PLP Sanford Çocuk Sağlığı Araştırma Merkezi&#39;nin bir Associate Araştırmacı. R01AR056712, R01AR052779 ve Artrit ve Kas-iskelet Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü ve Cilt Hastalıkları (NIAMS), MDA ve Sanford Çocuk Sağlığı Araştırma ödül gelen P30 AR061303: Bu çalışma PLP&#39;ye aşağıdaki hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen projede Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı araştırma fonlarından yararlandı FP7-Sağlık - 2009 ENDOSTEM 241440 (tamir ve kas dokusunun bakımı için damar ilişkili kök hücre ve kas kök hücrelerinin aktivasyonu) SA tarafından desteklenmiştir. CIRM dostluk.

HESC 1. Enfeksiyon Bu protokol, yüksek titre lentivirüsler kodlayan BAF60C ve MyoD 13 gerektirir. Bu yapılar istek üzerine mevcuttur. <ol><li> Başlamadan önce Öneriler <ol><li> Besleyici ücretsiz koşullarına enfeksiyon viral alımı sırasında hücresel rakiplerini ortadan kaldırmak için (Şekil 2A) için enfeksiyon, plaka hESC yüksek verim sağlamak için. Gerçekten de, MEF&#39;ler HESC göre ve MyoD-aracılı dönüşüm için yetkin olduğu gibi enfekte herkesin bildiği gibi daha kolaydır. Bu nedenle, HESC kültürlerden MEFS ortadan enfeksiyon oranı artar. </li><li> Bu enfeksiyon, yüksek verim sağlamak için yüksek titre lentivirüsler olması tavsiye edilir. Enfeksiyon verimliliğini artırmak için Seçenekler &quot;enfeksiyon kontrol&quot; bölümünde tartışılmıştır. </li><li> Her kuyucuğa 1 mg / ml 1 ml Matrigel eklenerek Matrigel kaplı tabak hazırlayın ve en az 1 saat oda sıcaklığında (veya O bırakmak / N 4 ° C&#39;de mühürlübir gün önce hazırlandı ise). </li></ol></li><li> Enfeksiyon işlemi <ol><li> Enfeksiyondan bir gün önce <ol><li> 1000 X seyreltme (2 mM nihai konsantrasyon) de ortam içinde embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek ekleyin. </li></ol></li><li> Gün 0 - BAF60C ile enfeksiyon Not: İlk MyoD ile enfeksiyonu takiben BAF60C ile hESC enfeksiyon yapın. <ol><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca TrypLE 1 ml ile kuluçkalama ile tek bir hücre süspansiyonu olarak 14 koloni olarak yetiştirilen hESC bir 6-yuvalı plakanın bir kuyu ayrıştırmaları </li><li> 15 ml tüp transfer süspansiyon, 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj HESC orta ve 9 ml ekleyin. </li><li> Santrifüj sırasında, 1 ml mTeSR1, polibren (6 mg / ml) ve embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek (2 mM) ilave edilerek temiz bir tüp içinde enfeksiyon karışım hazırlayın. </li><li> Bir c yeniden askıya hücre topağı (yaklaşık olarak 5 x 10 5 -1 x 10 6 hücreonfluent iyi hESC) plastiğe yapışmasını engelleyen bir hücreler 6-çukurlu, düşük tutturucu levha, üzerine enfeksiyon karışımı ve plakanın 1 ml. </li><li> 8 10 MOl&#39;de BAF60C-IRES-GFP virüs ekleyin ve inkübatör içinde 3 saat inkübe </li><li> Virüs içeren hücre süspansiyonu toplayın ve iki Matrigel kaplı oyuklara eşit bölün. Daha sonra her bir oyuğa mTeSR1 + embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ekleyin ve inkübatör O / N bırakın. </li></ol></li><li> Gün 1 <ol><li> Dikkatle virüs içeren orta kaldırmak ve mTeSR1and iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ile değiştirin. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, hücreler topaklanmış başlayacaktır. </li></ol></li><li> Day2 - myod ile enfeksiyon <ol><li> Devam önce, enfeksiyon riski yüksek verim için emin olmak için flöresanlı bir mikroskop altında, hücrelerin floresans durumunu kontrol edin. Değilse, Infect kontrol &quot;bölümüne bakıniyonu &quot;. </li><li> Hücreler izdiham en az% 80 ulaştı varsa aşağıdaki işlemleri; Aksi önce işlem için ek bir gün bekleyin. </li><li> Ortamı çıkarın ve hücreleri ayırmak için TrypLE maddesi 1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe </li><li> Tarif from1.2.2.2 gibi tekrarlayın - 1.2.2.6 10 8 MOI&#39;da MyoD virüs ekledi. </li></ol></li><li> 3. Gün <ol><li> Dikkatle virüs içeren orta kaldırmak ve mTeSR1and iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ile değiştirin. </li><li> Matrigel Plaka MEF&#39;ler enfekte olmuş hücrelerin yayılmasını sağlamak için ertesi gün için 2.5 x 10 5 / cm 2 plakaları kaplı. </li></ol></li><li> 4. Gün <ol><li> Ortamı çıkarın ve hücreleri ayırmak için TrypLE maddesi 1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe </li><li> 15 ml Falcon tüpüne transfer hücreleri, 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj HESC orta ve 9 ml ekleyin. </li><li> Raldır süpernatan ve HESC orta 6 ml yeniden askıya. </li><li> Her bir MEF&#39;ler ihtiva eden 3 ml dağıtma 1:2 bir bölünme oranında MEF&#39;ler ihtiva eden 6 oyuklu plaka ve plaka hESC orta çıkarın. Koloniler izdiham ulaştığınızda! TIP, MyoD/BAF60C-infected hücrelerin bazı kuyularında bir rezerv stok olarak sıvı nitrojen içinde dondurulmuş olabilir. Donma orta 90 KOSR% ve% 10 DMSO artı 2 mM iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Desteği içerir. Geri kalan kuyular sonra farklılaşma protokole maruz olabilir - açıklama için aşağıya bakınız. Daha hücreleri daha myospheres üretmek için gerekli aşağıdaki gibi, enfekte HESC daha çoğaltılabilir: </li><li> Ortamı çıkarın ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1 mg / ml kollajenaz IV, 1 ml &#39;si ile inkübe </li><li> Kollajenaz IV çıkarın ve HESC ortamın 1 ml. