Yazarlar biyoreaktör sağlamada yardımcı olan QuinXell Teknolojileri ve CellD, özellikle Lothar Grannemann Dominique Ghozlan kabul etmek istiyorum. Biz pullulan / dekstran polisakkarit iskeleleri ile bize sağladığı Catherine Le Visage, teşekkür ederim. Bu çalışma, Avrupa Birliği (ERC-2014-ağırlık merkezi projesi Matisse 648779) tarafından ve AgenceNationalede la Recherche (ANR), Fransa (MagStem proje ANR-11 SVSE5) tarafından desteklenmiştir.

Manyetik Cihazların 1. İnşaat Not: Hücre ekimi için kullanılan cihazlar, uygulamaya bağlı olarak değişir (Şekil 1). Manyetik uçları (çapı 750 mm), çok ince olmalıdır, böylece agrega oluşturmak için, hücrelerin sayısı, 2.5 x 10 5 / agrega ile sınırlıdır. 1.8 cm 2/7 mm kalınlığında iskeleleri tohum için, mıknatısların daha büyük (Çapı 3 mm) olması gerekir ve skafold gözeneklerinin içinden hücre göçünü sağlayacaktır. <ol><li> Agregat oluşumu için mikro-mıknatıs olan bir cihaz yapımı (Şekil 1A) <ol><li> alüminyum plakalar içinden bir 0.8 mm matkap ile mikro-delikleri (3 cm çapında ve 6 mm kalınlığında) konur. </li><li> plakanın her deliğe, bir manyetik uç (çapı 750 mm) yerleştirin. </li><li> doygunluk manyetizasyonu sağlayan kalıcı bir neodim mıknatıs, üzerinde bu disketi yerleştirin. </li></ol></li><li> iskele tohumlama için bir cihazın İnşaat ( <strOng&gt; Şekil 1 B) <ol><li> 2.4 cm2 kareler halinde sert polistiren kesin. </li><li> 1.6 cm2 &#39;lik bir yüzey alanı üzerinde eşit mesafede 9, küçük mıknatıslar (çap 3 mm uzunluğunda ve 6 mm) takın. </li><li> Kalıcı neodim mıknatıs üzerinde bu cihazı yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Kök Hücre Etiketleme NOT: 30 dakika (5 ± 0.4 pg demir / hücre) tohum için 0.2 mM manyetik nano partiküller ile etiketlenmiştir Kök hücreleri, 30 dakika boyunca (2.6 ± 0.2 pg demir / hücre) agregatlar oluşturması için 0.1 mM manyetik nano partiküller ile etiketlenmiştir iskeleleri. Bu nanoparçacık konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri, daha önce kullanılmış, MSC ve diğer hücreler 18, 19 için yayınlanan ve nanopartiküller ne hücre canlılığı veya MSC farklılaşma kapasitesi etkilenmiş olduğu tespit edilmiştir edilmiştir. kök hücre ile bu buluşa katılan demir kütlesi tek ce ile ölçüldüII magnetophoresis 19, 20. <ol><li> Civarındaki kadar 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 seviyesinde tam mezenkimal kök hücre büyüme ortamı (MSCGM) Kültür mezenkimal kök hücreler (MSC) (~% 90) birbirine kaynaşma seviyesine kadar. </li><li> Glutaminsiz Roswell Park Memorial Institute (Kan numuneleri) modifiye edilmiş serumsuz McCoy&#39;un 5A ortamında ve 5 ihtiva eden: 0.1 ya da 0.2 mM maghemit sitrat-kaplı demir oksit (8 nm çapında ana γFe 2 O 3) karıştırılması ile, manyetik işaretleme çözeltisi hazırlayın mM sodyum sitrat. </li><li> , Orta atın glutamin içermeyen serumsuz RPMI ortamı ile hücrelerin durulama ve 150 cm2&#39;lik kültür şişesi, tüm hücreleri karşılamak için gerekli olan minimum hacim başına demir oksit nanopartiküllerinin çözeltisi 10 ml. </li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin ve daha sonra nanoparçacık solüsyonu atın. nan içselleştirme glutamin içermeyen serumsuz RPMI ortamı 5 dakika boyunca durulamaoparticles hala plazma membranına bağlı. </li><li> RPMI ortamı atılır ve kap başına tam MSCGM ortamı 25 ml. