The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

NOT: uygun bir memeli ifade vektörü, bu protokol için kullanılmalıdır. Burada, iki ekspresyon kasetleri içeren tek bir yapı kullanılmıştır (örneğin ağır ve hafif zincir ekspresyon ayrı promoterler tarafından tahrik edilir). Trastuzumab, ağır ve hafif zincirler, daha önce vektörüne klonlanmıştır. Bu vektör bir değil, kar amacı gütmeyen plazmid depo 13 ile elde edilen Andrew Beavil bir hediye oldu. 1. geri kazanımı ve vektör DNA ölçek büyütme Not: Vektör DNA, Escherichia coli XL-1 Mavi suşu bir yumuşak agar levha kültür olarak alınmıştır; Vektör higromisin direnç taşımaktadır. <ol><li> Daha sonra çizgi bir Luria Bertani (LB) agar plaka 75 mikrogram ile hazırlanan bıçak kültürünün yumuşak agar içine steril bir aşılama bıçak ya da döngü takın / izole koloniler için ml higromisin. 18-24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> 75 ug / ml higromisin içeren 5 ml Terrific suyu (TB) içine tek bir koloni inoküle. incu225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C &#39;de kesmek kültürü. </li><li> yavaşça -80 ° C de meydana gelmekteydi ve dondurularak 200 ul% 80 gliserol ile kültür, 800 ul karıştırılarak vektör DNA, bir gliserol stokundan hazırlamak için bir gece boyunca kültür kullanın. <ol><li> Ihtiva eden 100 mi TB gecelik kültüründen 100 ul ekle 75 ug / bölmeli bir çalkalama şişesinde (örneğin 1/1000 seyrelti) içinde higromisin ml. 225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C &#39;de kültür inkübe edin. </li></ol></li><li> bir gece kültürden sonra, ayıklamak ve şu istisna ile MIDI / maksi hazırlama kiti üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırılması; su (pH 7,0-8,5) ile son adım, elute veya tekrar süspansiyon DNA sırasında. </li><li> daha sonra -20 ° C de, DNA depolamak 260 ve 280 nm &#39;de konsantrasyon ve absorbans okumaları ile DNA saflığı kontrol edin. NOT: İsteğe bağlı (tavsiye): Sıra DNA kimliğini doğrulamak için vektör-spesifik primerler kullanılarak. </li></ol> 2. HEK-293 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu <ol><li> Büyüme ve Erlenmeyer şişelerinde% 0.1 noniyonik yüzey aktif madde ile takviye edilmiş serumsuz ortamda, standart protokollere göre, HEK-293 hücreleri (süspansiyon hücreleri) korur. 2 x 10 5 hücre / ml ve alt kültür her dördüncü gün koruyun. % 5 CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C &#39;de kültür hücreleri. Not: Hücreler, en az 4 gün boyunca kültür edilmiş ve transfeksiyondan en fazla 4 hafta önce olmalıdır. Serum içeren ortam içinde mono-tabaka olarak yetiştirilen HEK-293 hücreleri bu işlem için kullanılabilir. </li><li> Günde, transfeksiyondan önce, tohum, HEK-293 hücreleri, bir 12-yuvalı plakanın yuvaları içinde 3 x 10 5 hücre / ml&#39;de 2% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Ortamı (DMEM) içinde mi ( FBS). Transfeksiyon gününde, hücreler% 80-90 konfluent ulaşmış kontrol </li><li> Daha sonra karıştırın transfeksiyon medyada ayrı ayrı DNA ve polietilenimin (PEI) seyreltin.<ol><li> 300 ul transfeksiyon medyada kuyu başına 1.25 mikrogram vektör DNA (12 kuyuları için 15 mikrogram) seyreltin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> (12 kuyu 30 ul, yani 1: PEI DNA 2 oran) 1 mg / ml PEI solüsyonu 2.5 ul seyreltilir 300 ul transfeksiyon ortamı içinde. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> hafifçe karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe, seyreltilmiş PEI seyreltilmiş DNA ekleyin. </li></ol></li><li> plakanın her oyuğuna DNA / PEI karışımı damla damla 50 ul ekle. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 transfeksiyon karışımı daha sonra plaka yer dağıtılması için hafifçe plaka sallayın. </li><li> Oyuk başına B higromisin ve 10 gün boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile plaka dönüş ml / 50 ug ekleyin. Not: kararlı bir şekilde transfekte edilmiş hücrelerde, uygulanabilir ve plakaya eklenir ise 10. günde, un transfekte edilmiş hücreler, plaka yüzeyindeki öldü ve müstakil olacaktır. </li><li> ile kuyularda medya değiştirin1/4 hacim serumsuz ortam ve 3/4 hacim DMEM% 10 FBS (örneğin, 0.5 mi serumsuz ortam + 1.5 ml DMEM =% 7.5 nihai serum konsantrasyonu) ve 4 gün boyunca inkübe ile takviye edilmiştir. </li><li> % 10 FBS (+ 1 mi DMEM =% 5 son serum konsantrasyonu, yani 1 mi serumsuz ortam) ile desteklenmiş 1/2 hacim serumsuz ortam ve 1/2 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. </li><li> % 10 FBS (örneğin, 1.5 mi serumsuz ortam + 0.5 mi DMEM =% 2.5 nihai serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş 3/4 hacim serumsuz ortam ve 1/4 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. </li><li> % 0.1 noniyonik yüzey aktif madde (örneğin,% 0 son serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş serumsuz ortam 2 ml kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. Not: serumsuz uyarlanması sırasında hücreler üzerinde 50 ug / ml higromisin B seçici bir basınç muhafaza edin. serum ücretsiz medya adapte Hücreler kuyuların yüzeyinden ayırmak ve i küme olabilirn süspansiyon. 50 ug ek takviyesi ile kültür koşulları için 2.1 adıma bakın / B. ml higromisin </li><li> Bir pipet kullanarak, hafifçe ayrı tüp içine 12 oyuklu plaka ve havuz hücre süspansiyon kültürleri karıştırın. <ol><li> Bir hemasitometre kullanarak, 2 x 10 5 hücre / ml bir Erlenmeyer şişesi içinde 30 ml serumsuz ortam içinde toplanmış hücreleri ve tohum numaralandırmak. % 5 CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C &#39;de kültür hücreleri. Altkültür ve her dördüncü gün genişletin. </li></ol></li><li> / 1 x 10 7 hücre 10 şişe elde etmek için gerekli hücre yoğunluğu kültür boyutunu genişletmek sıvı azot içinde dondurulması için şişeyi devam edin. % 10 dimetilsülfoksit (DMSO) ihtiva eden serumsuz ortam hücreleri dondurun. Not: antikor içeren koşullu ortam, protein üretimini teyit etmek için her bir alt kültür hasat veya saflaştırma koşulları optimize etmek için kullanılabilir. klimalı ortam hasat ve alt kültür hücreleri korumak, en kültürünü santrifüj5 dakika boyunca 300 x g daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden süpernatan filtre-sterilize edin. Filtre yüzer 1-2 hafta veya daha uzun süreli depolama için -20 ° C, 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Toplu kaplamak Kültür 3. Büyük Ölçekli Antikor Üretimi NOT: Antikor üretimi mevcut hücreler kurulum toplu kaplamak kültür hacmine dayalı gerekli hücre yoğunluğuna genişletilir adım 2.11 dan takip edilebilir. Aksi takdirde, soğukta korunan çözülmüş olan hücreler bir kez uygun bir hücre yoğunluğuna ve hacmine genişletilmiş bu aşamada başlar. Çeşitli kültür takviyeleri antikor üretimini optimize etmek için kullanılabilir; tripton kullanımı antikor verimi Bu protokolde gösterilmiştir artırmak için. <ol><li> Tohum hücreler iki Erlenmeyer şişelerinde 100 mi serumsuz ortam içinde 2 x 10 5 hücre / ml&#39;de (takviye un ve besin takviye kültürlerden antikor verimlerini karşılaştırmak üzere). 