This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

kuadriseps kas biyopsisi mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilen bir anestezi domuz, alınır. Domuz başka deney için sonradan kullanılır. Çalışma Deney hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Sağlık kılavuzların National Institutes uyarınca ve Kanton Bern, İsviçre Hayvan Bakım Komitesi onayı ile yapılır. 1. İskelet Kası Homojenizasyon ve Mitokondrial İzolasyon <ol><li> Tüketim bir anestezi domuz 5-10 gr kuadriseps kas örneği. Bu deneyde, domuz iskelet kası kullanımı. Bu protokol, aynı zamanda, diğer türlerden mitokondri izole etmek için kullanılabilir (örneğin, sıçan, fare, insan, vb.). NOT: Bu adım cerrahisi konusunda uzman bir tıp uzmanı tarafından yapılır. <ol><li> kas içine ketamin (20 mg / kg) ve ksilazin (2 mg / kg) ile oturaklı domuz anestezi içi ile indüklenen önceVenöz midazolam (0.5 mg / kg, artı atropin, 0.02 mg / kg). Ameliyat sırasında sürekli intravenöz propofol infüzyonu (h başına 4-8 mg / kg) ve fentanil (h 30 ug / kg) ile anestezi bakımı. </li></ol></li><li> Hemen buz soğukluğunda mitokondriyal yalıtım tamponu 20 mL (Tablo 1) ihtiva eden bir beher içinde doku örneği bırakın. Not: Tamponlar homojenleştirme sırasında ve santrüfüj soğuk buz olabilir ve sitosol ile uyumlu iyonik ve ozmotik kuvveti olan bir fizyolojik olarak ilgili pH sahip olmalıdır. </li><li> Bir analitik daralı dengesine beher doku örneği tartılır. yalıtım tamponu 20 mL beher dengesini dara. </li><li> bir buz kovası behere koyun. NOT: buz kovası sıcaklığında homojenizasyon işlemi için bir sonraki tüm adımları uygulayın ve buz kovası tüm tamponları tutun. </li><li> beher iskelet kası Kıyma ince SCISS kullanılarak 3-4 dakika boyunca 1-2 mm&#39;lik küçük parçalar halinde (buz üzerinde tutulur)ors. </li><li> buz gibi soğuk izolasyon tamponu (20 mL her yıkama basamağı) ile iki kez beher kıyılmış doku durulayın. </li><li> 5 mg proteaz / g doku ihtiva eden doku ağırlığı (g) başına yalıtım tamponu 10 hacim doku süspanse edin. </li><li> Manyetik karıştırıcı ile bir buz banyosu içinde beher yerleştirin ve 10 dakika süre ile karıştırıldı. </li><li> % 0.2 (ağırlık / hacim) yağsız büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile desteklenmiş doku ağırlığı (g) başına yalıtım tamponu ilave 10 hacim beherde süspansiyon seyreltilir. </li><li> % 0.2 BSA ile takviye edilmiş yalıtım tamponu her süzün ve% 0.2 BSA (her biri 20 mL yıkama adımı) ile desteklenmiş buz soğuğu yalıtım tamponu ile iki kez beher doku yıkayın. </li><li> yağı alınmış BSA, 0.2% ile takviye edilmiş doku ağırlığı (g) başına yalıtım tamponu 10 hacim doku yeniden süspanse edin. </li><li> Bir gevşek havan eli (10 vuruş) ile (buz üzerinde tutulur), bir yarı-otomatik cam homojenleştirici ile doku homojenize edilir. NOT: HomogenizAynı şekilde, her zaman doku (vuruş aynı sayıda, örneğin, 10 vuruş) e. vuruş daha yüksek sayıda hasar ve mitokondri ayrılmalıdır olabilir. Tercihen, otomatik bir homojenleştirici kullanılarak doku homojen hale getirilir. El ile (ve sübjektif) cam homojenizatör içinde homojenize doku örnekleri izole mitokondri farklı kalitelerde üretebilir. </li><li> Santrifüj 10,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de homojenize dokusudur. Not: Tüm santrifüj adımları sabit açılı rotor ile santrifüj yapılmaktadır. </li><li> serolojik pipeti kullanarak süpernatant atılır ve BSA ile desteklenmiş buz soğukluğunda yalıtım ortamı içinde pelet (10 ml / g doku) tekrar süspansiyon. </li><li> Santrifüj 350 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de süspansiyon. </li><li> serolojik pipet kullanarak süpernatant rezerv ve pelet (hücresel enkaz) atın. </li><li> (17 iplik / cm2), hücre Debr kaldırmak için gazlı iki katmanı boyunca (buz üzerinde tutulur) bir beher içine süpernatant Filtreolduğunu. </li><li> Santrifüj 7,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C de süzüldü süspansiyon. </li><li> Süpernatant atılır ve 7,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de% 