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında 10 ml ucu ile koloniler kazımak. </li><li> Coloni ve parçaları toplayın, 15 ml bir tüp içinde ve 3 dakika boyunca tortu izin es. Daha sonra, bir oran 01:04 ile MEF&#39;ler tabakalarına HESC orta ve plaka içindeki süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın. </li></ol></li></ol></li><li> Enfeksiyon kontrol etme <ol><li> Hücreleri yayılan iken, RNA analizi için hasat ve (Temsilcisi sonuçları görmek) her aşamada doğru biyolojik durumu yansıtır biyobelirteçlere kontrol etmek için immünofloresans tarafından protein ekspresyon analizi gerçekleştirmek için daha küçük bir ölçekte enfekte hücreleri plaka tavsiye edilir. Yüksek titre lentivirüsler için beklenen enfekte olan hücrelerin yüzdesi en az% 80 olmalıdır. </li><li> Yüksek verim sağlamak için, lentiviral vektörler, floresan bir seçim işaretleyicisi ve / veya bir antibiyotik direnç sokulması, modifiye edilebilir. BAF60C ifade Bizim lentiviral Plazmid aynı zamanda GFP floresan taşır. </li><li> Bir floresan işaretleyici için hESC sıralama. Enfeksiyonunun düşük verimlilik durumunda floresan a kullanılması önerilirBAF60C virüs eksprese eden hücreler için zenginleştirmek ve daha sonra yüksek titre MyoD virüs ile enfekte etmek için hücreler (FACS-sıralama) sıralama ctivated hücreleri. <ol><li> Orta iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek sıralama gün önce ekleyin. </li><li> Sıralama günü, (günde 0 açıklandığı gibi) TrypLE tarafından hücreleri ayırmak ve FACS-tüplerde KO yedek serum artı iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Eki&#39;nde hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Sıralama sonunda, iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Desteği ekleyerek MEF&#39;ler plakalar üzerinde KO yedek serum ve plakadaki hücreleri toplamak. </li></ol></li></ol></li></ol> 2.. EB-benzeri İndüksiyon ve Farklılaşma <ol><li> Indüksiyon ve farklılaşma prosedür <ol><li> Gün 0 - EB indüksiyon <ol><li> Kuyunun (Şekil 2C) koloni sayısının yüksek olması, BAF60C/Myod-infected hESC farklılaşma başlamadan önce, emin olun. </li><li> Her bir Raldır ortam, PBS ile yıkayın ve 1 mg / ml kollajenaz IV, 1 ml. 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe </li><li> Kolajenaz çıkarın ve EB ortamın 1 ml. </li><li> , Bir teşhir mikroskopu altında hızlı bir şekilde, mekanik olarak 10 ml ucu ile kazınarak 400-800 hücre agregalar halinde kolonileri ayırmak. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde koloni parçalarını toplamak ve 3 dakika boyunca çöktürmek için izin verir. Süpernatantı, EB ortamının 3 ml yeniden askıya ve 6-kuyulu düşük bağlanma plakanın bir çukuruna hücre süspansiyonu aktarın. </li></ol></li><li> Gün 1 <ol><li> Geçmeden önce koloni büyüklüğü ve hücre ölümünü edin. Büyük parçalar varsa, bir 5 ml pipet, 3-4 kez hafifçe yukarı pipetleme ve onları yıkmak. Hücre ölümü çok yüksek ise (bir çok yüzer hücreler ve döküntüler) çekimi ile bir 15 ml&#39;lik bir tüp içinde agregalar toplayarak orta yerine taze ortam EB 3 ml ile levha, aşağıdaki gibi başka bir devam edin. </li><li> Ekle 1.5kuyu taze ortam ml EB </li></ol></li><li> 2. Gün <ol><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde kuyulardan agrega toplayarak orta değiştirin. Onları 2 dakika sakin olalım. </li><li> Süpernatantı taze EB orta 3 ml ile değiştirin ve aynı kuyuların üzerinde dağıtabilir. </li></ol></li><li> 3. Gün <ol><li> Kuyularda taze EB orta 1.5 ml ekleyin. </li></ol></li><li> 4. Gün <ol><li> &quot;2. Gün&quot; de anlatıldığı gibi devam edin. </li></ol></li><li> Gün 5 - EB-benzeri kümeler (Şekil 2B) ve andMyogenic farklılaşması. <ol><li> 2.1.3.1 tarif edildiği gibi agrega toplayın ve 2 ml PBS ile bir kez yıkama; toplanmış çöktürmek için izin verir. </li><li> PBS çıkarın ve DM orta 3 ml ekleyin; Aynı kuyu üzerinde plaka. </li></ol></li><li> Gün 6 - Gün 20 <ol><li> D6 kaynaktan d20 için her 3 günde bir, taze ortam ile orta yerine. Temsilci myospheres F gösterilirŞEKIL 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Denetleme myosphere farklılaşma <ol><li> Daha fazla ilerlemeden önce, bir önceki protokol JoVE 12&#39;de tarif edildiği gibi, OCT bileşiği içine