37 ° C&#39;de Kültür ° C,% 5 CO2 </sub&gt; ve 120 rpm. </li><li> 24 saat sonra, besin takviye kültüre% 0.5 bir son konsantrasyona tripton ekleyin. serum serbest medya ile un takviye kültür hacmini eşitlemek. </li><li> Gün 8, hücre canlılığı izlemek için bir hemositometre kullanılarak, günlük kültürlerin hücre sayımı gerçekleştirin. hücre canlılığı, 80% &#39;den daha az bir kez kültür süpernatanlarının hasat. <ol><li> 3,000 xg 15 dakika için kültürlerin santrifüj ile hasat yüzer madde daha sonra 0.22 um&#39;lik bir filtreden süpernatan içeren (antikoru) filtre-sterilize edin. 4 ° C (kısa süreli) olarak süpernatantlar saklayın veya -20 ° C (uzun vadeli) donma. </li></ol></li></ol> Bağlantı Kromatografisi ile saflaştırma 4. Antikor otomatik bir hızlı protein sıvı kromatografi kullanarak (FPLC) Sistem Not: Aşağıdaki prosedür, genel olarak, çoğu otomatik sistemlere uygulanabilir. Saflaştırma, oda sıcaklığında gerçekleştirilir ya da 4 ° C &#39;de (FPLC sistemi serin bir odada muhafaza edilir ise) olabilir.keşif bir dizi test (Sonuçlar bölümüne bakınız) koşullandırılmış ortamdan saflaştırıldı antikorun en iyileşme sağlamak için tampon elüsyon tampon ve pH, bağlayıcı uygun sütun matrisi içeren uygun saflaştırma koşulları belirlemek için gerçekleştirilebilir. Optimal koşullar, antikor veya protein arındırılmadan bağlıdır. Saflaştırma otomatik bir FPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma 5 ml&#39;lik bir Protein A kolonu kullanılarak oda sıcaklığında yapıldı. <ol><li> ultra saf su kullanılarak, aşağıdaki tamponlar hazırlamak ve daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden filtre tavsiye edilen pH ayarlamak. <ol><li> 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCI, 0.01 M Na-2 HPO 4 0.001 M KH 2 PO 4: aşağıdakileri karıştırarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.4 (bağlanma tamponu) 1 L hazırlayın. tampon filtreleme önce gerekirse pH ayarlayın. </li><li> 0.1 M glisin-HCI pH 2.7 (elüsyon tamponu), 500 ml hazırlayın. buff filtreleme önce pH ayarlayıner. </li><li> 1 M Tris pH 9.0 (nötralizasyon tamponu) 50 ml hazırlayın. </li></ol></li><li> yapılan bilgisayar ile tüm sistem güç ve iletişim bağlantılarını sağlamak. Cihazlar yazılımı &#39;Sistem Denetimi&#39; modülünde görünür olmalıdır. Emin UV cep 280 nm dalga boyunda ayarlanır. İsteğe bağlı: Bağlı ve kullanılacak eğer pH metre kalibre. </li><li> sistemin yıkanması, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri bırakın. boru içindeki hava veya sistemde bir hava şüphe varsa bir şırınga ile pompaları temizleyin. sistem kontrolörü üzerinden veya otomatik yöntemiyle manuel kullanıma su ile sistemi yıkayın. Bu basınç, iletkenlik, UV280 izleme ve pH tutarlı kalır ve sütun için basınç limiti üreticinin şartnamesine göre aşmamak gözlemleyin. NOT: anormallikleri devam etmeden önce ele alınması gereken sistemde hava veya tıkanıklığa işaret eder. </li><li> sistem kontrol modülü, 1 de debi başlatmakml / dk manuel ya yük pompa A yoluyla (örnek döngü atlayarak) veya sütun bağlayan başlamak için pozisyon (örnek döngü yoluyla) enjekte edilir. Kes sistem sütun konumunu girişinde boru ve sütun girişine bağlı tıpa kaldırın. <ol><li> Su daha sonra kolona sistemi boru eklemek sütununun tepesine sistem boru damla damla akmasına izin verir. Sütun girişi olan ve giriş uydurma su damlaları ile taşan hava kabarcıkları serbest bir bağlantı sağlar. </li></ol></li><li> mansap çıkışında sütun çıkışını takın ve tüm parçaları sıkıca tutturulmuş emin olun. Sütun artık sisteme bağlı sütun şartnamesinde belirtildiği gibi, maksimum basınç sınırı ve debi sınırlarını aşmamaktadır. </li><li> su, 5 kolon hacminde (CV) ile kolon yıkanır. Gerekirse UV280 izleme stabilize kadar, kolon yıkama devam ediyor. </li><li> tampon Bağlama