0.2 (ağırlık / hacim) BSA ve santrifüj süspansiyonu ile takviye yalıtım tamponu (5 ml / g doku) ham mitokondriyal pelletini. </li><li> Süpernatantı atın ve yıkama tamponu (Tablo 1) ham mitokondriyal pelletini. Santrifüj 7,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tekrar süspansiyon. </li><li> g Süpernatant atılır ve yıkama tamponu içinde ham mitokondriyal pelletini ve x, 7,000, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de tekrar süspansiyon santrifüj. </li><li> Süpernatantı atın ve yıkama tamponu 1.0 ml ham mitokondriyal pelletini. </li><li> mitokondriyal süspansiyonunun protein konsantrasyonu belirlemek ve buz üzerinde konsantre mitokondriyal süspansiyon tutun. Not: Protein konsantrasyonu, standart bir yöntem kullanılarak ölçülebilir. </li><li> hemen öncetahlilleri Solunum için, 0.4 mg / ml mitokondriyal protein içeren bir son konsantrasyona kadar solunum tamponu içinde mitokondriyal süspansiyon tekrar süspansiyon. </li></ol> 2. Yüksek çözünürlüklü Solunum <ol><li> Yüksek çözünürlüklü Oksigraf odası içine solunum tamponu (Tablo 1) 16 Pipet 2.1 mL sürekli kararlı bir oksijen akışının sinyaline kadar 1 saat boyunca 37 ° C &#39;de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak tampon karışmaya polarografik oksijen sensörü elde edilir. NOT: Her Oksigraf odasının içinde Polarografik oksijen elektrotları, oksijen konsantrasyonu ölçmek ve her odasının içinde oksijen tüketimini (akı) hesaplayın. oksijen konsantrasyonu ve oksijen tüketim oranları (akı) veri toplama ve analiz yazılımı kullanarak bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterilir. Buna ek olarak, doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmek amacıyla, enstrümantal oksijen arka plan düzeltme olmalıüreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilmiştir. Not: solunum tamponu Doğru 2.1 mL durdurucuların kapatılmasından sonra 2.0 mL&#39;lik nihai bir hücre hacmine kalibrasyonu için hazneye ilave edilir. </li><li> Üreticinin protokollerine 17 göre polarografik oksijen sensörünün bir hava kalibrasyonunu gerçekleştirin. NOT: Hava Kalibrasyon sırasında, bir gaz fazı varken, medya oksijen konsantrasyonu 15-20 dk sırasına dengelenmeye olacaktır. sıcaklık, hava basıncı, ve medya -Oksijen konsantrasyon çözünürlüğüne bağlı olarak hesaplanabilir. </li><li> Hava kalibrasyon sonra Oksigraf odasından solunum orta aspire ve Oksigraf bir bölmeye adım 1.24 izole mitokondriyal süspansiyonu (0.4 mg / ml mitokondriyal protein) 2.1 ml. NOT: solunum tampon hacmi kurmak alet ve üreticisine bağlıdır. yüksek çözünürlüklü Respirometrik için, solunum met 2.1 mLffer durdurucuların kapatılmasından sonra 2.0 mL&#39;lik nihai bir hücre hacmine kalibrasyonu için hazneye ilave edilir. </li><li> durdurucunun sokulmasıyla Oksigraf odası kapatın. </li><li> sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar sürekli bir 3-5 dakika boyunca başlangıçtaki 37 ° C &#39;de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu ve kayıt hücresel solunum ile mitokondriyal süspansiyon karıştırılır. NOT: oksijen konsantrasyonu ve oksijen akı sinyal veri toplama ve analiz 17 için yazılım kullanan bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterilir. </li><li> Daha sonra, aşağıdaki standart protokoller kullanılarak stoper titanyum enjeksiyon portu üzerinden mitokondriyal solunum için alt tabakaların ve inhibitörlerin enjekte edin. </li></ol> 3. Karmaşık I-bağımlı solunum <ol><li> adımda 2.1-2.5 ve tarif edilen prosedür takip edilerek izole mitokondriyal süspansiyonu (0.4 mg / ml) ihtiva eden bir Oksigraf odası hazırlamakistikrarlı bir sinyal beklemek. </li><li> (0.4 mg / ml), odacık durdurucu titanyum enjeksiyon ağzı vasıtası ile ve izole mitokondriyal süspansiyonu içeren Oksigraf odası içine 0.8 M malat 12.5 uL (5 mM nihai konsantrasyon) ve 2 M glutamat 10 uL (10 mM son konsantrasyon) enjekte sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar 3-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. NOT: Aşağıdaki adımlarda tüm enjeksiyonlar