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir ve% 5 CO2. </li></ol> 3. Manyetik Hücre Ekme <ol><li> Taze 50 uM L-askorbik asit 2-fosfat, 0.1 uM deksametazon, 1 mM sodyum piruvat, 0.35 mM L-prolin,% 1 evrensel kültürü eklenerek Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), L-glutamin ile, yüksek glukoz kullanılarak kondrojenik ortamı hazırlamak insülin, insan transferrin ve selenik asit (ITS-karışımlar) ve 10 ng / ml, transforme edici büyüme faktörü-beta 3 (TGF-β3) içeren ek. </li><li> 5 dakika boyunca 260 x g&#39;de% 0.05 150 cm2&#39;lik kültür şişesi başına tripsin-EDTA ve santrifüj ayrışmış hücreleri 8 mL kullanılarak manyetik hücre ayırın. orta aspire ve yeniden süspansiyon haline hücreleri sayın. </li><li> Her iki manyetik cihazların üstünde bir cam tabanlı hücre kültürü Petri kabı (35 mm) yerleştirin. </li><li> magnetically agrega başı (yatırılabilir 16 agrega kadar) 2.5 x 10 5 etiketli hücreler ihtiva eden mümkün olan en küçük bir hacmi (en fazla 8 uL) yatırma yavaşça Petri kabı kondrojenik orta 3 mL ekleyin ve agregatlar oluştururlar. Bu sferoidler oluşmasına izin vererek, taşımadan 20-30 dakika süreyle Petri kabı bırakın ve daha sonra 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 inkübatörü içinde, 16 agrega içeren Petri kabı da dahil olmak üzere, komple bir cihaz yerleştirin. </li><li> Form kontrolü agrega aynı protokolü takip ve TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamla tam orta yerine. <ol><li> 3D toplam yapı üretmek 8 çiftleri oluştururlar ve füzyon başlatmak için günde 8 temas eden 2 agrega yerleştirin. Gün 11, 4 dördüz oluşturmak üzere 2 çift durumlar birleştirme. Son olarak, nihai bir yapı elde etmek günde 15 4 dördüz kaynaştırmak. </li><li> Aynı zamanda, x 10 5 2.5 santrifüjleme ile bir araya toplanırlar 260 ° kök hücreleri etiketli15; ya da TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamın 1.5 mL, 15 ml tüpler içinde 5 dakika boyunca gr (numune ve kontrol için, sırasıyla). </li></ol></li><li> Tohum iskeleleri manyetik olarak için, bir Petri kutusu içine her kurutuldu iskele yerleştirin. Pullulan / dekstran 21 yapılmış polisakarit gözenekli iskeleleri kullanın. Her bir yapı iskelesi için, TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamın 350 uL 2 x 10 6 etiketli kök hücreleri sulandırmak ve dikkatli bir şekilde bir yapı iskeleti içine hücreleri pipetle. <ol><li> iskele içinde tam hücre penetrasyonu imkan vermek için 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra yavaşça veya Petri kabı (sırasıyla numune ya da kontrol için,), TGF-p3 olmadan kondrojenik orta 3 ml. </li><li> Iskele gözenekler ve sınırlandırılması yolu ile hücre göçü için izin vermek üzere 2 ila 4 gün boyunca CO, 37 ° C&#39;de, manyetik cihazda cellularized iskele inkübe ve% 5. </li></ol></li><li> Aynı zamanda, özellıklerı tohum 2 x 10 6 </s&gt; Yukarı etiketli kök hücreler aynı yöntemi izleyerek ve pozitif kontroller olarak eşit seri başı iskeleleri elde etmek mıknatıs olmadan inkübe edin. </li></ol> Kondrositlere 4. Farklılaşma NOT: 4 günlük kuluçkadan sonra, mıknatıslar kaldırıp kondrojenik olgunlaşmasını ya bir Petri kabı (statik koşullar) veya bir biyoreaktör (dinamik koşullar) içinde devam ediyor. Negatif kontrol numuneleri TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamla statik koşullarda olgunlaştırılır. <ol><li> Statik koşullarda, aynı Petri kabındaki cellularized iskele veya agrega tutun. 21 gün boyunca haftada iki kez kondrojenik orta değiştirin. </li><li> Dinamik koşullarda, biyoreaktör hazırlayın. <ol><li> üreticinin protokolüne uygun olarak uygun uzunlukta silikon tüp kesin. </li><li> 500 ml&#39;lik kültür odası, boru, 2-yollu rotatorlar ve kafesler: tüm malzemeleri otoklava. </li><li> steril microbio içine biyoreaktör parçaları yerleştirinMantıksal güvenlik istasyonu. Üreticinin talimatlarını takip 2 yönlü rotatörlerde ve kültür odasına boru bağlayın. </li><li> Dikkatle steril bir spatula kullanılarak sterilize kafeslerin içine cellularized iskele aktarın. kafes başına 2 iskeleleri yerleştirin. kafesleri hazır olduğunda, daha fazla rotasyon sırasında hareket onları tutmak için kapağın iğne içine yerleştirin. kondrojenik ortam ile kültür odası doldurun