המחברים מבקשים להודות QuinXell טכנולוגיות CellD, במיוחד לותר Grannemann ודומיניק Ghozlan עזרתם עם bioreactor. אנו מודים קתרין Le Visage, אשר סיפק לנו את הפיגומים פוליסכריד pullulan / dextran. עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי (ERC-2014-Cog פרויקט מאטיס 648,779) ועל ידי AgenceNationalede la משוכלל ונדיר (ANR), צרפת (פרויקט MagStem ANR-11 SVSE5).

1. בניית התקנים מגנטיים הערה: המכשירים המשמשים זריעת תאים משתנים בהתאם ליישום (איור 1). כדי ליצור אגרגטים, מספר התאים מוגבל 2.5 × 10 5 / המצרפי, כך העצות המגנטיות חייבות להיות דקות מאוד (750 מיקרומטר קוטר). כדי לזרוע את פיגומי 1.8 סנטימטר 2/7-עבה מ&quot;מ, המגנטים חייבים להיות גדולים יותר (3 מ&quot;מ קוטר) ויבטיחו נדידת תאי הדרך הנקבובית של הפיגום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית מכשיר עם-מגנטים מיקרו עבור היווצרות המצרפי (איור 1A) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך-חורים מיקרו עם מקדח 0.8 מ&quot;מ באמצעות צלחות אלומיניום (3 ס&quot;מ קוטר ו 6 מ&quot;מ עובי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה מגנטי (750 מיקרומטר קוטר) לתוך כל חור של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים דיסק זה מעל מגנט ניאודימיום קבע, אשר מבטיח המגנטיזציה רוויה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית מכשיר זריעת פיגום ( <strאונג&gt; 1B איור) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פוליסטירן קשה לתוך 2.4 ס&quot;מ 2 ריבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 9 מגנטים קטנים (3 מ&quot;מ קוטר, 6 מ&quot;מ ארוך) במרחק שווה על פני שטח של 1.6 ס&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכשיר על פני מגנט ניאודימיום קבע. </li></ol></li></ol> 2. תיוג תא גזע הערה: גזע תאים תויגו עם 0.1 מ&quot;מ חלקיקים מגנטיים עבור 30 דק &#39;(2.6 ± 0.2 pg ברזל / תא) כדי ליצור אגרגטים, תוך שהם תויגו עם 0.2 מ&quot;מ חלקיקים מגנטיים עבור 30 דקות (5 ± 0.4 pg ברזל / תא) לזרע פיגומים. ריכוזי ננו-חלקיקים אלו פעמי דגירה שמשו בעבר ופורסם עבור MSC ותאים אחרים 18, 19, וזה כבר נקבע כי חלקיקים השפיעו לא כדאי תא ולא יכולת בידול MSC. מסת הברזל המשולבת על ידי תאי הגזע נמדדה באמצעות יחיד CEll magnetophoresis 19, 20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גזע ותרבות המזנכימה האנושי (MSC) במצע גידול תאי גזע mesenchymal שלם (MSCGM) בשעה 37 ° C ו 5% CO 2 עד סמוך למפגש (~ 90%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון תיוג מגנטי על ידי ערבוב 0.1 או 0.2 מ&quot;מ מגהמיט תחמוצת ברזל מצופה ציטרט (γFe 2 O 3; הליבה: 8 בקוטר ננומטר) במדיום 5A של סרום ללא מקוי שונה במכון ממוריאל פארק רוזוול (RMPI) ללא גלוטמין ו המכיל 5 נתרן ציטרט מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את המדיום, לשטוף את התאים עם המדיום RPMI סרום ללא ללא גלוטמין, ולהוסיף 10 מ&quot;ל של תמיסת הננו-חלקיק תחמוצת ברזל לכל בקבוק תרבות 150 ס&quot;מ 2, נפח המינימלי הנדרש כדי לכסות את כל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 ואז להשליך את הפתרון ננו-חלקיקים. השרייה במשך 5 דקות עם סרום ללא בינוני RPMI ללא גלוטמין כדי להפנים את נאןoparticles עדיין מחוברת הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את המדיום RPMI ולהוסיף 25 מ&quot;ל של מדיום MSCGM מלאה לכל בקבוק. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> 3. זריעת תאים מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין את המדיום chondrogenic באמצעות בינוני הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) גלוקוז גבוהה עם L- גלוטמין ידי הוספת 50 מיקרומטר L-אסקורבית חומצה 2-פוספט, 0.1 מיקרומטר dexamethasone, 1 מ&quot;מ פירובט נתרן, 0.35 מ&quot;מ L- פרולין, 1% התרבות האוניברסלית תוסף המכיל אינסולין, transferrin האנושי וחומצה selenous (ITS-Premix), ו 10 ng / mL 3 והפיכת צמיחה גורם-בטא (-β3 TGF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים מגנטי באמצעות 8 מ&quot;ל של 0.05%-EDTA טריפסין לכל בקבוק תרבות 150 ס&quot;מ 2 ו צנטריפוגות התאים ניתק ב 260 × g עבור 5 דקות. לשאוב את המדיום ולספור את התאים מושעה מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצלחת פטרי תרבית תאים תחתית זכוכית (35 מ&quot;מ) על גבי שני המכשירים מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ&#39;agnetically ליצור אגרגטים, להוסיף 3 מ&quot;ל של מדיום chondrogenic אל צלחת פטרי להפקיד את נפח הקטן בעדינות האפשר (לא יותר מ 8 μL) המכיל 2.5 × 10 5 תאים שכותרתו לכל המצרפי (עד 16 אגרגטים ניתן להפקיד). השאירו את צלחת פטרי במשך 20-30 דקות מבלי להזיז אותו, שמאפשר לו ליצור spheroids, ולאחר מכן למקם את המכשיר שלם, כולל צלחת פטרי המכילה את 16 אגרגטים, לתוך החממה ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגרגטים מלאה הטופס הבא באותו פרוטוקול ולהחליף המדיום להשלים עם בינוניות chondrogenic ללא TGF-β3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את המבנה המצרפי 3D, למקם 2 אגרגטים במגע ביום 8 כדי ליצור 8 כפילויות וליזום ההיתוך. ביום 11, למזג 2 כפילויות כדי ליצור 4 רביעיות. לבסוף, פתיל 4 רביעיים ביום 15 כדי להשיג את המבנה הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, ליצור אגרגטים על ידי צנטריפוגה 2.5 × 10 5 שכותרתו בתאי גזע ב 26015; g עבור 5 דקות צינורות 15 מ&quot;ל עם 1.5 מ&quot;ל של מדיום chondrogenic עם או בלי TGF-β3 (עבור מדגם ובקרה, בהתאמה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי מגנטי פיגומי זרע, למקם כל פיגום יבש לתוך צלחת פטרי. השתמש פיגומים פוליסכריד נקבוביים עשויים pullulan / dextran 21. במשך כל פיגום, לדלל 2 × 10 6 בתאי גזע שכותרתו 350 μL של המדיום chondrogenic ללא-β3 TGF ובזהירות פיפטה תאים על הפיגום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חדירה לתא מלא בתוך הפיגום ואז בעדינות להוסיף 3 מ&quot;ל של מדיום chondrogenic עם או בלי-β3 TGF (עבור מדגם או מלאה, בהתאמה) על צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת גרדום cellularized במכשיר המגנטי שלה ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 4 ימים כדי לאפשר נדידת תאי הדרך הנקבובית פיגום הריתוק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, זרע פיגומים עם 2 × 10 6 </sעד&gt; תאי גזע שכותרתו באים באותה שיטת דגירה ללא המגנט להשיג פיגומי זרע אחיד שולטים חיובי. </li></ol> בידול 4. אל chondrocytes הערה: לאחר 4 ימים של דגירה, להסיר את המגנטים ולהמשיך הבשלת chondrogenic או בצלחת פטרי (תנאים סטטי) או בתוך bioreactor (תנאים דינמיים). דגימות בקרה שליליות התבגרו בתנאים סטטיים עם מדיום chondrogenic ללא-β3 TGF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים סטטיים, לשמור על פיגומים או אגרגטים cellularized באותה צלחת פטרי. שינוי המדיום chondrogenic פעמים בשבוע במשך 21 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים דינאמיים, להכין את bioreactor. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך צינורות סיליקון ב באורך המתאים על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי כל החומרים: תא תרבות 500 מיליליטר, צינורות, מסובבי 2-דרך, ואת כלובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חלקי bioreactor לתוך microbio סטרילי<html> תחנת בטיחות הגיונית. חבר את הצינורות אל מסובבי 2-way לתא ההתרבות בעקבות הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את הפיגומים cellularized לתוך כלובים מעוקר באמצעות מרית סטרילי. מניחים 2 פיגומים בכל כלוב. כאשר הכלובים מוכנים, להכניס אותם לתוך המחטים של המכסה כדי לשמור אותם לנוע במהלך סיבוב נוסף. ממלא את חדר התרבות עם מדיום chondrogenic ולסגור אותו עם המכסה המכיל את הכלובים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת peristaltic למלא את הצינורות עם מדיום chondrogenic וכדי לחסל בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח ולאבטח את הלילה המלאים לתוך המנוע של bioreactor ולהדליק את המחשב, אשר שולט סיבובים הן של הזרוע ובית הנבחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מהירות סיבוב של 5 סיבובים לדקה (סל&quot;ד) משתי הזרוע ובית הנבחרים. כוון את המשאבה peristaltic בקצב זרימה של 10 סל&quot;ד עבור האכלה רציפה של הפיגומים cellularized. </li></ol>התחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. הפקת רנ&quot;א ניתוח ביטוי גנים הערה: לפני מיצוי RNA, לעכל את הפיגומים עם פתרון אנזימטי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל של פתרון אנזימטי על ידי הוספת 100 μL של pullulanase (40 U / mL) ו 50 μL של dextranase (60 מ&quot;ג / מ&quot;ל) כדי 850 מ&quot;ל של מדיום סרום ללא DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הפיגומים פעמיים עם מדיום סרום ללא DMEM, להשליך את המדיום, ולהוסיף 800 μL של פתרון אנזימטי לכל הגרדום. דגירה של 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הפיגום נמס לגמרי, להעביר את פתרון המכיל את התאים לצינור 1.5 מ&quot;ל, צנטריפוגות ב g 300 × עבור 10 דקות, בזהירות לשאוב את המדיום, לשטוף פעמיים עם סטרילי 1 × פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), צנטריפוגות ב 300 × g עבור 10 דקות, מחדש להשעות את התאים בתמיסת בידוד RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחלץ את RNA מן אגרגטים, למקם הספרואידים בפתרון בידוד RNA ולחלוטין למחוץ אותם באמצעות homogenizer לפני ביצוע חילוץ RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את RNA באמצעות ערכה להפקת RNA הכוללת על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז DNA משלים מ 400 ננוגרם של רנ&quot;א הכל באמצעות transcriptase הפוכה על פי הוראות היצרן, באמצעות 250-ng פריימרים אקראיים, 1 μL של תמהיל dNTP (10 מ&quot;מ כל אחד), ו 40 U / mL RNase מעכב; היקף התגובה הסופי הוא 20 μL. בסוף התגובה, להוסיף 80 μL של מים מזוקקים להשיג נפח סופי של 100 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים (PCR), להשתמש בשילוב PCR המכיל ריאגנט פלורסנט לכמת את הביטוי היחסי של הגנים של עניין, כגון aggrecan (AGC) וקולגן השנייה (Col II), עם 10 × cDNA מדולל. לנרמל את רמות של ביטוי גנים עם חלבון ריבוזומלי גן התייחסות, גדול, P0 (RPLP0). בצע את החישובים עם 2 - נוסחא ΔΔCT, שבו ΔΔCT = ΔCT של מצב מובחן - אומר ΔCT של מצב מלא, וכל ΔCT מייצג את CT של הגן של עניין - CT של גן ההתייחסות (RPLP0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע מדידות סטטיסטיות כמו ערכים ממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). לבצע את הניתוח עם ניסויים עצמאיים 2 n ≥. השתמש מבחן t לנתח את ההבדלים הסטטיסטיים בין כדורי centrifuged ו בשילובים מגנטיים (* p &lt;0.05). לקבוע את המשמעות עם מבחן Kruskal-Wallis (פרמטרית חד סטרית ANOVA) לנתח הבדלים סטטיסטיים בין פיגומים מבודלים עם הפיגום המלא (* p &lt;0.05). </li></ol> 6. ניתוח היסטולוגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הפיגומים או אגרגטים cellularized עם 1 סטרילי × PBS, ולתקן אותן בתמיסת פורמלין 10% עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר, ולשטוף עם 1 × PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS, להטביע את הדגימות עוקצות אופטימליהטמפרטורה מתחם G (אוקטובר), ולהקפיא אותם באמבט איזופנטאן שקוע חנקן נוזלי. חנות המדגם ב -20 מעלות צלזיוס. חותך את הדגימות עם cryostat להשיג cryosections 8-מיקרומטר ליחידות או 12 מיקרומטר עבור פיגומי cellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם cryosections עם פתרון toluidine כחול 0.5% עבור 2 דקות, לשטוף במי ברז, מייבשים עם 100% אתנול, להבהיר באמצעות טולואן, ולעגן את השקופיות עם הרכבה בינונית עבור מיקרוסקופ אור. </li></ol>