gömülü myospheres bölümleri yaparak myospheres içinde miyojenik farklılaşma etkinliğini kontrol etmek için önerilmektedir. Böyle myognenin gibi miyojen belirteçleri (klon F5D, DSHB) ve miyozin ağır zincir (klon MF20, DSHB) (Temsilcisi sonuçları görmek) için bir imünoflüoresans lekeleme gerçekleştirin. Bu, 5 dakika boyunca sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.5 ile işlenerek antijen alma gerçekleştirmek için kritiktir EB bölümlerinde myogenin için boyama ile başarılı olmak için! Uç. Buna ek olarak, bu F5D ve MF20 antikorlar kullanılarak çift boyama için bu protokolü kullanmak mümkündür. </li></ol></li></ol> 3.. Medya Tarifler <ol><li> ESC orta DMEM-F12 1 mM L-glutamin % 20 Knockout Serum değiştirme ortamı (KOSR) 0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA) 50 U / ml penisilin / streptomisin (Pen / Strep) 0.1 mM beta-merkaptoetanol 8 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) </li><li> EB orta DMEM F12 1 mM L-glutamin % 15 FBS % 5 at serumu </li><li> DM ortamı DMEF F12 1X ITS Sıvı Medya Desteği 1X N-2 Ek </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada önerilen protokol doğrudan hESC kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeleri oluşturmak için nasıl açıklar. Önerilen strateji tarama deneyleri ve gelişim çalışmalarında hem modeli &quot;bir çanak içinde hastalık&quot; olarak uygun olabilir süspansiyon mini kasları üretmek için görülmemiş ve olağanüstü bir potansiyele sahip. Ayrıca, hESC myospheres üretmek için yöntem basittir ve tipik olarak geri kazanılan hücre verimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan farklılaşması sırasında herhangi bir FACS-ayırma adımı gerektirmez. Bu, tek hücre içine EB bir ayrışma olduğunu ima eder Bunun yanı sıra, farklılaşması sırasında bir ayırma prosedürü toplama müdahale olacaktır. Önerilen yöntem, pluripotent kök hücrelerde ifade olmayan özel faktörlere ve MyoD BaAF60C ile hESC epigenetik reprograming dayanmaktadır. MyoD ve BAF60C &quot;çekirdek&quot; protein kompleksi TH sağlamakişaretleri de transkripsiyon iskelet miyojen programı etkinleştirmek için devam hangi genomik loci. Bu iki faktör lentiviral enfeksiyonların yoluyla hücrelere teslim ve bütün hücrelerde her iki faktörün enfeksiyon yüksek verim elde etmek için kritiktir edilir. Bu yüksek titreli bir virüs ya da seçim işaretçileri sahip virüs kullanılarak elde edilebilir. Kültür koşulları da kas kaynaklı farklılaşma ölçüde optimize de önemli bir rol oynamaktadır. Iskelet myotubes miyojen öncüllerinin dönüşüm elde etmek - Biz, serum serbest tanımlanmış ortamda inkübasyon (ITS insülin transferin içeren) izledi miyojen öncüleri kümeler halinde hESC ifade MyoD/BAF60C farklılaşması için bir serum bazlı farklılaşma protokol öneriyoruz. Ancak, diğer tanımlanmış medya eşit veya daha iyi miyojen farklılaşma elde etmesi mümkündür. Protokolün bir akım sınırlama yanında içeren, fetal sığır serumu, kullanımına dayanır olmasıdırbirçok hayvan proteinleri ve maddeler ing, çok partiye farklılıklar göstermektedir. Bu myospheres içinde kas kaynaklı dönüşümü daha düşük verimlilik veya heterojen neden olabilir. Notun, BAF60/MyoD-expressing hESC türetilen tüm EB-benzeri yapılar myospheres değil; yani, bazı tamamen myofibers oluşan EB gibi agrega vardır. (Sonuçlar bakınız) protokolünün sonunda gerçekleştirilen EB bölümleri üzerinde imüno-boyama ile tahmin edildiği üzere, normal BAF60C ve MyoD ifade hESC türetilen myospheres sayısı 30 ila 60% arasında değişebilir. Sadece myospheres için bir kültür çanak zenginleştirmek için olası bir yaklaşım miyojen muhabiri kullanmak olacaktır. Bu, kısmen ya da farklılaşmış EB benzeri gruplar atarak ve sadece myospheres seçerek kolaylaştıracaktır. Son olarak, tanıtılan faktörlerin zamansal şartları altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması teslimat yöntemi geliştirmek için yararlı olacaktır. Örneğin, BAF60C ve MyoD sadece sh için gereklidirort zaman doğru yönde &quot;tekme&quot; hücreleri için, modifiye mRNA teslim dayalı yöntemler uygulanabilir olabilir. Faktörleri hücreler, endojen proteinler istismar önce daha uzun bir süre için gereklidir Buna karşın eğer, epizomal bir yaklaşım değişkenliği ve genomuna entegrasyonu nedeniyle kontrolsüz etkilerini ortadan kaldırmak için tavsiye edilir. Son olarak, bu önce, iskelet kas içine HESC dönüşüm elde etmek için ya da MyoD (hiçbir zaman sonra) ile aynı anda BAF60C ifade etmek için zorunlu olduğunu not edin. BAF60C önceden ekspresyonu için gereksinim muhtemelen genom 6,15 ile uygun MyoD kromatin dağıtımı için epigenetik manzara ön ayar rolü dayanır. Gibi, gelecekte protokoller bileşikler veya hESC BAF60C ifadesini destekleyen diğer manipülasyonlar tarafından geliştirilmiş olabilir.