şırıngalar kullanılarak stoper titanyum enjeksiyon portları aracılığıyla yapılmaktadır. </li><li> Daha sonra azalır ve (3-5 dk) stabilize, oda stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla Oksigraf odasına 0.05 M ADP (0.25 mM) 10 mcL enjekte edilir ve oksijen akı sinyal artar kadar mitokondriyal solunum kaydedin. NOT: ADP ilavesinden sonra solunum plato ADP konsantrasyonu yüksek ve doyurucu olduğunu gösterir. solunum sırasında kullanılan mitokondri miktarına bağlı olarak, ADP konsantrasyonu titre edilmelidiristikrarlı bir devlet 3 oksijen tüketimi (maksimum solunum) için. mitokondriyal süspansiyon ADP eklenmesi (devlet 3 solunum) artacak oksijen tüketiminde bir artış ve oksijen akı sinyalini neden olacaktır. ADP tükendikten sonra, oksijen akı sinyali (devlet 4 solunum) azalacak. </li></ol> 4. Kompleks II bağımlı solunum <ol><li> adımda 2.1-2.5 açıklanmıştır ve istikrarlı bir sinyal bekleyin prosedür takip izole mitokondriyal süspansiyonu (0.4 mg / ml) ihtiva eden bir Oksigraf gözü hazırlayın. </li><li> bir şırınga kullanılarak odası stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) &#39;DİKKAT&#39; 2 mcL enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilene kadar 3-5 dakika hücresel solunum kaydedin. NOT: Rotenon tehlikeli bir zehir olduğunu ve insan sağlığı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. </li><li> Oksigraf ch olarak 1 M süksinat (10 mM) 20 uL enjektekehribar ve istikrarlı bir oksijen akı sinyali kadar 3-5 dakika rekor mitokondriyal solunum elde edilir. </li><li> Daha sonra azalır ve (3-5 dk) stabilize, stabilize, oda stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla Oksigraf odasına 0.05 M ADP (0.25 mM) 10 mcL enjekte edilir ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kaydedin. NOT: mitokondriyal süspansiyon ADP eklenmesi (devlet 3 solunum) artacak oksijen tüketiminde bir artış ve oksijen akı sinyalini neden olacaktır. ADP tükendikten sonra, oksijen akı sinyali (devlet 4 solunum) azalacak. </li></ol> 5. Karmaşık IV-bağımlı solunum <ol><li> adımları protokol 2.5&#39;e 2.1 ve sabit bir sinyal bekleyin tarif edilen prosedür izlenerek izole mitokondriyal süspansiyonu ihtiva eden bir Oksigraf odası (0.4 mg / ml) hazırlayın. </li><li> Daha sonra 0.8 mM askorbat 2.5 uL (1 mM) enjekte edilir. Hemen ardından 0.2 2.5 uL enjekteM TMPD (0.25 mM) ve oksijen akı sinyal artar kadar Oksigraf odası ve kayıt hücresel solunum içine 0.05 M ADP (0.25 mM) 10 uL ve (3-5 dk) stabilize eder. </li><li> Son olarak Oksigraf odası içine 1 M sodyum azit (5 mM) &#39;DİKKAT&#39; 10 uL enjekte oksijen akı sinyali düşene kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder. NOT: Sodyum azid tehlikeli bir zehir olduğunu ve insan sağlığı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. </li></ol> 6. Sitokrom C Testi <ol><li> adımları protokol 2.5&#39;e 2.1 ve sabit bir sinyal bekleyin tarif edilen prosedür izlenerek izole mitokondriyal süspansiyonu ihtiva eden bir Oksigraf odası (0.4 mg / ml) hazırlayın. </li><li> (0.4 mg / ml), odacık durdurucu titanyum enjeksiyon ağzı vasıtası ile izole mitokondriyal süspansiyonu içeren Oksigraf odası içine 0.8 M malat 12.5 uL (5 mM nihai konsantrasyon) ve 2 M glutamat 10 uL (10 mM son konsantrasyon) enjektesabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar 3-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Daha sonra azalır ve (3-5 dk) stabilize, oksijen akı sinyal artar kadar bölme stoper ve kayıt mitokondriyal solunum titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla Oksigraf odasına 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 mcL enjekte edilir. </li><li> Son olarak, Oksigraf odası içine, 4 mM sitokrom c (10 uM) ve 5 uL enjekte etmek ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar 5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li><li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li><li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation.">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells.">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle:+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs.">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li><li>Corr&#234;a, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+in+septic+shock:+effects+on+tissue+perfusion,+organ+function,+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis.">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li><li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro.">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. 