ve kafesleri içeren kapak ile kapatın. </li></ol></li><li> kondrojenik ortamla boru doldurmak için ve hava kabarcıklarını yok etmek için peristaltik pompa açın. </li><li> Yerleştirin ve biyoreaktör motora doldurulur odasını güvenceye ve kolun ve odanın her iki rotasyonları kontrol eden bilgisayar, açın. </li><li> kol ve bölme her iki dakika başına 5 dönüş (rpm) bir dönme hızı uygulanır. cellularized iskelelerinin sürekli beslenmesi için 10 rpm&#39;de bir akış hızında peristaltik pompa ayarlayın. </li></ol> Not: RNA ekstraksiyonu önce, bir enzimatik solüsyon ile iskeleleri sindirimi. <ol><li> pululanaz, 100 uL (40 U / mL) ve serum içermeyen DMEM ortamı 850 mL dekstranaz 50 uL (60 mg / ml) eklenerek enzimatik solüsyon 1 mL hazırlayın. </li><li> Serum içermeyen DMEM ortamı ile iki kez iskeleleri durulayın orta atmak ve iskele başına enzimatik çözeltisinin 800 uL ekleyin. , hafifçe çalkalanarak 37 ° C&#39;de 15-30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> iskele tamamen çözülür, dikkatli bir şekilde orta aspire, 10 dakika boyunca 300 x g &#39;de bir 1,5-ml tüp hücreleri ihtiva eden çözelti, santrifüj transferi x 1 steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS), santrifüj ile iki kez durulama 300 x g&#39;de 10 dakika ve RNA izolasyon çözeltisi içinde hücreler yeniden askıya. </li><li> , Agrega RNA çıkarmak RNA izolasyonu çözeltisi içinde sferoidler yerleştirmek için veTamamen RNA ekstraksiyonu yapılmadan önce bir homojenleştirici kullanarak ezmek. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, toplam RNA ekstraksiyonu için bir kit kullanılarak RNA izole edilir. </li><li> DNTP karışımı 1 uL (10 mM), 40 U / ml RNaz inhibitör rastgele primerler 250 ng kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkriptaz kullanılarak toplam RNA 400 ng tamamlayıcı DNA sentez; reaksiyonun nihai hacmi, 20 uL&#39;dir. Reaksiyonun sonunda, 100 uL nihai hacim elde etmek üzere damıtılmış su 80 uL ekleyin. </li><li> kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için, 10 x seyreltildi cDNA ile, örneğin agrekan (AGC) ve kolajen II&#39;ye (Col II) ilgi konusu genlerin, göreceli ifade miktarını belirlemek için bir floresan madde içeren bir PCR karışımı kullanılır. referans gen ribozomal protein, büyük, P0 (RPLP0) ile gen ekspresyonunun seviyelerini normalize. AACT formülü - 2 ile hesaplamalar gerçekleştirin, AACT = ACt farklı durumun burada - Kontrol koşulu ACt anlamına gelir ve her bir ACt ilgi konusu genin, CT temsil eder - referans gen (RPLP0) arasında CT. </li><li> ortalama değerler ortalama (SEM) ± standart hata olarak istatistiksel ölçümleri belirler. n ≥ 2 bağımsız deneylerle analizi gerçekleştirin. santrifüj edilmiş peletler ve manyetik füzyonları (* p &lt;0.05) arasında istatistiki farklılıklarını analiz etmek için, Student t-testi kullanın. Kontrol skafold farklı yapı iskeleleri arasında istatistiksel farklılıkları (* p &lt;0.05) analiz etmek için bir Kruskal-Wallis testi (tek yönlü ANOVA parametrik olmayan) ile önem belirler. </li></ol> 6. Histolojik Analiz <ol><li> Steril 1 x PBS ile cellularized iskeleleri veya agregaların durulayın, oda sıcaklığında 1 saat için% 10 formalin çözeltisi içinde çözmek ve 1 x PBS ile yıkayın. </li><li> , PBS çıkarın optimum kesmeye örnekleri gömmekg sıcaklık bileşiği (OCT), ve sıvı azot içine daldırılmış bir izopentan küveti içinde dondurulur. -20 ° C&#39;de örnek saklayın. agregatlar veya cellularized İskele 12 um 8 mikron cryosections elde etmek için bir kriyostat ile örnekleri kesilir. </li><li> tolüen kullanılarak açıklık,% 100 etanol ile dehidre musluk suyu ile durulayın, 2 dakika süre ile% 0.5 toluidin mavisi çözeltisi ile cryosections Leke ve ışık mikroskopi için bir montaj ortamı ile montaj slaydları. </li></ol>

