorogallol içeren şırınga yüksek saflıkta tüp bağlayın. atık toplamak için prize hortumu bağlayın. Oksijen için şırınga ile şırınga pompası açıngradyan nesil. </li><li> hücre kültür odası içinde akan oksijene duyarlı boya flüoresan görüntülerini toplayın. </li><li> Oksijen degrade üretimi için akışını durdurmak ve oksijen üretim kanalına tüm boru bağlantısını kesin. Oksijen degrade kanalın çıkışına gaz silindirleri yüksek saflıkta tüp bağlayın. </li><li> Oksijen gradyanı kanala bağlı boru içine hava, saf azot ve saf oksijen akışı olduğunda hücre kültür odası içinde akan oksijene duyarlı boya flüoresan görüntülerini toplayın. </li><li> Kaynaklar 10 ve 11, uygun olarak Stern-Volmer denklemi kullanılarak floresans görüntüleri analiz ederek oksijen gradyanlar tahmin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., Garc&#237;a, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+graded+tissue+interfaces.">Engineering graded tissue interfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).</li><li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+signaling+mechanisms+underlying+polarity+and+chemotaxis.">The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis.</a> Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).</li><li>Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+generating+scaffolds+for+enhancing+engineering+tissue+survival.">Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival.</a> Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).</li><li>Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+oxygen+microenvironment+on+the+proangiogenic+potential+of+human+endothelial+colony+forming+cells.">Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells.</a> Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).</li><li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device.">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).</li><li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+-+a+key+regulatory+factor+in+tumor+growth.">Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).</li><li>Allen, J. W., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+steady-state+oxygen+gradients+in+vitro:+application+to+liver+zonation.">Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation.</a> Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).</li><li>McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic+oxygen+concentration+enhances+the+stem-like+properties+of+CD133++human+glioblastoma+cells+in+vitro.">Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro.</a> Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).</li><li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates.">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).</li><li>Chang, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polydimethylsiloxane-polycarbonate+hybrid+microfluidic+device+capable+of+generating+perpendicular+chemical+and+oxygen+gradients+for+cell+culture+studies.">A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies.</a> Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).</li><li>Chen, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions.">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).</li><li>Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+cell+culture+array+with+various+oxygen+tensions.">A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions.</a> Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).</li><li>Friend, J., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+devices+using+polydimethylsiloxane.">Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane.</a> Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).</li><li>Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual Tracking. , (2005).</li><li>Asano, Y., Horn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , (2013).</li><li>Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+nitric+oxide+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+controlled+chemical+reactions.">Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions.</a> Biomicrofluidics. 7 (6), 064104 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

