Name: imaging the neutrophil phagosome and cytoplasm using a ratiometric ph indicator
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator at JoVE.com

Bu çalışma nazik Wellcome Trust, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi ve Irwin Joffe Memorial Kardeşliği tarafından finanse edildi.

Etik deyimi: Tüm hayvan çalışmaları lisansı ve İngiltere Home Office onayı ile yürütülmüştür. Bu araştırmada İnsan katılımı İnsan Araştırmaları Etik Ortak UCL / UCLH Komiteleri tarafından onaylandı. Tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onay vermiştir. C. albicans hazırlanması 1. <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre YPD bir agar plakası üzerinde bir Candida diski (Malzeme Listesi bakınız) büyütün. Bir koloni seçin ve YPD çorbasının, 15 mL ekleyin. Suyu bulutlu (genellikle yaklaşık 2 gün veya yaklaşık / ml 9 1 x 10 üzerinde bir konsantrasyona) kadar 30 ° C ve 200 rpm&#39;de bir çalkalama inkübatöründe inkübe. </li><li> Candida orta Spin ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 50 ml içinde tekrar süspansiyon. 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüjleyin. İki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Tüm boru s kadar 60 ° C&#39;ye ısıtılmış bir su banyosu içinde, PBS / Candida 50 ml ortamı içeren tüp yerleştirin1 saat boyunca ubmerged. <ol><li> Candida YPD bir agar plakası üzerine ısı ile öldürülmüş, çizgi bir örneğidir ve 30 ° C&#39;de bir gece inkübe doğrulamak için. 5-9 ısı ile öldürülmüş (HK), Candida konsantrasyonu ayarlama 8 x 10 / ml Candida büyümeye bağlı olarak, ve ° C dondurucu içinde -20 1 ml alikotlar içinde muhafaza edin. NOT: Bu protokol tüm hücre sayımları otomatik bir hücre sayacı kullanılarak yapılmıştır. </li></ol></li></ol> 2. S-1 Kavrama (HK) Candida öldürülmüş ısıtmak için <ol><li> Yüksek dereceli dimetil sülfoksit, 100 uL (DMSO) içinde seyreltilmesi ile karboksi-S-1 süksinimidil ester (50 ug) bir kısım hazırlayın. Girdap iyice karıştırmak için. </li><li> 15 ml bir tüp içinde 0.1 M sodyum bikarbonat (pH 8.3) içinde 1 x 10 8 HK Candida 1 mL hazırlayın. </li><li> 100 uL karboksi-S-1, kabaca bir girdap 2.000 rpm (yüksek hıza ortamı) karıştırma sırasında HK Candida her seferinde bir damla ekleyin. alüminyum foi sarınboru etrafında L ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında bir silindir üzerine yerleştirin. </li><li> Her biri 10 dakika için 2250 x g&#39;de santrifüjleme ile HK Candida- S-1 (HkC-S-1) ile üç kez yıkanır. İlk iki yıkama için, 0.1 M sodyum bikarbonat (pH 8.3), 15 mL pelletini. Üçüncü yıkamadan sonra, dengeli tuz solüsyonu (BSS) tampon maddenin 1 mL&#39;si içinde tekrar süspansiyon (Tablo 1 e bakınız). </li><li> 100 uL&#39;lik bölümler halinde tüplere HkC-S-1 süspansiyon aktarın ve -20 ° C&#39;de saklayın. Not: mümkünse düşük yüzey olarak, bağlayıcı malzeme ile kullanımı borular HkC-S-1 parçacıklar normal santrifüj tüpleri duvarına yapışabilir. </li><li> Opsonize HkC-S-1 <ol><li> İnsan nötrofil için, eritilmiş 100 uL HkC-S-1 insan IgG serum 100 uL ilave edin. </li><li> Fare nötrofiller, normal fare serumu 50 uL ekleyin ve fare Candida Bağışıklık serumunun 50 uL 5 uL 100 (HK Candida enjekte C57B6 farelerde üretilen)arasında HkC-S-1. </li><li> 37 ° C&#39;de bir ısı çalkalayıcı üzerinde karıştırın ve 60-90 dakika süre ile 1100 rpm ve daha sonra 2 saat için 4 ° C silindir üzerine. </li><li> 1 dakika her biri için 17.200 x g&#39;de santrifüjleme ile, BSS tamponu içinde üç kez yıkanır. BSS tamponu 100 uL içinde süspanse edin. </li></ol></li></ol> Nötrofiller 3. izolasyonu <ol><li> insan periferal kan nötrofillerinin için, sağlıklı bir donörün damardan delme ile kan 15 mL almak ve 1000 lU / ml heparin sodyum çözeltisi (heparin 60 uL kan / 10 mL) 90 uL ihtiva eden bir 20 ml şırınga içine yerleştirin. </li><li> Bir pipet kullanarak, şırınga içine% 10 dekstran çözeltisinin 1.5 mL enjekte edilir. yavaşça 3 kez ters çevirin ve bankta dik duran bırakın. </li><li> Kan saman renkli ve eritrositleri içeren bir alt tabaka olan bir üst ince beyaz tabaka tabaka ile, devre kabaca bölünmüş kadar, 30-60 dakika bekleyin. </li><li> Dikkatli bir şekilde bir iğne içinden üst tabaka üzerinden itmek veya bir pipet ucu ile çıkarın. i koyna 15 ml tüp. Kırmızı tabakasının çıkartılması kaçının. 