<ol>
	<li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+imaging+in+regenerative+medicine.">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).</li><li>Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+based+stem+cell+tracking+in+regenerative+medicine.">Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine.</a> Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).</li><li>Di Corato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cellular+MRI:+gadolinium+and+iron+oxide+nanoparticles+for+in-depth+dual-cell+imaging+of+engineered+tissue+constructs.">High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs.</a> ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+magnetic+assembly+of+microscale+hydrogels.">Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels.</a> Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).</li><li>Kito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+reparative+angiogenesis.">iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis.</a> Sci Rep. 3, 1418 (2013).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+in+vascular+tissue+engineering:+from+nanoscaffolding+towards+rapid+vessel+biofabrication.">Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication.</a> Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).</li><li>Mattix, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus+magnetic+cellular+spheroids+for+vascular+tissue+engineering.">Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering.</a> Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).</li><li>Henstock, J., El Haj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+mechanotransduction+in+therapeutic+MSCs:+can+remotely+controlled+magnetic+nanoparticles+regenerate+bones?.">Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?.</a> Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).</li><li>Fayol, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+magnetic+forces+to+promote+stem+cell+aggregation+during+differentiation,+and+cartilage+tissue+modeling.">Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling.</a> Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).</li><li>Bartlett, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation+versus+matrix-induced+autologous+chondrocyte+implantation+for+osteochondral+defects+of+the+knee:+a+prospective,+randomised+study.">Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study.</a> J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).</li><li>Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+an+overview+of+technique+and+outcomes.">Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes.</a> ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).</li><li>Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-based+cartilage+tissue+engineering:+cells,+scaffold+and+biology.">Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology.</a> Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).</li><li>Boeuf, S., Richter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenesis+of+mesenchymal+stem+cells:+role+of+tissue+source+and+inducing+factors.">Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors.</a> Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).</li><li>Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+functional+articular+cartilage:+the+current+status.">Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status.</a> Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).</li><li>Schon, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+high-throughput+microtissue+fabrication+process+for+3D+assembly+of+tissue+engineered+cartilage+constructs.">Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs.</a> Cell Tissue Res. , (2012).</li><li>Robert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+micro-manipulations+to+probe+the+local+physical+properties+of+porous+scaffolds+and+to+confine+stem+cells.">Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).</li><li>Luciani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+chondrogenesis+within+scaffolds,+using+magnetic+stem+cell+confinement+and+bioreactor+maturation.">Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation.</a> Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).</li><li>Wilhelm, C., Gazeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+cell+labelling+with+anionic+magnetic+nanoparticles.">Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles.</a> Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).</li><li>Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+magnetic+nanoparticle+aggregation+and+cellular+uptake:+a+precondition+for+efficient+stem-cell+differentiation+and+MRI+tracking.">Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking.</a> Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).</li><li>Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetophoresis+and+ferromagnetic+resonance+of+magnetically+labeled+cells.">Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells.</a> Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).</li><li>Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+polysaccharide-based+scaffolds+using+a+combined+freeze-drying/cross-linking+process.">Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process.</a> Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).</li><li>Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+toxicity+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+(SPION).">Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION).</a> Nano Reviews. 1, (2010).</li><li>Lee, J. H., Hur, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+formation+of+a+millimeter-scale+multicellular+spheroid+with+an+internal+cavity+from+magnetically+levitated+3T3+cells+that+ingested+iron+oxide-containing+microspheres.">Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).</li><li>Mattix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+magnetic+cellular+spheroids+as+building+blocks+for+tissue+engineering.">Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).</li><li>Mazuel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+Intracellular+Biodegradation+of+Iron+Oxide+Nanoparticles+Evidenced+Magnetically+at+Single-Endosome+and+Tissue+Levels.">Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels.</a> ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+generation+of+spheroids+using+magnetic+nanoparticles+for+three-dimensional+cell+culture.">High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture.</a> Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).</li><li>Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+cell-seeding+into+3D+porous+scaffolds+by+use+of+magnetite+nanoparticles.">Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).</li><li>Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticle-based+approaches+to+locally+target+therapy+and+enhance+tissue+regeneration+in+vivo.">Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo.</a> Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).</li><li>Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-axial+mechanical+stimulation+of+tissue+engineered+cartilage:+review.">Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review.</a> Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).</li><li>Takahashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressive+force+promotes+sox9,+type+II+collagen+and+aggrecan+and+inhibits+IL-1beta+expression+resulting+in+chondrogenesis+in+mouse+embryonic+limb+bud+mesenchymal+cells.">Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells.</a> J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).</li><li>Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compressive+strain+influences+chondrogenic+gene+expression+in+human+mesenchymal+stem+cells.">Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells.</a> Biorheology. 43, 455-470 (2006).</li><li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage.">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada sunulan teknikler manyetik nanopartiküllerin içselleştirilmesi güvenmek çünkü hücrelerin içinde lokalize bir kez Birincisi, bir önemli konu nanopartiküllerin sonucudur. Demir nanopartikullerin potansiyel toksisite veya maruz kalma 19, 22 boyutları, kaplama ve zamana bağlı olarak bozulmuş farklılaşma kapasitesi tetikleyebilir doğrudur. Kapsüllenmiş demir nanopartiküllerin magnetoferritin şeklinde, biyolojik manyetik nano parçacık <s...