Pluripotensini koruyarak çünkü kendi benzersiz yeteneği kendini yenilemek, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) rejeneratif tıpta paha biçilmez bir kaynak olarak kabul edilir. In vitro hastalık modelleme için iskelet kaslarının hastalıklı kas ve HESC-veya uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin hücre aracılı iskânından Kök (iPSC) türetilmiş nesil tedaviler belirlenmesi ve birçok nöromüsküler hastalıkların patogenezi tanıtılması amaçlanmıştır çalışmaların önemli hedefleri vardır. Ancak bu çalışmalar iskelet kası hücrelerine dönüştürmek için hESC direnci ve iskelet Miyogenesis doğru HESC-taahhüdünün moleküler düzenlenmesi ile ilgili bilgilerin azlığı meydan olmuştur. Gerçekten de, hESC iskelet kası ata hücreleri üretmek için daha önceki girişimler sadece embriyoit gövde (EB) türetilmiş yavrularıyla veya mezenkimal hücreler transkripsiyonel aktivatör elemanının ve ektopik ifade (alttaki iskelet Miyogenesis aktif hale getirmek için yeterli olduğunu ortaya örPax3 veya Myf5) 1-3 ya da özel kültür koşulları 4-5 maruz kalma. Daha önce (SMARCD3 tarafından kodlanan) SWI / SNF bileşen, BAF60C, kas özel lokusların 6 MyoD aracılı aktivasyonunu sağlar: transkripsiyonel makinelerin önemli bir bileşen olduğunu göstermiştir. Yakın zamanda BAF60C seçici olmaması HESC üzerine başka bir somatik hücreler 8-10 ifade BAF60C gözlenmiştir iskelet Miyogenesis 7&#39;nin MyoD aracılı aktivasyonu için direnç kazandıran keşfettiler bir işlem genel olarak kas kaynaklı dönüştürme anılacaktır. BAF60C Zorla ifadesi doğrudan BAF60C ve miyojen soy 7 doğru hESC taahhüt epigenetik bir imza heybetli myod ile, belirli bir kültür şartlara bağlı, hESC iskelet Miyogenesis etkinleştirmek için myod sağlar. Not, önceki proteomik analiz BAF6 seçici olmadığını ortaya0C, SWI / SNF bileşenleri arasında, EKH 11. Biz üç boyutlu kasılma oluşturmak için toplanmış olabilir iskelet miyoblastların homojen bir nüfus nesil lider, miyojenik soy üzerine hESC epigenetik bir taahhüt altına bu bilgi kullanılır yapıları (myospheres), işlevsel taklit minyatür iskelet kasları 7. Nitekim, hESC iskelet kas atalarıdır üreten bizim yöntem böyle hücresi gibi hücreler farklılaşma sinyallere maruz kadar fenotipik gizildir miyogenik soyu, için hESC epigenetik taahhüt dayanır farklılaştırma ortamı içinde toplama ve kültür (belirli bir protokol bakınız). Bu strateji epigenetik iskelet kası soy kararlı ve histolojik iskelet ve fonksiyonel özellikleri özetlemek üç boyutlu kasılma myospheres oluşumuna uygun olan hESC bir homojendirler ve genişlemesine izin verenkaslar. Myospheres kas hastalıklarının modeli bir &quot;bulaşık hastalık&quot; için işletilebilir minyatür kasların ilk kanıt. Hasta türetilmiş iPSCs üretilen, bu myospheres tedavi edici bileşiklerin yüksek veri akışı tarama için bir araç olarak büyük potansiyel sunan ek olarak, uzun süredir devam eden gelişim soru aydınlatmak için potansiyel ve nadir hastalıkların patojenezi. Ayrıca Gomes et al. 12 ile bir JoVE protokolde tarif edildiği gibi analiz myosphere hemen tek bir okuma, bölme immünohistokimyasal olarak temin edilebilir olduğuna dikkat