<ol>
	<li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+imaging+in+regenerative+medicine.">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).</li><li>Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+based+stem+cell+tracking+in+regenerative+medicine.">Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine.</a> Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).</li><li>Di Corato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+cellular+MRI:+gadolinium+and+iron+oxide+nanoparticles+for+in-depth+dual-cell+imaging+of+engineered+tissue+constructs.">High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs.</a> ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+magnetic+assembly+of+microscale+hydrogels.">Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels.</a> Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).</li><li>Kito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+reparative+angiogenesis.">iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis.</a> Sci Rep. 3, 1418 (2013).</li><li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+in+vascular+tissue+engineering:+from+nanoscaffolding+towards+rapid+vessel+biofabrication.">Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication.</a> Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).</li><li>Mattix, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus+magnetic+cellular+spheroids+for+vascular+tissue+engineering.">Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering.</a> Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).</li><li>Henstock, J., El Haj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+mechanotransduction+in+therapeutic+MSCs:+can+remotely+controlled+magnetic+nanoparticles+regenerate+bones?.">Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?.</a> Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).</li><li>Fayol, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+magnetic+forces+to+promote+stem+cell+aggregation+during+differentiation,+and+cartilage+tissue+modeling.">Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling.</a> Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).</li><li>Bartlett, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation+versus+matrix-induced+autologous+chondrocyte+implantation+for+osteochondral+defects+of+the+knee:+a+prospective,+randomised+study.">Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study.</a> J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).</li><li>Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+chondrocyte+implantation:+an+overview+of+technique+and+outcomes.">Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes.</a> ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).</li><li>Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-based+cartilage+tissue+engineering:+cells,+scaffold+and+biology.">Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology.</a> Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).</li><li>Boeuf, S., Richter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenesis+of+mesenchymal+stem+cells:+role+of+tissue+source+and+inducing+factors.">Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors.</a> Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).</li><li>Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+functional+articular+cartilage:+the+current+status.">Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status.</a> Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).</li><li>Schon, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+high-throughput+microtissue+fabrication+process+for+3D+assembly+of+tissue+engineered+cartilage+constructs.">Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs.</a> Cell Tissue Res. , (2012).</li><li>Robert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+micro-manipulations+to+probe+the+local+physical+properties+of+porous+scaffolds+and+to+confine+stem+cells.">Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).</li><li>Luciani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+chondrogenesis+within+scaffolds,+using+magnetic+stem+cell+confinement+and+bioreactor+maturation.">Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation.</a> Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).</li><li>Wilhelm, C., Gazeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+cell+labelling+with+anionic+magnetic+nanoparticles.">Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles.</a> Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).</li><li>Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+magnetic+nanoparticle+aggregation+and+cellular+uptake:+a+precondition+for+efficient+stem-cell+differentiation+and+MRI+tracking.">Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking.</a> Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).</li><li>Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetophoresis+and+ferromagnetic+resonance+of+magnetically+labeled+cells.">Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells.</a> Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).</li><li>Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+polysaccharide-based+scaffolds+using+a+combined+freeze-drying/cross-linking+process.">Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process.</a> Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).</li><li>Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+toxicity+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+(SPION).">Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION).</a> Nano Reviews. 1, (2010).</li><li>Lee, J. H., Hur, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+formation+of+a+millimeter-scale+multicellular+spheroid+with+an+internal+cavity+from+magnetically+levitated+3T3+cells+that+ingested+iron+oxide-containing+microspheres.">Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).</li><li>Mattix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+magnetic+cellular+spheroids+as+building+blocks+for+tissue+engineering.">Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).</li><li>Mazuel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+Intracellular+Biodegradation+of+Iron+Oxide+Nanoparticles+Evidenced+Magnetically+at+Single-Endosome+and+Tissue+Levels.">Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels.</a> ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).</li><li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+generation+of+spheroids+using+magnetic+nanoparticles+for+three-dimensional+cell+culture.">High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture.</a> Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).</li><li>Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+cell-seeding+into+3D+porous+scaffolds+by+use+of+magnetite+nanoparticles.">Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).</li><li>Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticle-based+approaches+to+locally+target+therapy+and+enhance+tissue+regeneration+in+vivo.">Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo.</a> Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).</li><li>Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-axial+mechanical+stimulation+of+tissue+engineered+cartilage:+review.">Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review.</a> Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).</li><li>Takahashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressive+force+promotes+sox9,+type+II+collagen+and+aggrecan+and+inhibits+IL-1beta+expression+resulting+in+chondrogenesis+in+mouse+embryonic+limb+bud+mesenchymal+cells.">Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells.</a> J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).</li><li>Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compressive+strain+influences+chondrogenic+gene+expression+in+human+mesenchymal+stem+cells.">Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells.</a> Biorheology. 43, 455-470 (2006).</li><li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage.">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li></ol>