A&#39;nın giriş tüpleri daldırın, Tasfiye B tampon ve Ciltleme tampon t örnek pompasıo doğru tamponlarda sistemi dengeye. manüel işlemle PumpWash kullanarak tamponu ile giriş tüpleri doldurmak. </li><li> Yazılımın &#39;yöntemi Editörün&#39; modülünde, kurulum için bir yöntem sihirbaz kullanılmak üzere tasarlanmıştır sütun için bir afinite kromatografisi yöntemi kullanın. NOT: Otomatik FPLC sistemler yöntemleri önerilen ayarlar (yani debi ve basınç sınırı) ile önceden doldurulmuş ve saflaştırılması için seçilen sütunun (üretici, matris ve boyut) dayalı adım koşmak ile birlikte gelir. <ol><li> Protein A afinite kromatografisi için aşağıdaki çalışma adımları kullanın: <ol><li> Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak. </li><li> Sütun üzerine yük numune ve ayrı bir kabın içine flowthrough toplamak (hacim yöntemi elle belirtilen yüklenecek). </li><li> Bağlama tampon çözeltiden 5 CV ile yıkama sistemi, ayrı bir kap içine flowthrough toplar. </li><li> 5 CV isocrat ile elüt sütunuElüsyon tamponu ve fraksiyon toplayıcı tarafından fraksiyonları gibi saflaştırılmış antikor numune toplamak kullanarak IC fraksiyonasyon. </li><li> Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak. </li></ol></li></ol></li><li> yöntem kurulumu edildikten sonra, koşullu ortamın hacmi kolonuna uygulanacak belirtmek ve yöntem kaydedin. Not: Yöntem belirtilen birim örnek akımı boyunca hava giriş önlemek için, gerçek hacmi 5-10 mi az olmalıdır. Bu protokolde kullanılan belirtilen hacim 90-120 ml. </li><li> klimalı ortamı içeren kabına numune pompa hortumunu Batmak. </li><li> Belirtilen çıkış boru ile örnek flowthrough toplanması için ayrı bir kap hazırlanır. NOT: sütun veya arıtma r uygulanamayacağı için flowthrough gerektiren aşıldığında bir hata çalıştırmak veya sütun bağlama kapasitesi sırasında oluşması durumunda flowthrough toplamak için önemlidirepeated. </li><li> fraksiyon toplayıcı toplama tüpleri hazırlayın. 1 mi fraksiyon hacim başına nötralizasyon tampon 100 ul ekle. FPLC sistem otomatik toplama tüpleri içine kesirler Zehir. </li><li> Yazılımın &#39;Sistem Kontrolü&#39; modülünde, yöntem açmak çalıştırılacak. NOT: yöntem çalışma yöntemi, fraksiyon toplayıcı kurulum değişkenleri kontrol ve sonuç dosya adını ve depolama konumunu tanımlayan dahil sayfaların bir dizi başlatılır. </li><li> Çalışmayı başlatmak için BAŞLAT tıklayın. run &#39;Sistem Denetimi&#39; modülünde izlenebilir. </li><li> arıtma çalışmasının bitiminde, sistem yazılımı &#39;Değerlendirme&#39; modülünde sonuçlanan kromatogramı kontrol edin. </li><li> Ayrı bir tüp, tampon değişimi içine tüm protein ihtiva eden fraksiyonlar birleştirilir ve kesik 30 kDa molekül ağırlığına sahip bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak PBS içinde konsantre edilir. üreticinin göre santrifüj adımları uygulayıntalimatlar. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bisinkoninik asit analizi (BCA) kullanılarak antikor konsantrasyonu ölçümü. </li><li> Başka bir arıtma çalıştırmak yapılacak ise, Bağlama tampon ve tekrar başbakan örnek pompa hortumu 4.9-4.14 adımları. </li><li> saflaştırma çalışır tamamlanmasından sonra, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri daldırın ve adım 3&#39;te yapılan gibi bir sistem ve sütun yıkayın. </li><li> sistem ve kolonun depolanması için% 20 etanol ve tekrar yıkama prosedüründe A, B ve örnek pompa hortumunu Batmak. </li><li> aşağı prizden sütun ayırın ve sütun stoper yerine, daha sonra girişinde sütun ayırın ve stoper yerine, sisteme boru bağlayın. 