Manyetik nanopartiküller zaten manyetik rezonans görüntüleme (MRI) için kontrast ajanları olarak klinikte kullanılmaktadır ve bunların tedavi edici uygulamalar genişleyen tutun. Örneğin, son zamanlarda etiketli hücreler implantasyonu, 1, 2, 3 ve belirlenen bir alanda bir dış manyetik alan kullanılarak in vivo olarak manipüle edilebilir ve yönlendirilebilir ve / veya muhafaza gösterilmiştir. Rejeneratif tıpta, vasküler dokuda 5, 6, 7, kemik 8 ve kıkırdak 9 içeren in vitro 4 organize dokular, mühendislikten geçirilmesi için de kullanılabilir. Eklem kıkırdağı zarar meydana geldiğinde çok sınırlı bir hücre dışı matris bileşenlerinin tamiratlar, avasküler bir ortamda batırılır. Bu nedenle, Araştırma, Forh anda anzasının bulunduğu yere implante edilebilir hyalin kıkırdak değiştirmeleri mühendisliği odaklanmıştır. Diğer kondrosit 12, 13 içine ayırt etmek mezenkimal kök hücreler (MSC) kapasitesini vurgulamak sırasında bir otolog değiştirme üretmek için, bir araştırma grupları, bir hücre kaynağı 10, 11 otolog kondrositlerin kullanılmasını araştırmaktadır. Onların kemik iliği örneklemesi oldukça basittir ve bunların fenotipi 14 kaybetme riski sağlıklı kondrosit kurbanını gerektirmez burada değinmeyecek önceki çalışmalarda, biz, MSC seçildi. Kök hücrelerin kondrojenik farklılaşma başlatılması için gerekli erken adım onların yoğunlaşma olduğunu. Hücre kümeleri genellikle santrifüj veya mikrokütle kültürü 15 kullanılarak oluşturulur; Bununla birlikte, bu yoğunlaştırma yöntemleri neither kalın iskeleler de agrega füzyon kontrol etmek için potansiyeli olan, hücre kümeleri oluşturmak için potansiyel göstermektedir. Bu makalede, MSC manyetik etiketleme ve manyetik cazibe kullanarak kök hücrelerin yoğuşmalı için yenilikçi bir yaklaşım açıklar. Bu teknik, bir milimetre çaplı kıkırdak doku 9 elde etmek üzere bir diğeri ile agrega füzyon yoluyla iskele-3D yapıları oluşturmak üzere kanıtlanmıştır. kalın ve büyük yapı iskeleleri manyetik tohumlama da işlenmiş doku boyutunu artırmak implantasyon için daha kolay bir şekilde faydalı olan bir şekil tasarımı ve kıkırdak tamir klinik uygulamalar için potansiyel çeşitlendirilmesi olasılığını sağlamıştır. Burada, doğal polisakaritler, pullulan ve dekstran oluşan gözenekli yapı iskeleleri içine MSC manyetik tohumlama için ayrıntılarıyla protokolü, iskeleler, daha önce kök hücreleri 16, 17 sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Kondrojenik farklılaşma finall olduy hücrelerin yüksek yoğunluğa sahip tohumlanmış iskelesinin matris çekirdek içine sürekli besin ve gaz yayılmasını sağlamak için bir biyo-reaktörde gerçekleştirilmiştir. hücrelere besin, kondrojenik büyüme faktörleri ve gaz sağlamanın yanı sıra, biyoreaktör mekanik stimülasyonu sundu. Genel olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma ile birlikte kök hücreleri sınırlandırmak için kullanılan manyetik teknolojisi, belirgin kondrojenik farklılaşma artırabilir.