5 mL&#39;lik bir pipet kullanılarak, yoğunluk gradyanlı ortamının 3-4 ml eklemek iki farklı tabaka elde etmek üzere ince beyaz tabaka olarak tüpün dibine (Malzeme listesi). 10 dakika boyunca 913 x g&#39;de santrifüjleyin. Not: kullanılarak fare nötrofiller (fare nötrofil izolasyonu için 17 referans bakın), bunun yerine kemik iliğinden yıkandığından hücre süspansiyonu kullanmaktadır. </li><li> kırmızı pelet geride bırakarak Süpernatantı dökün. Yavaşça girdap pelet rahatsız. Taneciğe damıtılmış otoklava H2O 7 mL ekleyin ve pelet tekrar süspansiyon 20 s için ters çevirin. 2x tuzlu 7 ml ekleyin ve kalan kırmızı kan hücrelerini parçalayan, karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve yaklaşık 4 x 10 6 / mL BSS tampon içinde tekrar süspansiyon pelet. , Hücrelerin optimum mikroskopi için 1,5-6 x 10 6 arasındaki hücre süspansiyonu konsantrasyonunu tutmak: NOT </sup&gt; / ml. </li></ol> Slaytlar 4. hazırlanması <ol><li> 8 oyuklu mikroskopi plaka ön tedavi, oda sıcaklığında 40-60 dakika süre ile her bir poli-L-lizin, 200 uL (0.01% çözelti) ile (Malzeme listesi). </li><li> Poli-L-lisin çıkarın (tekrar edilebilir) ve damıtılmış H2O 200 uL kuyular iki kere yıkayın </li><li> her bir adım 3.6 de hazırlanan hücre süspansiyonu 200 uL ekleyin. 30-60 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Bir tüpe yüksek dereceli DMSO, 100 uL ilave edilerek 5- (ve 6-) -karboksi S-1 asetoksimetil (S-1-am) ester (50 mg) bir kısım hazırlayın. Girdap karıştırmak için. Kullanılmadığı zaman, -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> küçük bir tüp içinde, 1.7 ml BSS tampon eklemek ve S-1-AM, 20 uL. Girdap karıştırmak için. </li><li> BSS tamponu 200 uL kuyular iki kere yıkayın, sonra S-1-AM çözeltisi ile tampon değiştirin. hafifçe pipetleme kuyunun dibine tutturulmuş hücrelerin tek tabaka rahatsız özenKuyular duvarları aşağı. en az 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> BSS tamponu 200 uL kuyular iki kere yıkayın. bir inhibitör test etmek için, BSS bir tamponda uygun bir ilaç &quot;ana karışımı&quot; oluşturur. inhibitör çözeltisi içinde kuyular iki kere yıkayın. NOT: kontrol, ilaç taşıyıcı (örneğin, DMSO ya da etanol), aynı miktarda kullanımı ayrıca inhibitör için kullanılmıştır emin olun. Çinko klorür etkisini test ise çinko fosfat ile çökelirken, (HEPES, tek başına tampon vazifesi görür) PO4 KH 2 eksik BSS tampon kullanın. </li><li> 5 amplitüd um yaklaşık 3 s opsonize HkC-S-1 (bölüm 6.2) sonikasyon. Her kuyuya 10 mcL ekleyin. fagositoz anlık görüntüler için görüntülenmek üzere hücreler hazır hale fagositoz izin vermek için 15-20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li></ol> 5. Konfokal mikroskopi <ol><li> konfokal mikroskop kullanılarak, çok th lazer dalga boyu ayarlamahücre 555 nm&#39;de uyarılmış ve emisyon iki kanal veya detektörler tarafından tespit edilir: 560-600 nm ve 600 nm üzerinde. NOT: Belirli mikroskop parametreleri, her mikroskop için farklıdır ve gerekecektir araştırmacı tarafından optimize edilecek. </li><li> yağ ile 63X objektif kullanarak hücrelerin görüntüle. merkez karo görmek için sürekli ayarında bir kiremit-tarama resmi kullanın. , Odaklama ve lazerin yoğunluğu ve iki kanal kazancı floresans yoğunluğu ve detektör kanallarının kazanç Ayarlama ile görüntü optimize etmek. </li><li> iki kanalı görüntülemek için ayarları kullanarak görüntüyü Böl; sitoplazma veya vaküol flüoresan yoğunluğunun doyum olup olmadığını kontrol edin. Doygunluk kırmızı noktalar olarak görünür. Orada kırmızı noktalar minimum sayıdır, ama hücreler ve fagozomların açıkça görülebilecek kadar parlak olacak şekilde lazer yoğunluğunu azaltın. </li><li> Memnun kaldığınızda, tıklayın &quot;Deneme başlatın.