החוקרים אין לחשוף.

ראשית, בגלל הטכניקות שהוצגו כאן מסתמכים על ההפנמה של חלקיקים מגנטיים, נושא חשוב אחד הוא תוצאה של חלקיקים ברגע שהם למקם בתוך התאים. נכון חלקיקי ברזל עלולים לגרום לרעילויות פוטנציאל או יכולת בידול לקויה תלוי בגודל, הציפוי שלהם, וזמן חשיפה 19, <sup class="xref"...

חלקיקים מגנטיים משמשים כבר במרפאת בתור סוכנים בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית (MRI), והיישומים הטיפוליים שלהם ולשמור על רחבה. לדוגמא, הוכח לאחרונה כי תאי שכותרתו ניתן להשפיע in vivo באמצעות שדה מגנטי חיצוני ויכולים להיות מופנים ו / או נשמרו אתר מוגדר של השתלה 1, 2, 3. ברפואת רגנרטיבית, הם יכולים לשמש כדי להנדס רקמות מאורגנות במבחנה 4, כוללים כלי דם ברקמה 5, 6, 7, 8 עצם, ואת סחוס 9. סחוס במפרק שקוע בסביבת avascular, עושה תיקונים של רכיבי מטריקס מוגבלים מאוד כאשר הנזקים להתרחש. מסיבה זו, research מתמקדת כרגע על ההנדסה של החלפות סחוס hyaline שניתן מושתלות באתר הפגם. על מנת לייצר תחליף עצמי, כמה קבוצות מחקר בוחנות את השימוש של כונדרוציטים אוטולוגי כמקור תא 10, 11, בעוד שאחרים מדגישים את היכולת של תאי גזע מזנכימיים (MSC) להתמיין chondrocytes 12, 13. במחקרים קודמים סכמו כאן, בחרנו MSC, כמו דגימת מח העצם שלהם היא פשוטה למדי ואינו דורשת את ההקרבה של כונדרוציטים בריאים, אשר עלולים לאבד פנוטיפ שלהם 14. מוקדם צעד חיוני כדי ליזום את בידול chondrogenic של תאי גזע הוא ההתעבות שלהם. אגרגטים תא נוצרים בדרך כלל באף אחת צנטריפוגה או micromass תרבות 15; עם זאת, שיטות התעבות האלה neither להציג את הפוטנציאל ליצור צבירי תאים בתוך פיגומים עבים ולא את הפוטנציאל לשלוט ההיתוך של אגרגטים. במאמר זה, אנו מתארים גישה חדשנית עיבוי בתאי גזע באמצעות תיוג MSC מגנטי משיכה מגנטית. טכניקה זו הוכחה כדי ליצור מבני 3D ללא פיגום באמצעות שילוב של אגרגטים אחד עם השני כדי להשיג רקמות סחוס בקנה מידת מילימטר 9. זריעת מגנטי של פיגומים עבים וגדולים גם אפשרה את האפשרות של הגדלת הגודל של הרקמות המהונדסות, עיצוב צורה יותר בקלות שימושית עבור השתלה, ולגוון את הפוטנציאל עבור יישומים קליניים תיקון סחוס. כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול עבור הזריעה המגנטית של MSC לתוך פיגומים נקבוביים מורכבים סוכרים טבעיים, pullulan, פולימרים, פיגומים השתמשו בעבר כדי להגביל תאי גזע 16, 17. בידול Chondrogenic היה finally המבוצעת bioreactor כדי להבטיח מזין רציף דיפוזיה גז לתוך ליבת המטריצה ​​של הפיגומים שנזרעו עם צפיפות גבוהה של תאים. מלבד מתן חומרים מזינים, גורמי גדילה chondrogenic, וגז אל התאים, bioreactor המוצעים גירוי מכני. בסך הכל, הטכנולוגיה המגנטית נהגה להגביל תאי גזע, בשילוב עם התבגרות דינמית bioreactor, יכולה לשפר בידול chondrogenic ניכרה.

<table><tbody><tr><td>Iron oxide (maghemite) nanoparticules (&amp;gamma;-Fe&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>PHENIX - University Paris 6</td><td>Made and given by C. M&amp;eacute;nager</td><td>Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge</td></tr><tr><td>Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds</td><td>LIOAD - University Nantes</td><td>Made and given by C. Le Visage</td><td>Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10&amp;nbsp;M NaOH). Porosity: 185-205&amp;nbsp;&amp;micro;m; Thickness: 7&amp;nbsp;mm; Surface area: 1.8&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>TisXell Regeneration System</td><td>QuinXell Technologies</td><td>QX900-002</td><td>Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cage