<table><tbody><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>6-well low attachment plate</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>GFR Matrigel</td><td>BD Biosciencies</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEFs (growth arrested)&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>1 mM L-glutamine (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ITS Liquid Media Supplement</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>N2-supplement&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Invitrogen</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;https://www.stemgent.com/products/193&quot;&gt;hES Cell Cloning &amp;amp; Recovery Supplement&lt;/a&gt;</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-100</td><td></td></tr><tr><td>bfgf</td><td>Sigma</td><td>4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Anti-myogenin</td><td>DSHB</td><td>F5D</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ikinci iskelet kas hücrelerinin homojen ve bol nüfusun Üretimi hücre bazlı terapiler için ve insan nöromüsküler hastalıklar modeli bir &quot;bir bulaşık hastalık&quot; için bir gerekliliktir. Örneğin düşük yoğunlukta ve ilgi nüfus, hem de üç boyutlu kasılma yapıların oluşumu için protokoller eksikliği heterojenlik gibi büyük engel, nöromüsküler bozukluklar için kök hücrelerin kullanımı da sınırlıdır. Biz HESC tanımlanan faktörlerin ektopik getirilmesi ile bu sınırları aşan bir protokol tasarladık - kas belirleyicidir MyoD ve SWI / SNF kromatin karmaşık bileşen BAF60C biçimlenme - iskelet kası hücrelerine hESC yeniden programlamak mümkün olduğunu. Burada protokol HESC türetilmiş miyoblastları oluşturmak ve üç boyutlu minyatür yapılar (myospheres) onların kümelenmeyi teşvik için kurulan açıklayan fonksiyonel taklit minyatür iskelet kasları 7 </sup&gt;.