&quot; Bir 9-kiremit tarama görüntü oluşturulur. Karmaşık bir dosya tarafından tavsiye edilen şekilde görüntü kaydetmeİki kanal (JPEG veya tiff olmayan) bir bileşik görüntüsünü içeren bir yazılım. </li></ol> 6. Kalibrasyon Deneyler <ol><li> Tek başına Candida ile pH standart eğri oluşturmak. <ol><li> Tablo 1 &#39;deki gibi, 13,0, pH 3,0 ila tampon hazırlayın. </li><li> HkC-S-1, bir kısım (100 uL) al. 17,200 x g, 1 dakika için Spin. atanan tampon 500 uL içinde süspanse edin. </li><li> düşük bir pH aralığında başlayarak, bir ila süspansiyonu ekleyin (aşama 4,2) da ön-işlemden geçirildi. 37 ° C&#39;ye ayarlanmış bir ısıtılmış sahnede konfokal mikroskop slayt yerleştirin. </li><li> 10 dakika floresan her dakika kaydedin. Her bir tampon için tekrarlayın. </li></ol></li><li> Saponin standart eğrisi. <ol><li> 1 x 10 7 insan nötrofilleri 5 izole etmek ve düşük pH tamponu, 1 mL bunları tekrar süspansiyon. </li><li> p ölçmek için bölüm 4&#39;te tarif edilen yöntem takipnötrofillerde hagosomal pH değerine sahiptir. </li><li> 20 dakika boyunca, Candida süspansiyonu ile inkübe edildikten sonra,% 0.3 saponin eklemek (% 10 stokunun 15 uL bir ön-muamele () aşama 4,2 çukur) çanak ve daha sonra 37 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edilir. 10 dakika Görüntüyü her dakikanızı ayırın. Her bir tampon için tekrarlayın. </li></ol></li><li> Tekniği 5, 18, 19 + / nigericin Yüksek K kullanılarak Sitosolik pH standart eğriler. <ol><li> 13,0 pH 4,0, Tablo 1 &#39;de tarif edilen tamponlar hazırlayın. </li><li> Önceden işlenmiş oyuklarda sadece nötrofiller bırakarak adımları 4,1-4,7 takip - her bir farklı bir tampon yer. 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı aşamaya slayt ekleyin ve floresan 10 dakika boyunca her dakika kaydedin. </li><li> sitosolik pH dış çözelti ile stabilize etmek için belli bir zaman alabilir, ancak bu noktadan sonra, S-1 oran değeri olur: Notsabiti. her deneyde hücre dışı HkC-S-1 Ölçüm eklenen herhangi bir inhibitörleri S-1 yayılan floresan müdahale veya tampon pH değerini etkilemez kontrol etmek için bir kontrol olarak hizmet edebilir. </li></ol></li></ol> 7. Görüntü Analizi NOT: Burada, görüntü analizi (floresan kantitasyonu) özgür yazılım ImageJ kullanılarak ilişkin talimatlar verilir. ImageJ kullanılması tavsiye edilir. <ol><li> Indirin ve geliştirici talimatlara göre 1.46r&gt; ImageJ sürümünü yüklemek (https://imagej.nih.gov/ij/). denilen bu protokol ile ekli ek kod dosyasını yükleme “Phagosomal ölçümü.” </li><li> Resmi Aç J araç çubuğu üzerine analiz için seçilen görüntü dosyası yüklemek ve. iki kanalı birleştirmek için Resim&gt; Renk&gt; Kompozit yap kullanın. </li><li> Sonuçları saklamak için bir dosya seçmek için sağ tıklayın. </li><li> araç çubuğundaki çizgi aracını tıklayın ve # için &amp; genişliğini arttırmak için çift tıklayın34; 2 &quot;. </li><li> Bir fagozomun genişliği boyunca bir çizgi çizin ve ardından &quot;tedbir pH&quot; sağ tıklayın. iki kanal ortalama yoğunluğu elde edilir ve bunların oranları ImageJ kod dosyası tarafından otomatik olarak hesaplanır. </li><li> ölçümleri bitirdikten sonra, seçme sağ tıklayıp &quot;dosyayı kaydedin.&quot; </li><li> fagosom alanını ölçmek için, alanı çevresinde serbest elden çizmek için bir araç çubuğu boyunca dördüncü simgesini kullanın. seçmek için sağ tıklayın &quot;ölçü alanı.&quot; NOT: Sonuçlar kaydedilir ve bir günlük dosyası seçilen dizinde oluşturulur. Sonuçlar E-tabloyu, R ya da eşdeğer bir yazılımı kullanarak işlenebilir. pH floresan oranı arasındaki ilişki yaklaşık olarak sigmoidal ve ImageJ analiz tarafından oluşturulan oran değerleri genel bir lojistik veya sigmoid fonksiyonu ya da doğrusal ya da kübik eğri interpolasyonla kullanılarak pH dönüştürülebilir. </li><li> sitoplazma boyunca bir çizgi çizin, sitoplazmaya ölçmek için ve “önlem pH sağ tıklayın”. </li></ol>

<ol>