gömülü bir bilgisayar ince film PDMS mikroakışkan cihaz imal etmek en kritik adımlar şunlardır: PDMS-PC üst tabakası imalatı ve (2) emin yaparken PDMS içine pre-polimer PC filmi takarken (1) tüm kabarcıklar kovma işlemleri kürlenme PDMS iyi tesviye yatay düzlemde gerçekleştirilir. Hücre göçü, deneyler için, en kritik adımlar şunlardır: (1) mikroakışkan cihaz içinde kabarcıklar ortadan deneyler sırasında tüp, ve şırınga pompaları; (2) mikroakışkan cihaz hücre göçü gözlem için canlı hücre görüntüleme sırasında iyi tesviye yatay düzlemde yerleştirilir sağlamak; ve (3) deneyler sırasında Petri kabı O GKD 2 eklenerek ve su kurutulmuş olmadığından emin yaparak nemli cihazı tutmak. başarıyla delaminasyon olmadan PDMS-PC hibrid mikroakışkan cihaz imal etmek amacıyla, PC fi boyunca tüm kabarcıklarını çıkarmak için kritik öneme sahiptirlm ekleme. PC filmi yavaş PDMS pre-polimer içine PC filmin yerleştirilmesi sırasında kabarcıkların oluşumunu önlemek için (yaklaşık 15 ila 30 derece uzaklıkta PDMS pre-polimer yüzeyinden) bir açıdan sokulabilir. Gerekirse, gömülü bilgisayar filmi ile tüm PDMS pre-polimer tuzak kabarcıklar çıkarmak için 10 dakika boyunca vakum pompasına bağlı bir kurutma yerleştirilebilir. PC filmi vakum işleminden sonra yukarı yüzen Eğer bir pipet tedavi PDMS katman üzerine PC filmi bastırın için kullanılabilir. Gerekirse vakum ve pres işlemleri tekrarlayın. Hücre deneyleri için, hava kabarcıkları olmaması mikroakışkan hücre kültürü için çok önemlidir. hava kabarcıkları bağlantı yapmadan (şırınga pompaları, boru ve Mikroakışkan cihaz dahil) tüm mikroakışkan kurulum içine emin olun. hava kabarcıkları nedeniyle deneyimlerini yükseltilmiş sıcaklık altında gaz çözünürlüğünün azalmasına mikroakışkan kurulum içinde oluşturulur iseinkübatör içinde deney * yapılan örneğin, (pirogallol, büyüme ortamına dahil olmak üzere ve NaOH) ve reaktifler (şırıngalar ve boru dahil) deney malzemeleri, sıcaklık değişikliğini en aza indirmek için (en az 20 dakika önce kullanıma) önce inkübatöre yerleştirilebilir . Şırınga sık sık pompa içinde motorlarının çalışma ısı üretir pompalar. Kuvöz içinde şırınga pompaları çalıştırmak için genellikle kabul edilebilir; Ancak, deneyler sırasında inkübatör sıcaklığını kontrol yapmak. Sıcaklık deneyler sırasında yükseltir, ek soğutma işlemleri gerçekleştirilebilir gerekir. Birçok uygun soğutma yöntemleri örneğin, inkübatör içine buz kutusunda yerleştirilmesi inkübatör içine yerleştirilir şırınga pompaları sayısını azaltarak ya da bir güç soğutma sistemi ile bir inkübatör kullanılarak, kullanılabilir. Bu çalışmada geliştirilen PDMS-PC mikroakışkan hücre kültürü cihazı güvenilir fo dik kimyasal ve oksijen degradeler üretebilenr hücre göçü çalışmaları. geliştirilmiş cihazın kısıtlama oluşturulan oksijen gradyan profili cihaz üzerinden, çevre atmosferden kimyasal reaksiyon atma tahrik oksijen akı, ve oksijen difüzyon arasındaki dengeye bağlıdır ve ortama olmasıdır. Bunun bir sonucu olarak, oksijen gradyan profili keyfi cihazın içinde kontrol edilemez. Mevcut mikroakışkan hücre kültürü platformları ile karşılaştırıldığında, bu çalışmada geliştirilen cihaz, kimyasal ve oksijen geçişlerini kombinasyonları altında hücre kültürü çalışmaları yürütebilecek ilk biridir. Tüm cihaz sıkıcı uyum ve pahalı enstrümantasyon olmadan, geleneksel yumuşak litografi çoğaltma kalıplama işlemini kullanarak imal edilebilir. Gradyanlar sayısal simüle ve deneysel in vitro hücre çalışmaları için daha fizyolojik mikro-benzeri koşulları sağlamak için karakterize edilebilir. Bir gaz di olarak PC filmi ile mekansal sınırlı kimyasal reaksiyon yöntemi kullanılarakffusion bariyeri, oksijen gradyan basınçlı gaz silindirleri ve gelişmiş gaz akımı gözetleme birimleri kullanmadan oluşturulabilir. Buna ek olarak, ayar kimyasal sadece küçük miktarlarda (günde en az 10 mi), oksijen gradyanlar korumak için gereklidir. Oksijen gerilim kontrolü mikroakışkan kanal etrafında yerel sınırlıdır ve ortam oksijen konsantrasyonu rahatsız etmediğinden, tüm kurulum ek sıcaklık, nem olmadan geleneksel hücre kültürü kuvöz içine yerleştirilir ve CO 2 kontrol enstrümantasyon yapılabilir. Bunun bir sonucu olarak, geliştirilmiş cihazın pratik Biological Labs kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahiptir. Teknik sınırlamalar nedeniyle, oksijen gerginlikler altında cep davranışları nadiren mevcut literatürde incelenmiştir. Bu makalede geliştirilmiş bir cihaz yardımı ile oksijen gradyan altında hücre kültürü büyük ölçüde oksijen gradyan altında hücre çalışmaları teşvik, kolay bir şekilde gerçekleştirilebilir. furthermore benzer bir çalışma prensibi, in vitro hücre kültürü 17 çalışmalar için, karbon dioksit ve nitrik oksit gibi diğer fizyolojik olarak ilgili gaz geçişlerini üretmek için uygulanabilir. Bu yetenekler PDMS-PC mikroakışkan cihaz in vitro hücre kültürü çalışmalarında ilerlemek için, uyuşturucu testi ve hücre çoğalması ve göç deneyleri dahil olmak üzere çeşitli hücre kültürü uygulamaları için büyük potansiyel gösteren göstermektedir.