<table><tbody><tr><td>Iron oxide (maghemite) nanoparticules (&amp;gamma;-Fe&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>PHENIX - University Paris 6</td><td>Made and given by C. M&amp;eacute;nager</td><td>Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge</td></tr><tr><td>Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds</td><td>LIOAD - University Nantes</td><td>Made and given by C. Le Visage</td><td>Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10&amp;nbsp;M NaOH). Porosity: 185-205&amp;nbsp;&amp;micro;m; Thickness: 7&amp;nbsp;mm; Surface area: 1.8&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>TisXell Regeneration System</td><td>QuinXell Technologies</td><td>QX900-002</td><td>Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cage for scaffolds: Histosette II M492&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>720-0909</td><td></td></tr><tr><td>Mesenchymal Stem Cell (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Three independant batches have been used</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium</td></tr><tr><td>DMEM with Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>No sodium pyruvate, no HEPES</td></tr><tr><td>RPMI medium 1640, no Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>No sodium pyruvate, no HEPES</td></tr><tr><td>PBS w/o CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; w/o MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (10,000&amp;nbsp;U/mL) / Streptomycin (10,000&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution 100 mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGF-beta 3 protein 10&amp;nbsp;&amp;micro;g</td><td>Interchim</td><td>30R-AT028</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Prepare the 1&amp;nbsp;M stock solution diluted in distilled water and store at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pullulanase from &lt;em&gt;Bacillus acidopullulyticus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>P2986</td><td></td></tr><tr><td>Dextranase from &lt;em&gt;Chaetomium erraticum&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>D0443</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA Extraction Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer - Hexamer&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>500 &amp;micro;g/mL: Use diluted 1/2 and put 1 &amp;micro;L per sample</td></tr><tr><td>Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>40 U/&amp;micro;L: put 1 &amp;micro;L per sample</td></tr><tr><td>PCR nucleotide dNTP mix (10&amp;nbsp;mM each)</td><td>Roche</td><td>10842321</td><td></td></tr><tr><td>SyBr Green PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>Step One Plus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4381792</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution 10% neutral buffered</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>OCT solution</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>VWR</td><td>1.15930.0025</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>VWR</td><td>1.08323.1000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium Pertex</td><td>Histolab</td><td>840</td><td></td></tr><tr><td>RPLP0 Primer for qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5&#039;-TGCATCAGTAC&lt;br/&gt; CCCATTCTATCAT-3&#039;;&lt;br/&gt; 5&#039;-AAGGTGTAATC&lt;br/&gt; CGTCTCCACAGA-3&#039;</td></tr><tr><td>Aggrecan Primer for qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5&#039;-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3&#039;; 3&#039;-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5&#039;</td></tr><tr><td>Collagen II Primer for qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5&#039;-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3&#039;; 3&#039;-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5&#039;</td></tr></tbody></table>