3, (2002).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gnaiger, E., M&#233;ndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia.">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers.">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation.">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig:+a+study+using+top-down+elasticity+analysis.">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışmada, yüksek kaliteli, sağlam ve yüksek çözünürlüklü Respirometrik gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilecek diferansiyel santrifüj sıkıca bağlanmış iskelet kası mitokondri izole etmek için bir protokol açıklar. sağlam ve sıkı birleştiğinde mitokondri izole etmek amacıyla, mevcut protokolü kapsamında dikkate alınması gereken bazı kritik noktalar vardır. iskelet dokusu hasat sonra, hemen buz gibi soğuk mitokondriyal izolasyon tampon dalm...

Mitokondrial biyoenerji ve solunum kapasiteleri permeabilize hücrelerin veya liflerin değil, aynı zamanda izole edilmiş mitokondride sadece incelenebilir. Bu çalışmada, yüksek çözünürlüklü Solunum ölçümleri için diferansiyel santrifüj kullanılarak sağlam iskelet kası mitokondri izole etmek için bir protokol açıklar. Respirometrik bozulmadan mitokondri izole etmek için, doku homojen hale getirilir ve mitokondri bilinen bir diferansiyel santrifügasyon yöntemi ile izole edilir. Diferansiyel santrifüj yöntemi sıralı santrifüj ilk Pallade tarafından tanıtıldı doku homojenatlarında ve işçiler neredeyse 70 yıl önce 1 (artan bir hızla bir dizi) dayanır. Doku ilk makas kullanılarak kıyılmış ve gevşek tokmak bir cam homojenizatör mekanik olarak homojenize edilir. Daha sonra Homojenat düşük hız ve kesintisiz doku içeren ortaya çıkan pelet, hücresel santrifüj edilirenkaz ve çekirdekler atılır. Daha sonra, üst faz, yüksek hızda birkaç kez santrifüj uygulanır ve mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyon toplanır. diferansiyel santrifüj yöntemin avantajları mitokondrinin yönündedir izole etmek için: i) yöntemi hızlı ve mitokondri (solunum deneyler mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır) 1-1.5 saat içinde izole edilebilir; ii) ucuzdur; ve iii) çok verimli ve diferansiyel santrifüjleme ile elde edilen mitokondri Solunum tahlilleri için yeterince saf olan. diferansiyel santrifüj yöntemin dezavantajları mitokondrinin olan izole etmek i) mitokondri hasarlı ve homojenizasyon sırasında uncoupled alabilirsiniz; ii) diğer hücresel bileşenleri ile mitokondri (kirlenmesi daha yıkama ek santrifüj adımları ile mitokondriyal pelet) tarafından çözülebilir; iii) diferansiyel santrüfüj adımları sırasında, örneğin farklı mitokondriyal alt popülasyonlar, seçme imkanı, mitAlt Yoğun ile ochondria 7 alınmayabilir; ve iv) mitokondriyal hücresel çevre eksik sadece teorik maksimum solunum ölçülebilir. Solunum deneyleri için mitokondri izole edilmesi için bir başka yöntem, yoğunluk gradyanlı santrifüj 2&#39;dir. göre diğer hücresel bileşenleri izole edilmesi mitokondri neden Bu teknikte, doku ekstraktı sakaroz veya (santrifüj tüpünün dibinde daha yüksek bir yoğunluğa sahip), bir Percoll gradyanı eden bir çözeltiye üzerine yayıldı ve belli bir hızda santrifüj onların yoğunlukları. Bu yöntem genellikle sinaptozomlarda çok düşük kirlenme beyin mitokondri izole etmek için kullanılır. Bununla birlikte, yoğunluk gradyan santrifüjü ile izole edilmiş sıçan karaciğeri mitokondri yüksek diğer hücresel organellerin 3 kirlenir. Bu yöntemin