Çözünebilir faktörleri ve oksijen geriliminin alansal dağılımı, in vivo, 1, 2, 3, 4 önemli hücresel fonksiyonları da düzenler. Iyi hücreleri üzerindeki etkisini araştırmak için, kararlı bir şekilde, kimyasal ve oksijen gradyanlar üretme kabiliyetine sahip olan bir in vitro hücre kültürü platformu arzu edilen bir konudur. Çeşitli çözünür faktörler biyolojik faaliyetlerinde kilit rol oynayan ve hücresel davranışını etkiler. Son zamanlarda nedeniyle mikroakışkan tekniklerin ilerlemesi, stabil üreten kimyasal geçişlerini yeteneğine sahip mikroakışkan cihazların bir dizi hücre göçü 5 incelemek için geliştirilmiştir. Ayrıca birkaç çalışma, in vitro hücre kültürlerinde 6, 7, 8 için oksijen geriliminin gerekliliğini ortaya koymuştur. Ancak,Hücre kültürü için oksijen gerginlik kontrolü ağırlıklı olarak basınçlı gaz silindirleri ile oksijen tutucu veya hücre kuvöz için doğrudan kimyasal ek dayanır. Doğrudan kimyasal ilavesi, hücre kültürü ortamı değiştirir ve hücresel yanıtları etkiler. Oksijen kontrol kuluçka özel inkübatör tasarımı, hassas gaz akış kontrolü ve hipoksi koşulları elde etmek için azot gazı büyük bir hacmi gerektirir. Ayrıca, çeşitli oksijen gerginlikler ve degrade altında cep davranış çalışması geciktirir bu kurulum kullanarak oksijen dağılımını kontrol etmek olanaksız olduğunu. Bu sınırlamaları aşmak için, mikroakışkan cihazların bir dizi hücre kültürü uygulamaları 9 oksijen gradyanlar oluşturmak için geliştirilmiştir. Ancak, çoğu buharlaşma ve kabarcık oluşturma sorunlara neden olabilir basınçlı gazlar kullanılarak işletilen edilir. Bu nedenle, genellikle karmaşık bir cihaz gerektirir ve uzun süreli hücre kültürü STUDIE güvenilir olmayabilirs. Zorlukların üstesinden gelmek için ve daha fazla hücre göçü için kimyasal ve oksijen farkları arasındaki etkileşimleri çalışmak için, biz bir gömülü polikarbonat (PC) ince bir film 10 ile polidimetilsiloksan (PDMS) yapılmış bir mikroakışkan hücre kültürü cihazı geliştirdi. Cihaz bir PDMS membran ile ayrılmış, iki mikroakışkan kanal tabakadan oluşur. üst katman oksijen degrade nesil için bir PDMS-PC katmanı; alt tabaka, kimyasal gradyan üretimi ve hücre kültürü için PDMS yapılır. Cihaz aynı zamanda gaz tüpleri ve sofistike akış kontrol sistemleri kullanmadan dik kimyasal ve oksijen geçişlerini oluşturabilirsiniz. cihazda, PDMS büyük bir optik şeffaflık, gaz geçirgenliği ve hücre kültürü ve görüntüleme için biyolojik uyumluluk sağlar. Gömülü PC filmi verimli oksijen basıncı kontrolü için gaz difüzyon bariyeri olarak hizmet vermektedir. mikroakışkan kanal olarak, yılankavi şeklinde bir kanal kullanılan bir dizis kimyasal renk geçişlerini oluşturmak için. tasarım geniş dolayı onun güvenilirlik ve kolay deney düzeneği çeşitli uygulamalar için mikroakışkan cihazlar kimyasal renk geçişlerini oluşturmak için istismar edilmiştir. Ayrıca, kimyasal degrade profilleri sayısal simülasyon ile önceden kanal geometrileri değiştirilerek dizayn edilebilir. Oksijen degrade nesil için, daha önce laboratuarımızda 10, 11, 12 geliştirilmiştir mekansal sınırlı kimyasal reaksiyon yöntemi yararlandı. Oksijen azot tasfiye olmadan belirlenen alanlara temizlenmesi edilebilir. Biyolojik laboratuvarlarında pratik kullanım için, tüm deney düzeneği geleneksel hücre kültürü kuvöz ile uyumludur. Bu yöntemleri entegre ederek, aynı anda hücre göçü incelemek amacıyla toplu gaz tüpleri ve sofistike enstrümantasyon olmadan kararlı kimyasal ve oksijen geçişlerini oluşturabilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302104</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Smartgene</td><td>6011-000</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302151</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge Tube</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Falcon 352096</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Petri dish</td><td>Dogger Science</td><td>DP-43151</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Syringe</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>302118</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;&#039; Silicon Dummy Wafer</td><td>Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>AH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>AG Double Expose Mask Aligner</td><td>M&amp;amp;R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan</td><td>AG500-4D-D-V-S-H</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimyotic solution</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex, Plainsboro, NJ</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>Blunt needle</td><td>JensenGlobal, Santa Barbara, CA</td><td>Gauge 14</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>Z359629</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Buffered Oxide Etch</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>PH3101-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator</td><td>Caron, Marietta, OH</td><td>6016-1</td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics</td><td>COMSOL, Burlington, MA</td><td>Ver. 4.3b</td><td>for numerical simulation of chemical gradients in the device</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Desicattor</td><td>A-VAC Industries, Anaheim, CA</td><td>35.10001.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12+GlutaMax-1</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 10082</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin from Human Plasma</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol (IPA)</td><td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td><td>CMOS112-00000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart Fluorescence Cell Imager</td><td>NanoEnTek, Seoul, Korea</td><td>DBJ01B</td><td></td></tr><tr><td>Mechanical Convention Oven</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Lindberg Blue M MO1450C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan</td><td>1943-0150</td><td></td></tr><tr><td>Plasma tretment system</td><td>Nordson MARCH, Concord CA</td><td>PX-250</td><td>for oxygen plasma surface treatment</td></tr><tr><td>Polycarbonate (PC) film</td><td>Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimehtylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning, Midland, MI</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogallol</td><td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td><td>A13405</td><td></td></tr><tr><td>Removable Adhesive Putty</td><td>3M</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>ELS Technology, Hsinchu, Taiwan</td><td>ELS 306MA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>SU-8 2050</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem, Westborough, MA</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blade</td><td>Feather, Osaka, Japan</td><td>5005093</td><td>for PDMS cutting</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>Chemyx, Houston, TX</td><td>Fusion 400</td><td></td></tr><tr><td>T75 Cell Culture Flask</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>Nunc 156367</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td><td>GIBCO 25200</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PTFE Tubing</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td><td>621</td><td></td></tr></tbody></table>