for scaffolds: Histosette II M492&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>720-0909</td><td></td></tr><tr><td>Mesenchymal Stem Cell (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Three independant batches have been used</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit medium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium</td></tr><tr><td>DMEM with Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>No sodium pyruvate, no HEPES</td></tr><tr><td>RPMI medium 1640, no Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>No sodium pyruvate, no HEPES</td></tr><tr><td>PBS w/o CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; w/o MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (10,000&amp;nbsp;U/mL) / Streptomycin (10,000&amp;nbsp;&amp;micro;g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution 100 mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>TGF-beta 3 protein 10&amp;nbsp;&amp;micro;g</td><td>Interchim</td><td>30R-AT028</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Prepare the 1&amp;nbsp;M stock solution diluted in distilled water and store at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pullulanase from &lt;em&gt;Bacillus acidopullulyticus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>P2986</td><td></td></tr><tr><td>Dextranase from &lt;em&gt;Chaetomium erraticum&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>D0443</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA Extraction Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer - Hexamer&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>500 &amp;micro;g/mL: Use diluted 1/2 and put 1 &amp;micro;L per sample</td></tr><tr><td>Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>40 U/&amp;micro;L: put 1 &amp;micro;L per sample</td></tr><tr><td>PCR nucleotide dNTP mix (10&amp;nbsp;mM each)</td><td>Roche</td><td>10842321</td><td></td></tr><tr><td>SyBr Green PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>Step One Plus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4381792</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution 10% neutral buffered</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>OCT solution</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>VWR</td><td>1.15930.0025</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>VWR</td><td>1.08323.1000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium Pertex</td><td>Histolab</td><td>840</td><td></td></tr><tr><td>RPLP0 Primer for qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5&#039;-TGCATCAGTAC&lt;br/&gt; CCCATTCTATCAT-3&#039;;&lt;br/&gt; 5&#039;-AAGGTGTAATC&lt;br/&gt; CGTCTCCACAGA-3&#039;</td></tr><tr><td>Aggrecan Primer for qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5&#039;-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3&#039;; 3&#039;-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5&#039;</td></tr><tr><td>Collagen II Primer for qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5&#039;-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3&#039;; 3&#039;-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5&#039;</td></tr></tbody></table>