4 ° C&#39;de sütun saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments.">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li><li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates:+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety.">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li><li>Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies.">Bispecific antibodies.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).</li><li>Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+therapeutic+antibodies.">Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Food and Drug Administration. 22, (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Medicines Agency. 13, (2014).</li><li>Lopez-Morales, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+biological+characterization+of+a+biosimilar+trastuzumab.">Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab.</a> Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).</li><li>Jung, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+Remsima.">Physicochemical characterization of Remsima.</a> MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+functional+comparability+between+the+proposed+biosimilar+rituximab+GP2013+and+originator+rituximab.">Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab.</a> BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+different+vector+designs+for+the+mammalian+expression+of+recombinant+IgG+antibodies.">A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).</li><li>Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+IRES+elements+in+mRNAs+to+the+eukaryotic+translation+apparatus.">Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus.</a> Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).</li><li>Ho, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+Tricistronic+vectors+for+enhancing+generation+of+high+monoclonal+antibody+expressing+CHO+cell+lines.">IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.</a> J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).</li><li>Dodev, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies.">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885 (2014).</li><li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals.">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g/l+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions.">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).</li><li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker.">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li><li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells.">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells:+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency.">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li><li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers.">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid:+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures.">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li><li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility.">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol, HEK-293 hücrelerinde transfeksiyon, stabil ekspresyon ve bir terapötik antikorun saflaştırılması göstermektedir. antikor genlerinin kararlı tanımının, bir terapötik antikorun geliştirilmesi ve üretimi için bir antikor üreten hücre hattı oluşturmak için ilk adımdır. Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri, terapötik proteinler için tercih edilen sentezleme platformu kalırken, HEK-293 hücre hattı mesaj açısından bu hücrelerde üretilen proteinler, doğal insan proteini olarak...