polydimethylsiloxane-polycarbonate microfluidic devices for cell migration studies under perpendicular chemical and oxygen gradients

Bu kağıt gömülü polikarbonat (PC) ve kimyasal oksijen geçişlerini kombinasyonları altında hücre göçü incelemek için ince bir film ile polidimetilsiloksan (PDMS) yapılmış bir mikroakışkan cihaz bildirir. Hem kimyasal ve oksijen eğimleri büyük ölçüde in vivo hücre göçü etkileyebilir; Ancak, teknik sınırlamalar nedeniyle, çok az araştırma in vitro etkilerini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Bu araştırmada geliştirilen cihaz istenilen kimyasal degradeler oluşturmak için serpantin şeklinde kanalların bir dizi yararlanır ve oksijen degrade üretimi için bir mekansal sınırlı kimyasal reaksiyon yöntemi patlatır. Kimyasal ve oksijen gradyanlar tarifi basit göç sonucu yorumlama sağlamak için birbirine diktir. etkin bir şekilde en az bir kimyasal tüketimi ile oksijen gradyanı elde etmek için, gömülü bilgisayar ince film bir gaz difüzyon engeli olarak kullanılır. geliştirilen mikroakışkan cihazşırınga pompaları ile çalıştırılan ve kurulumu basitleştirilmesi ve optimize edilmiş hücre kültürü koşulları sağlamak için hücre göçü deneyler sırasında, geleneksel bir hücre kuluçka makinesi içinde yerleştirilebilir. Hücre deneylerde, (stromal hücre türetilmiş faktör SDF-1α) ve oksijen gradyanları kemokinin kombinasyonları altında adenocarcinomic insan alveolar epitel hücrelerinin bazal, A549 ve göç çalışma cihazı kullanılır. Deney sonuçları cihazın kararlı bir şekilde dik olan kemokin ve oksijen gradyanlarını üretmektedir ve hücreler ile uyumlu olduğunu göstermektedir. göç çalışmanın sonuçları, oksijen gradyanlar geçişlerini kombinasyonları tek gradyan altında olanlardan tahmin edilemez altında hücre göçü yönlendirilmesinde önemli bir rol ve hücresel davranışı oynayabileceğini göstermektedir. Cihaz daha in vivo benzeri microenvi daha iyi hücre göçü çalışmaları teşvik edebilir hücre kültüründe kimyasal ve oksijen farkları arasındaki etkileşimleri çalışmak için araştırmacılar için güçlü ve pratik bir araç sağlarmının.

Fabrikasyon PDMS-PC melez mikroakışkan hücre kültürü aygıtı. İncir. 1 Bir fotoğraf ve mikroakışkan cihazın bir örneğini göstermektedir. alt tabaka altı farklı karışım oranları ile iki ayrı girişlerden tanıtıldı reaktif çözümler üretmek için serpantin şeklinde kanalların dört düzeyleri içerir. (Sol: sağ) 1: girişlerden kişiye iki çözelti arasındaki 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4 ve 0 Teorik olarak, altı farklı karışım oranları 1 bulunmaktadır. Altı farklı karıştırma oranı çözeltiler inşa kimyasal gradyanlar aşağı akış yönünde bulunan, hücre kültür odası içinde oluşturulabilir. Üst ve alt tabakalar, PDMS membran ile ayrılır. Üst katmanda, oksijen tutucu kimyasal reaksiyon için reaktif iki ayrı girişlerden mikroakışkan kanal içine yerleştirilir. Reaktifler hemen hücre kültür odası üzerine akan önce reaksiyon için birbirleri ile karıştırılırlardoğrudan kimyasal temas etmeden alt kanaldan oksijen, temizlemek. PDMS ile karşılaştırıldığında daha küçük bir gaz difüzyon katsayısı ile gömülü bilgisayar film, oksijen tutucu daha verimli hale getirir bir difüzyon bariyeri olarak görev yapar. Oksijen kademeli akış yönü boyunca