sınırlamaları biri santrifüj tüpünde sukroz gradient mevcut bu yüzden kopma olabilir kiBana mitokondri (ozmotik şok). doku tipine bağlı olarak; diferansiyel santrifüj ile sağlam mitokondri izolasyonu için dikkat etmeniz gereken bazı önemli faktörler vardır. İlk gerekliliği hassas bir şekilde doku homojenize etmek. böbrek, beyin ve karaciğer gibi yumuşak dokuların homojenleştirme sırasında uygulanan hafif bir mekanik kuvvetleri gerektirir. Bu tür çok daha güçlü mekanik kuvvetler gerektiren kalp ve iskelet kası gibi sert dokularda ile çelişmektedir. Kıyılmış doku önce genelde doku yumuşatmak için homojenizasyona proteinaz ile işlenir. Homojenizasyon ve santrifüj esnasında kullanılan bütün tampon soğuk buz olabilir ve sitozol 4, 5 ile uyumlu iyonik ve ozmotik kuvveti olan bir fizyolojik olarak ilgili pH sahip olmalıdır. izole mitokondriyal biyoenerjitiklerinin okuyan avantajlarından biri, hücresel plazma zarları permeabi olması gerekmez olmasıdırmitokondrial dış membran bütünlüğünü tehlikeye düşürecek gibi digitonin veya saponin 4, 6 gibi deterjanlar ile lized. İzole mitokondri bir başka avantajı, örneğin, oksijen tüketimi mitokondriyal işlev analizi ile müdahale diğer sitosolik faktörlere bulunmamasıdır. İzole mitokondri ile dezavantajları santrifüj adımları sırasında belirli mitokondriyal popülasyonlarının olası seçimi, homojenleştirme sırasında mitokondriye zarar ve izole mitokondri 7, 8, iyi bir verim elde etmek için biyolojik örnekler, yüksek miktarlarda şartı vardır. İzolasyon işleminden sonra, mitokondriyal komplekslerinin solunum hızları I, II ve IV-bağımlı (Devletleri 2, 3 ve 4) Yüksek çözünürlüklü Solunum kullanılarak tespit edilir. kompleks I-odaklı solunum, glutamatve malat adenozin difosfat (ADP) eklendi edilmektedir. Kompleks II odaklı solunum için, süksinat ADP ardından eklenir. Kompleks IV odaklı solunum, askorbat ve tetramethylphenylendiamine (TMPD) ADP 9, 10, 11, 12, ardından ilave edilir. Durum 2, tek başına alt-tabakaların mevcudiyetinde oksijen tüketimi anlamına gelir. Durum 3 substratları ve ADP mevcudiyetinde oksijen tüketimi anlamına gelir. Devlet 4 ADP tükenmesi sonra oksijen tüketimi anlamına gelir. Solunum kontrol oranı (RCR) oksijen tüketimi ATP üretimi kuplajın bir dizin ve durum 3 ve durum 4 13, 15 arasındaki oran olarak hesaplanmıştır. Özetle, biz diferansiyel santrifüj ile fonksiyonel ve sağlam iskelet kası mitokondri izole etmek ve bu izole mitochon kullanmak için bir protokol tarifyüksek çözünürlüklü Respirometrik gibi işlevsel ve biyoenerjik çalışmalar için Dria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00127</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 7699</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>fluka</td>
			<td>3779</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma,</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-lactobionate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 2398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06129</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase, bacterial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8038</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser&#160;</td>
			<td>schuett-biotec GmbH</td>
			<td>3.201 011</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Kompleks I bağımlı solunum İzole mitokondriyal kompleks I-bağımlı solunum hızları (devletler 2, 3 ve 4) yüksek çözünürlüklü Solunum (Şekil 1, temsili bir diyagram) kullanılarak belirlenmiştir. Mitokondrial kompleks I alt-tabakalar, glutamat ve malat, ADP ilave edildi ilave edilir. Durum 2, tek başına alt-tabakaların mevcudiyetinde oksijen tüketimi anlamına gelir. Durum ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements at JoVE.com

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Görüntüleme.  Inselspital, Bern University Hospital. Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Video: Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Biyoloji

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...