terapötik antikorların başarılı nesil terapötik bir dalga başlar Antikor gelişme içine önemli miktarda yatırım sürmeye devam eder. Antikor pazar uygun özelliklere 4 antikor fragmanları 1, antikor-ilaç konjugatlarının 2 bispesifik antikorlar 3 ve işlenmiş antikorlar suretiyle yeniden beklenmektedir. İlaç ilgi kazanıyor başka sınıf biyobenzerler vardır. Biyobenzer antikorlar zaten düzenleyici onayı almış bir terapötik antikorun ürünlerini çoğaltmak &#39;son derece benzer&#39;. Önerilen bir Biyobenzer yapısı, fonksiyon, hayvan toksisite, klinik güvenlik ve etkinliği, insan farmakokinetik (PK), farmakodinamik (PD) ve immünojenite 5, 6 ile ilgili olarak yaratıcısı antikoru ile uyumlu olmalıdır. onay rBiyobenzer antikorların ates nedeniyle ürünün nihai kalitesi üzerinde sıkı kısıtlamalar yavaş olmuştur. Böyle son işlem adımlarına yoluyla hücre hatları ve kültürleme koşulları belirli tam olarak üretim süreçlerinin tescilli kalabilir. Dahası, antikor üretimi doğal oldukça benzer bir ürün üretme meydan ekleyebileceğiniz değişkenlik derecesi gerektirir. Kapsamlı bir fizikokimyasal ve biyofizik karakterizasyonu ve karşılaştırma oldukça zordur, ancak Biyobenzer antikorların özelliklerini gösteren bir dizi çalışma literatürde 7, 8, 9 ortaya çıkıyor. terapötik bir antikor üretme ilgili antikor için geni taşıyan bir vektör ile memeli konakçı hücrelerinin transfeksiyonu ile başlar. Vektör tasarımı, hücre dizisi ve kültür koşulları eski kurmak için anahtar faktörlerdirpression sistemi. antikorların DNA dizileri İlaç Bankası (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ya da patent dahil olmak üzere araştırma yayınlarından kaynaklı olabilir. Örneğin, trastuzumab sırası İlaç Bankası (: DB00072 DB ID) aracılığıyla kullanılabilir. değişken bölgelerinin amino asit dizisi istenen konakçı türlerinde sentezi için gen tasarımı ve optimizasyonu geçirebilmektedir. Bu hiçbir değişiklik amino asit sekansına yapılan bir biyobenzer antikor için önemlidir. sentezlenmiş sonra, antikor genleri seçim uygun bir vektör içine alt klonlanabilir. İnsan IgG antikorları iki özdeş ağır zincir ve iki özdeş hafif zincirlerin oluşur. Her iki zincir sıkı bir biçimde düzenlenmesi sentezleme memeli hücrelerinde 10 heterolog IgG proteini optimal üretimi için gereklidir. arası zincirli disülfid bağının oluşmaması gerekir ve post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi olması hem de İçiprotein biyosentezi sırasında troduced. vektörlerin bir dizi antikor genleri (Malzeme Tablo bakın) ifade etmek için özel olarak tasarlanmış olduğunu mevcuttur. Bu antikor özel vektörler, genellikle, her zincirin bu nedenle sadece değişken bölgeleri klonlama gerektirir ağır hem de hafif zincirlerin sabit bölgeleri ifade eder. iki bağımsız yapıların (ko-transfeksiyon) ile hücrelerin transfeksiyonu, ağır ve hafif zincir kodlayan genlerin verilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Başka bir deyişle, her bir genin endoplazmik retikulum içinde birleştirilmeden önce, kendi promoter tarafından tahrik edilen ve ayrı antikor zincirleri olarak transkripsiyonu. Diğer taraftan, çoklu-sistronik vektörler mRNA 11 iç bölgelerinden izin çeviri ile tek bir mRNA transkripti olarak birden fazla genin ifadesini izin dahil dahili ribozom giriş sahası (IRES) elemanları vardır. Bu durumda, ağır ve hafif zincir kodlayan genler arrang bağlanmış olanHer iki antikor zincirlerinin 10, 12 eş ifadesini elde etmek için ası,. geçici olarak transfekte hücreler, deney sınırlı sayıda gerçekleştirmek için yeterli protein elde birlikte, genom entegrasyonu için seçim geçiren stabil olarak transfekte edilmiş hücre hatları daha yüksek verim verebilir. Daha yüksek protein miktarlarının in vitro karakterizasyonu ile ilgili deney geliştirme sağlar ve klonal hücre hattı ve kurşun aday seçimi gibi alt uygulamalar dikkate antikor kalitesinin bir göstergesini sağlar. Bu maddenin amacı, bir memeli ekspresyon sisteminde üretilmiş bir terapötik antikorun kararlı ifadesi ve saflaştırılması tarif etmektir. Gerçekten de, bu yöntem, biyobenzer antikorun ifadesine uygulanabilir. yöntem, zaman alıcı ste olsa önemli için devam etmeden önce, antikorların başlangıç ​​karakterizasyonu için kullanılabilirdaha büyük ölçekli üretimi için bir arzu klon belirleme ps. Dahası, bu yöntem diğer proteinleri ve sadece antikorların ifade edilmesi için kullanılabilir. Aşağıdaki detaylı protokol terapötik antikor trastuzumab ifadesini açıklar. Bu, otomatik bir kromatografik yöntem ile, HEK-293 hücre hattı ve antikor proteininin saflaştırılmasına kararlı transfeksiyonu takiben vektör DNA&#39;nın hazırlanması oluşur.