3d magnetic stem cell aggregation and bioreactor maturation for cartilage regeneration

Kıkırdak mühendislik, doğal dokusuna benzer bir in vitro fonksiyonel implant oluşturmada zorluklar nedeniyle bir sorun olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda otolog değiştirmeler geliştirilmesi için araştırdı bir yaklaşım kondrositlere kök hücrelerin farklılaşmasını içerir. Bu kondorjenez gereklidir kök hücre sıkıştırılması derecesi başlatmak için; Bu yüzden, hücre çekicilerin olarak minyatür bir manyetik alan kaynakları kullanılarak, kalın yapı iskeleleri ve iskele içermeyen içinde hem de manyetik olarak yoğunlaştırma hücrelerin uygulanabileceğini göstermiştir. Bu durum, manyetik yaklaşım, aynı zamanda, toplam füzyon kılavuz ve skafold içermeyen, organize oluşturmak için kullanılan, üç boyutlu (3D) boyut olarak birkaç milimetre dokular. gelişmiş bir boyuta sahip ek olarak, manyetik tahrikli füzyonuyla oluşturulan doku kolajen II ekspresyonunda önemli bir artış mevcuttur, ve benzer bir gelişme agrekan ifadesi için gözlemlendi. doğal kıkırdak kuvvetleri t tabi tutuldu olarakşapka onun 3D yapısını etkilemiş, dinamik olgunlaşma da yapıldı. mekanik uyaran sağlayan bir biyo-reaktör, 21 günlük bir süre boyunca kültüre manyetik ekildi iskeleleri kullanılmıştır. Biyoreaktör olgunlaşma ölçüde cellularized iskele içine kondrojenezi geliştirilmiş; Bu koşullar altında elde edilen hücre dışı matris, kolajen II ve agrekan zengin oldu. Bu çalışma, geliştirilmiş kondrojenik farklılaşması, her iki iskele içermeyen ve polisakarid iskeleleri için bir biyo-reaktör içinde etiketlenmiş kök hücrelerin manyetik yoğunlaştırılması ve dinamik olgunlaşma yenilikçi potansiyel özetlenmektedir.

İlk olarak, gruplar ayrı ayrı 2.5 x 10 5 etiketli kök hücreleri (Şekil 2A) biriktirilmesiyle mikro mıknatıslar kullanılarak oluşturulabilir. Bu tek agregalar (girişlerinin boyu yaklaşık olarak 0.8 mm), daha sonra ardışık manyetik indüklenen füzyon daha büyük yapılar sayesinde içine birleştirilebilir. Örneğin, kondrojenik olgunlaşma 8. günde, agrega çiftleri oluşturmak üzere çiftler halinde temas halinde yerleştirilmiştir; quadr...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration at JoVE.com

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K Görüntüleme.  UMR 7057 CNRS and University Paris Diderot.  Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir. 

Video: 3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Doku Mühendisliği için iki eksenli Mekanik Yükleniyor Biyoreaktör tasarımı

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Biyomühendislik

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Gelişim Biyolojisi

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

Ferumoxides implantasyonu Kıkırdak Kusur İnsan Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Biyoloji

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Construction, Characterization, and Regenerative Application of Self-Assembled Human Mesenchymal Stem Cell Aggregates

Mesenchymal stem cells (MSCs), characterized by their self-renewal ability and multilineage differentiation potential, can be derived from various sources and are emerging as promising candidates for regenerative medicine, especially for regeneration of the tooth, bone, cartilage, and skin. The self-assembled approach of MSC aggregation, which notably constructs cell clusters mimicking the developing mesenchymal condensation, allows high-density stem cell delivery along with preserved cell-cell interactions and extracellular matrix (ECM) as the microenvironment niche. This method has been shown to enable efficient cell engraftment and survival, thus promoting the optimized application of exogenous MSCs in tissue engineering and safeguarding clinical organ regeneration. This paper provides a detailed protocol for the construction and characterization of self-assembled aggregates based on umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs), as well as an example of the cranial bone regenerative application. The implementation of this procedure will help guide the establishment of an efficient MSC transplantation strategy for tissue engineering and regenerative medicine.