3d magnetic stem cell aggregation and bioreactor maturation for cartilage regeneration

הנדסת סחוס עדיין מהווה אתגר בשל קשיים ביצירת שתל במבחנה תפקודית דומה רקמות הילידים. גישה בחנה לאחרונה לפיתוח תחליפים אוטולוגי כרוך הבידול של תאי גזע לתוך כונדרוציטים. כדי ליזום chondrogenesis זה, מידה של דחיסה של תאי הגזע נדרש; ומכאן, הראינו את הכדאיות של תאי עיבוי מגנטי, הוא בתוך פיגומים עבים פיגום ללא שימוש במקורות שדה מגנטיים מיניאטורי כמו משיכת תא. גישה מגנטית זה גם שמשה להנחות היתוך צבירה לבנות פיגום ללא, מאורגן, תלת ממדי (3D) רקמות כמה מילימטרים בגודלם. בנוסף בעל גודל משופר, הרקמה הנוצרת על-ידי היתוך מגנטי מונחה הציגה גידול משמעותי בביטוי של קולגן השנייה, ומגמה דומה נצפתה עבור ביטוי aggrecan. כמו סחוס הילידים היה נתון הכוחות tכובע השפיע מבנה 3D שלה, התבגרות דינמית גם בוצעה. Bioreactor המספק גירויים מכאניים שמש לתרבות הפיגומים המגנטיים הזורעים לאורך תקופה של 21 יום. התבגרות Bioreactor השתפרה במידה רבה chondrogenesis לתוך פיגומי cellularized; מטריקס שהושג בתנאים אלה היה עשיר קולגן השני aggrecan. עבודה זו מתארת ​​את הפוטנציאל החדשני של התעבות המגנטית של תאי גזע שכותרתו והתבגרות דינמית בתוך bioreactor לבידול chondrogenic משופר, הוא פיגומי פוליסכריד הפיגום ללא ובתוך.

ראשית, אגרגטים יכול להיווצר בנפרד באמצעות מיקרו-מגנטים על ידי הפקדת 2.5 × 10 5 תאי גזע שכותרתו (איור 2 א). אגרגטים יחידים אלה (~ 0.8 מ&quot;מ גודל) לאחר מכן ניתן התמזגו לתוך בזכות מבנים גדולים כדי היתוך רציף, מושרה מגנטי. למשל, ביום 8 של התבגרות chond...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration at JoVE.com

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K Views.  UMR 7057 CNRS and University Paris Diderot.  Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים. 

Video: 3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Chondrogenic גלולה היווצרות דם טבורי הנגזרות Pluripotent תאים גזעיים

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Developmental Biology

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

השרשה של Ferumoxides תווית אדם בתאי גזע mesenchymal ב פגמים סחוס

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Biology

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Construction, Characterization, and Regenerative Application of Self-Assembled Human Mesenchymal Stem Cell Aggregates

Mesenchymal stem cells (MSCs), characterized by their self-renewal ability and multilineage differentiation potential, can be derived from various sources and are emerging as promising candidates for regenerative medicine, especially for regeneration of the tooth, bone, cartilage, and skin. The self-assembled approach of MSC aggregation, which notably constructs cell clusters mimicking the developing mesenchymal condensation, allows high-density stem cell delivery along with preserved cell-cell interactions and extracellular matrix (ECM) as the microenvironment niche. This method has been shown to enable efficient cell engraftment and survival, thus promoting the optimized application of exogenous MSCs in tissue engineering and safeguarding clinical organ regeneration. This paper provides a detailed protocol for the construction and characterization of self-assembled aggregates based on umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs), as well as an example of the cranial bone regenerative application. The implementation of this procedure will help guide the establishment of an efficient MSC transplantation strategy for tissue engineering and regenerative medicine.