<table><tbody><tr><td>pFUSE vector series</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td></tr><tr><td>mAbXpress vector series</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>pVITRO1 vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&amp;nbsp; Refer to: Dodev, T. S. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>GS vector series</td><td>Lonza</td><td></td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa; was a gift from Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol, BioXtra, &amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at -80 &amp;deg;C until use.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Transfection formulated serum-free media</td></tr><tr><td>Hygromycin B Solution</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone (casein peptone)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid, monohydrate</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>45-5000</td><td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td></tr><tr><td>Protein A biosensors</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi transfekte edilmiş HEK-293 hücreleri ile trastuzumab kararlı üretim biyo-tabakalı interferometrik (BLI) kullanılarak teyit edilmiştir. Bir IgG standart eğrisi IgG antikoru standart ve Protein A biyosensör (Şekil 1A) arasındaki bağlanma oranı ölçülerek elde edilmiştir. Ham yüzer kısım Örnek Benzer ölçülmüş, daha sonra da konsantrasyonu, standart bir eğrisi (Şekil 1B) arasın...

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody at JoVE.com

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.3K Görüntüleme.  University of Sydney.  Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir. 

Video: Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Tıp

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Saptamak için deneysel protokol<em&gt; Siyanobakteri</em&gt; Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Çevre

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Kanser Araştırmaları

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Biyomühendislik

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

İmmünoloji

Production and Purification of Recombinant Antibodies from Mammalian Cells

Source: Shivange, Gururaj, et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60727">Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen-Specific Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp.(2020).
The video explains the process of producing antibodies in mammalian host cells, from gene expression to secretion. It involves transcription, translation, signal recognition, correct folding, and eventual release into the extracellular medium via secretory vesicles.

Memeli Hücrelerinden Rekombinant Antikorların Üretimi ve Saflaştırılması

1. Expression and purification of antibodies

	Maintenance of CHO cells
	
		Grow CHO cells in FreeStyle CHO Media supplemented with commercially available ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Üretim ve Saflaştırma

A Technique to Purify Monoclonal Antibodies Produced by Chinese Hamster Ovary Cells

Source: Velugula-Yellela, S. R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58947">Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay for purifying monoclonal antibodies from cell culture fluid harvested from Chinese Hamster Ovarian cells. It employs a porous glass resin with immobilized protein A, which binds to the Fc region of the antibodies in the sample, effectively separating them from contaminants. The use of a low-pH elution buffer weakens the interaction, facilitating the retrieval of purified antibodies.

Çin Hamster Yumurtalık Hücreleri Tarafından Üretilen Monoklonal Antikorları Saflaştırmak İçin Bir Teknik

1. Purification of antibody
NOTE: The equilibration buffer for the in-house antibody is 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. The elution buffer used is 0.1 M ...

Antibody Production from a Batch Overgrowth Culture of Transfected Mammalian Cells

Source: Elgundi, Z. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
The video demonstrates a method for producing therapeutic antibodies using stably transfected mammalian cells. Tryptone supplementation stimulates cell division, resulting in overgrowth and supporting a higher antibody yield. The antibody-containing medium is harvested, filtered, and stored for further use.

Transfekte Edilmiş Memeli Hücrelerinin Toplu Aşırı Büyüme Kültüründen Antikor Üretimi

NOTE: A suitable mammalian expression vector must be used for this protocol. Here, a single construct containing two expression cassettes is used ...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

Monoklonal Antikorların Saflaştırılması için Bir Afinite Kromatografisi Tekniği

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...