This study describes a method to construct aggregates based on the self-assembly of human mesenchymal stem cells and identifies the morphological and histological characteristics for the regenerative treatment of cranial bone defects.

Mesenchymal stem cells (MSCs), characterized by their self-renewal ability and multilineage differentiation potential, can be derived from various sources ...

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited self-repairing capacity and, most importantly, no definitive treatments, tendinopathy still influences patients&#8217; life quality negatively. Tendon-derived stem cells (TDSCs), as primary precursor cells of tendon cells, play an essential role in both the development of tendinopathy, and functional and structural restoration after tendinopathy. Thus, a method that can in vitro mimic the in vivo differentiation of TDSCs into tendon cells would be useful. Here, the present protocol describes a method based on a three-dimensional (3D) uniaxial stretching system to stimulate the TDSCs to differentiate into tendon-like tissues. There are seven stages of the present protocol: isolation of mice TDSCs, culture and expansion of mice TDSCs, preparation of stimulation culture medium for cell sheet formation, cell sheet formation by culturing in stimulation medium, preparation of 3D tendon stem cell construct, assembly of the uniaxial-stretching mechanical stimulation complex, and evaluation of the mechanical stimulated in vitro tendon-like tissue. The effectiveness was demonstrated by histology. The entire procedure takes less than 3 weeks. To promote extracellular matrix deposition, 4.4 mg/mL ascorbic acid was used in the stimulation culture medium. A separated chamber with a linear motor provides accurate mechanical loading and is portable and easily adjusted, which is applied for the bioreactor. The loading regime in the present protocol was 6% strain, 0.25 Hz, 8 h, followed by 16 h rest for 6 days. This protocol could mimic cell differentiation in the tendon, which is helpful for the investigation of the pathological process of tendinopathy. Moreover, the tendon-like tissue is potentially used to promote tendon healing in tendon injury as an engineered autologous graft. To sum up, the present protocol is simple, economic, reproducible and valid.

A three-dimensional uniaxial mechanical stimulation bioreactor system is an ideal bioreactor for tenogenic-specific differentiation of tendon-derived stem cells and neo-tendon formation.

Tendon Türevi Kök Hücrelerin Tenojenik Farklılaşmasını İndüklemek Için Üç Boyutlu Tek Eksenel Mekanik Stimülasyon Biyoreaktör Sistemi Uygulama

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited ...

Tıp

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a step-by-step method for differentiating induced pluripotent stem cells (iPSCs) into chondrocyte-based spheroids, supporting tissue engineering and cell therapy applications. The differentiation process is carefully structured to promote chondrogenic lineage commitment, beginning with iPSCs cultured in specific media that sequentially guide cells through critical stages of differentiation. Initially, iPSCs are expanded to reach optimal confluency before induction toward chondrogenic lineage using a series of defined media changes. By day 10, cells are transitioned to a chondrogenesis-promoting medium that enhances the formation of chondrocyte-like cells expressing key markers of mature chondrocytes. Further aggregation in 96-well agarose-coated plates leads to the formation of three-dimensional spheroids, which are then cultured in custom mini-bioreactors designed to simulate a microenvironment that encourages extracellular matrix (ECM) deposition. By enabling scalable production of chondrocyte spheroids that mimic native cartilage characteristics, this approach offers a promising, reproducible solution for developing cell-based treatments for cartilage defects, providing broad utility for clinical and research applications in musculoskeletal regenerative medicine.

This study describes a method for producing chondrocytic spheroids by aggregating cells into spheroids under low-adhesion conditions using gravity, followed by culturing the resulting spheroids in mini-bioreactors.

Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...