Şekil 1A protokolünün şematik hESC myospheres oluşturmak için önerilen gösterir. (Oklar ile belirtilen) kontrol etmek için en önemli adımlar hESC enfeksiyonun etkinliği ve myospheres içindeki kas kaynaklı dönüştürme bulunmaktadır. Deneylerde GFP floresan taşıyan lentiviral vektör kodlama BAF60C yararlanmak. Genellikle BAF60C ifade nüfus için zenginleştirmek için enfeksiyondan sonra BAF60C ve FACS-sıralama 72 saat ile hücreleri enfekte etmektedir. Hücreler izdiham yaklaşık% 70-80 ulaştığında, biz MyoD lentivirüsünün ile enfekte. İlk enfeksiyondan sonra, normal olarak bu izdiham ulaşmak için, hücreler için iki ya da üç gün sürer. Şekil 1B bulaşmamış HESC misli indüksiyon göreceli olarak eksojen genlerin ifade seviyelerini gösterir. Şekil 1C tanıtılan faktörlerin protein seviyesinde ifade ve dağılımını gösterir. BAF60C<html> MyoD ifade MyoD antikoru ile bağışıklık fluorışıması yoluyla tespit edilir ise ifade GFP floresan olarak gösterilir. Biz EB gibi agrega içine enfekte hESC farklılaşma başlatmak gün Günü 0 düşünün. DM ortamı içinde 15 gün sonra, myospheres bir kısmı (genelde bir bütün oyuk) bileşik 12 Ekim gömülü ve kas kaynaklı dönüştürme etkinliğini kontrol etmek için kas kaynaklı işaretleri için immünofloresan gerçekleştirmek için kesilir. Şekil 1D myogenin ve miyozin ağır zincir için temsili boyamasını göstermektedir optimal miyojen farklılaşma. Myospheres belki de daha küçük myospheres ile füzyon sonucunda, farklı ya da anormal şekillere sahip olabilir. Günün 10 başlayarak, (film 1 ve 2 bakınız) myospheres sporadik daralmayı gözlemlemek mümkündür. 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. A) hESC. B&#39;den myospheres) BAF60C ve MyoD (H9-BM) QRT-PCR ile gözlenmiş ve katı bir endüksiyon olarak ifade ile enfekte HESC olarak dışsal genin mRNA seviyeleri üretimi için kullanılan protokol şematik olarak enfekte hESC taklit göre nedeniyle. D) immünofloresan Myogenin için boyandı myosphere bölümlerinde gerçekleştirilmiştir vektöründe IRES-GFP elemanı (MYOG için MyoD boyama (kırmızı) ve BAF60C floresan (yeşil) arası (H9-ctr). C) immünofloresan görsel ), miyozin ağır zincir (MyHC) ve DAPI için zıt (İmmünofloresan detaylarını görmek). Ölçek çubuğu 100 mikron. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Şekil 2. Farklı aşamalarında hücre görünümü Temsilcisi resimlerifarklılaşması (Bölüm II) için enfeksiyon (part I) protokolü. Ölçek çubuğu 100 mikron. EB-benzeri yapıların ise d1 den d5 şekil (D) çoğunlukla dairesel, Şekil 1A şeması beklenmeyen bir şekil sunmak ve kültür heterojen göre 15 gün içinde büyüdü myospheres; E ve F iki örneklere bakın.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Görüntüleme.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları. 