This study describes a method to construct aggregates based on the self-assembly of human mesenchymal stem cells and identifies the morphological and histological characteristics for the regenerative treatment of cranial bone defects.

Mesenchymal stem cells (MSCs), characterized by their self-renewal ability and multilineage differentiation potential, can be derived from various sources ...

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited self-repairing capacity and, most importantly, no definitive treatments, tendinopathy still influences patients&#8217; life quality negatively. Tendon-derived stem cells (TDSCs), as primary precursor cells of tendon cells, play an essential role in both the development of tendinopathy, and functional and structural restoration after tendinopathy. Thus, a method that can in vitro mimic the in vivo differentiation of TDSCs into tendon cells would be useful. Here, the present protocol describes a method based on a three-dimensional (3D) uniaxial stretching system to stimulate the TDSCs to differentiate into tendon-like tissues. There are seven stages of the present protocol: isolation of mice TDSCs, culture and expansion of mice TDSCs, preparation of stimulation culture medium for cell sheet formation, cell sheet formation by culturing in stimulation medium, preparation of 3D tendon stem cell construct, assembly of the uniaxial-stretching mechanical stimulation complex, and evaluation of the mechanical stimulated in vitro tendon-like tissue. The effectiveness was demonstrated by histology. The entire procedure takes less than 3 weeks. To promote extracellular matrix deposition, 4.4 mg/mL ascorbic acid was used in the stimulation culture medium. A separated chamber with a linear motor provides accurate mechanical loading and is portable and easily adjusted, which is applied for the bioreactor. The loading regime in the present protocol was 6% strain, 0.25 Hz, 8 h, followed by 16 h rest for 6 days. This protocol could mimic cell differentiation in the tendon, which is helpful for the investigation of the pathological process of tendinopathy. Moreover, the tendon-like tissue is potentially used to promote tendon healing in tendon injury as an engineered autologous graft. To sum up, the present protocol is simple, economic, reproducible and valid.

A three-dimensional uniaxial mechanical stimulation bioreactor system is an ideal bioreactor for tenogenic-specific differentiation of tendon-derived stem cells and neo-tendon formation.

החלת גירוי מכני תלת מימדי ביוריאקטור מערכת לגרום לבידול Tenogenic של תאי גזע הנגזר גיד

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited ...

Medicine

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a step-by-step method for differentiating induced pluripotent stem cells (iPSCs) into chondrocyte-based spheroids, supporting tissue engineering and cell therapy applications. The differentiation process is carefully structured to promote chondrogenic lineage commitment, beginning with iPSCs cultured in specific media that sequentially guide cells through critical stages of differentiation. Initially, iPSCs are expanded to reach optimal confluency before induction toward chondrogenic lineage using a series of defined media changes. By day 10, cells are transitioned to a chondrogenesis-promoting medium that enhances the formation of chondrocyte-like cells expressing key markers of mature chondrocytes. Further aggregation in 96-well agarose-coated plates leads to the formation of three-dimensional spheroids, which are then cultured in custom mini-bioreactors designed to simulate a microenvironment that encourages extracellular matrix (ECM) deposition. By enabling scalable production of chondrocyte spheroids that mimic native cartilage characteristics, this approach offers a promising, reproducible solution for developing cell-based treatments for cartilage defects, providing broad utility for clinical and research applications in musculoskeletal regenerative medicine.

This study describes a method for producing chondrocytic spheroids by aggregating cells into spheroids under low-adhesion conditions using gravity, followed by culturing the resulting spheroids in mini-bioreactors.

יצירת ספרואידים מכונדרוציטים שונים בתנאי הדבקה נמוכה תחת כוח הכבידה ומיני ביוריאקטורים תוצרת בית

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...