bir oksijen gradyanı oluşturulması için alt bölgede PDMS geriye hücre kültür odası dağılır. oksijen tutucu kimyasal reaksiyonun mekansal sınırlı olduğundan, yalnızca yerel oksijen gerginlikler etkilenir. Bunun bir sonucu olarak, cihazın genel oksijen gerilimi değiştirmeden, geleneksel bir hücre kuluçka makinesi içinde kullanılabilir. Taşıma deneylerde, hücreler, gözlem için hücre kültür odası içinde tohumlanır. büyüme ortamı ve kimyasal reaktifler tam kontrollü akış oranları ile şırınga pompaları kullanılarak cihaza tanıtıldı. Kimyasal ve oksijen geçişlerini karakterizasyonu cihazın içinde oluşturulan. Nedeniyle to akış davranışları hesaplamalı akışkan dinamiği (CFD) simülasyonu kullanılarak tahmin edilebilir, Mikroakiskan doğasını akış laminer. Bu yazıda bir 3D modeli inşa ve piyasada mevcut multiphysics modelleme yazılımı kullanılarak simülasyon yapıldı. İncir. 2 (a) floresan yoğunluğu ölçümleri ve sayısal simülasyon sonuçlarına göre hücre kültür odasının genişliği boyunca deneysel karakterize floresein konsantrasyon profilleri arasında bir karşılaştırma gösterir. deneysel ve simülasyon sonuçları arasındaki anlaşma CFD modeli de cihazın içinde üretilen kimyasal geçişlerini tahmin düşündürmektedir. İncir. (B) 2 hücre kültür odası içinde oluşturulan simüle SDF-1α gradyanı çizer. İncir. 3 hücreli deneyleri önce hücre kültür odası içinde oksijen duyarlı floresan boya akan oksijen degrade tanımlama sonuçlarını gösterir. Sonuç, bir oksijen Gradi belirtiryaklaşık 1 ile% 16 arası değişen ent, söz konusu protokolü kullanılarak tespit edilebilir. Hücre göçü sonuçları. Bir gösteri olarak, 4 kemokin kombinasyonları (SDF-1α) ve oksijen gradyanlarıyla A549 hücre göçü çalışmalar yapılmıştır: (1) herhangi bir kemokin ile bir kontrol olarak oksijen gradyanlar, (2) bir kemokin gradyanı ile ve bir oksijen gradyan olmadan (3) bir oksijen gradyanı ile bir kemokin gradyanı olmaksızın ve (4) kemokin ve oksijen gradyanlar hem. İncir. 4 Tüm deney düzeneği fotoğrafını gösterir. Deneyler Bütün içine yerleştirilir (mikroakışkan cihazlar, şırınga pompaları ve canlı hücre görüntüleme mikroskoplar da dahil olmak üzere), tüm kurulumu ile, geleneksel bir hücre kültürü inkübatöründe gerçekleştirildi. Hücre göçü, sonuçları Şekil l&#39;de gösterilmiştir. 5. İncir. 5 (a) canlı hücre görüntüleme ana kullanarak deneyler sırasında toplanan görüntüleri gösterirLyzer ve Şek. 5 (b) ve (c) eklentileri ile ImageJ yazılım ile analiz dört kombinasyonları altında hücre göçü yörüngeleri ve ortalama hareketleri çizer. Sonuçlar kontrol ortalama hücre göçü mesafesi deneyde hücre rastgele hareketini ileri süren sıfıra yaklaşırken göstermektedir. Buna karşılık, sadece kemokin gradyanı ile, hücrelerin ortalama hareketi SDF-1α konsantrasyonu yüksektir soldan, doğrudur. sonuçlar, daha önce rapor edilmiştir A549 hücreleri, SDF-1α kemotaksis davranışını göstermektedir. oksijen gerilimi daha az olan, sadece oksijen gradyanları ile deneyde, hücrelerin ortalama hareket yukarı doğru. Daha ilginç bir şekilde, dik olarak kemokin ve oksijen gradyanlar ile deneyde, hücrelerin ortalama hareketi yukarı doğru ve yatay yönde belirgin bir hareket (kemokin gradyanı yönü) yoktur. Şekil 1: Fabrikasyon PDMS-PC mikroakışkan hücre kültürü aygıtı. (A) güvenilir hücre göçü çalışmaları için dik kimyasal ve oksijen degradeler üretme kapasitesine sahip fabrikasyon cihazın deneysel fotoğraf. Kimyasal gradyan kanalı hücre kültür odası içinde gradyan nesil göstermek için mavi ve sarı gıda boyaları ile doldurulur. Oksijen degrade kanal kırmızı gıda boyası ile doludur. Ölçek çubuğu 1 cm dir. (B) mikroakışkan cihazın şematik. Üst tabaka hücre kültür odasının içine verimli oksijen degrade kontrolü için bir gaz difüzyon bariyeri olarak gömülü bir bilgisayar tabakası ile PDMS kullanılarak imal edilir. (C) üst ve alt tabakaların imalatı için ana kalıp. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig1large.jpg" target="_blank">Için tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig2.jpg" /> Şekil 2: mikroakışkan hücre kültürü cihazın içinde kimyasal degrade. (A) Nümerik simüle ve deneysel hücre kültür odası (Y yönü) genişliği boyunca hücre kültür odasının içine floresein konsantrasyon gradyanı ile karakterize edilir. simüle ve deneysel ölçülen farkları arasındaki benzerlik simülasyon kimya degrade tahmin gösterir. Şekil içerlek simülasyonu için inşa üç boyutlu (3D) modelini göstermektedir. Hücre göçü, çalışmaları için hücre kültür odası genişliği boyunca SDF-1α kemokin gradyanı (b) nümerik sonucu. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig2large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55292/55292fig3.jpg" /> Şekil 3: mikroakışkan hücre kültürü cihazın içinde oksijen degrade. Deneysel akış yönü boyunca hücre kültür odası içinde oksijen değişimleri ölçülmüştür. gradyanlar oksijene duyarlı floresan boya ve resim analizi kullanılarak hesaplanmıştır. gradyanlar, bölmenin soldan sağa doğru, karakterize edilir ve sonuç bölmenin genişliği boyunca tutarlı bir gradyan profili göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55292/55292fig4.jpg" /> Şekil 4: deney düzeneği resimleri. optimize için mikroakışkan cihazlar, şırınga pompaları ve canlı hücre görüntüleme mikroskop dahil olmak üzere tüm kurulum, geleneksel bir hücre kültürü inkübatör içine yerleştirilirDeneyler sırasında hücre kültürü koşulları. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55292/55292fig5.jpg" /> Şekil 5: dik SDF-1α ve oksijen gradyan altında Hücre göçü çalışma sonuçları. (A) Görüntüler öncesi ve 12 saat hücre göçü çalışmanın ardından ele geçirdi. hücre göçü yolları canlı hücre görüntüleme mikroskop kullanılarak çekilen zaman lapsed görüntülerden analiz edilebilir. (B) 4 farklı degrade kombinasyonları altında çekilen görüntülerin hücre göçü yolları ve analiz ortalama göç hareketi: hayır gradyan, sadece kemokin gradyan, sadece oksijen degrade, hem kemokin ve oksijen gradyanlar. görüntüleri her 15 dakikada yakalandı. Ölçek çubuğu 250 mikron olan. Dik (oksijen gradyanı) ortalama hücre göçü mesafeleri (c) Arsalar ve yatay (kemokin gradyanı) dört farklı degrade kombinasyonları altında tarifi. Veriler, üç bağımsız deney kümelerinden elde edilen ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir ve 10 hücre her deneyde analiz edildi. İstatistiksel anlamlı bir farklılık (Student t-testi, p &lt;0.01) sonuçlar farklı harfler (a ve b) tarafından tayin edilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients at JoVE.com

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

polydimethylsiloxane-polycarbonate-microfluidic-devices-for-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K Görüntüleme.  Academia Sinica. The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Video: Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Biyoloji

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Tıp

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Biyomühendislik

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...