Video: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Gelişim Biyolojisi

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

Biyoloji

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening is purely diagnostic and does not elucidate disease mechanism. Although cells from aneuploid fetuses are valuable biological material bearing the chromosomal aneuploidy, these cells are short lived, limiting their use for downstream research experiments. Generation of induced pluripotent stem cell (iPSC) models is an effective method of cell preparation for perpetual conservation of aneuploid traits. They are self-renewing and differentiate into specialized cells reminiscent of embryonic development. Thus, iPSCs serve as excellent tools to study early developmental events. Turner syndrome (TS) is a rare condition associated with a completely or partially missing X chromosome. The syndrome is characterized by infertility, short stature, endocrine, metabolic, autoimmune and cardiovascular disorders and neurocognitive defects. The following protocol describes isolation and culturing of fibroblasts from TS (45XO) fetal tissue, generation of integration free TSiPSCs through delivery of episomal reprogramming plasmids by nucleofection followed by characterization. The reprogramming TSiPSCs were initially screened by live cell alkaline phosphatase staining followed by extensive probing for pluripotency biomarkers. Selected colonies were mechanically dissected, passaged several times and stable self-renewing cells were used for further experiments. The cells expressed pluripotency transcription factors OCT4, NANOG, SOX2, cell surface markers SSEA 4 and TRA1-81 typical of pluripotent stem cells. The original 45XO karyotype was retained post reprogramming. The TSiPSCs were able to form embryoid bodies and differentiate into cells of endoderm, mesoderm and ectoderm expressing lineage specific biomarkers ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAIN&#945;/&#946;), (&#946;III TUBULIN)). The exogenous episomal plasmids were lost spontaneously and not detected after passage 15 in cells. These TSiPSCs are a valuable cellular resource for modelling defective molecular and cellular neurodevelopment causing neurocognitive deficits associated with Turner syndrome.

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome 45XO Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

This protocol describes the generation of integration free iPSCs from fetal tissue fibroblasts through delivery of episomal plasmids by nucleofection followed by description of methods used for iPSC characterization and neuronal differentiation.

Sendromla İlişkili Nörolojik Açıkların Aşağı Akış Modellemesi için Turner Sendromundan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin (45XO) Fetal Hücrelerinin Üretimi

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Generating and Maintaining Astrospheres Using Human Pluripotent Stem Cells

Source: Cvetkovic, C., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58034">Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a method to generate astrospheres from progenitors from human pluripotent stem cells. It involves the growth and proliferation of stem cells with nutrient media containing growth factors and kinase inhibitors. These cells then aggregate and differentiate into astrocytes, forming astrospheres.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerini Kullanarak Astrosferlerin Üretilmesi ve Bakımı

1. Cell Culture and Reagent Preparation

	Prepare coated plates for cell culture.
	
		Dilute extracellular matrix (ECM) coating solution with DMEM/F12 ...