	<li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+as+electrochemical+generators+to+produce+ion+fluxes+and+turgor+in+fungi,+plants+and+humans.">NADPH oxidases as electrochemical generators to produce ion fluxes and turgor in fungi, plants and humans.</a> Open Biol. 6 (5), 515-517 (2016).</li><li>Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophils+kill+microbes.">How neutrophils kill microbes.</a> Annu Rev Immunol. 23, 197-223 (2005).</li><li>Cross, A. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+oxidase+of+professional+phagocytes+-+Prototype+of+the+NOX+electron+transport+chain+systems.">The NADPH oxidase of professional phagocytes - Prototype of the NOX electron transport chain systems.</a> BBA Bioenergetics. 1657 (1), 1-22 (2004).</li><li>Demaurex, N., El Chemaly, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+voltage-gated+proton+channels+in+leukocytes.">Physiological roles of voltage-gated proton channels in leukocytes.</a> J Physiol. 588 (23), 4659-4665 (2010).</li><li>Levine, A. P., Duchen, M. R., de Villiers, S., Rich, P. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkalinity+of+neutrophil+phagocytic+vacuoles+is+modulated+by+HVCN1+and+has+consequences+for+myeloperoxidase+activity.">Alkalinity of neutrophil phagocytic vacuoles is modulated by HVCN1 and has consequences for myeloperoxidase activity.</a> PLoS One. 10 (4), 0125906 (2015).</li><li>Reeves, E. P., Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K++flux.">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416 (6878), 291-297 (2002).</li><li>Menegazzi, R., Busetto, S., Dri, P., Cramer, R., Patriarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+ion+efflux+regulates+adherence,+spreading,+and+respiratory+burst+of+neutrophils+stimulated+by+tumor+necrosis+factor-alpha+(TNF)+on+biologic+surfaces.">Chloride ion efflux regulates adherence, spreading, and respiratory burst of neutrophils stimulated by tumor necrosis factor-alpha (TNF) on biologic surfaces.</a> J Cell Biol. 135 (2), 511-522 (1996).</li><li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents.">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Cell Biol. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li><li>Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+the+phagosomal+pH+in+neutrophils.">Determinants of the phagosomal pH in neutrophils.</a> J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Indicators+of+Ion+Concentrations.">Fluorescent Indicators of Ion Concentrations.</a> Methods in Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li><li>Lavis, L. D., Rutkoski, T. J., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+the+pK+a+of+Fluorescein+to+Optimize+Binding+Assays.">Tuning the pK a of Fluorescein to Optimize Binding Assays.</a> Anal Chem. 79 (17), 6775-6782 (2007).</li><li>Hurst, J. K., Albrich, J. M., Green, T. R., Rosen, H., Klebanoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+fluorescein+chlorination+by+stimulated+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent fluorescein chlorination by stimulated neutrophils.</a> J Biol Chem. 259 (8), 4812-4821 (1984).</li><li>Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Phagosome+pH+by+Ratiometric+Fluorescence+Microscopy.">Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (106), e53402 (2015).</li><li>Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+phagosome+pH+regulation+and+maturation+in+human+M1+and+M2+macrophages.">Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages.</a> Mol Biol Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).</li><li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms.">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> J Vis Exp. (109), e53622 (2016).</li><li>Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+new+pH-sensitive+fluoroprobe+(carboxy-SNARF-1)+for+intracellular+pH+measurement+in+small,+isolated+cells.">Application of a new pH-sensitive fluoroprobe (carboxy-SNARF-1) for intracellular pH measurement in small, isolated cells.</a> Pfl &#252;gers Archiv EJP. 417 (2), 234-239 (1990).</li><li>El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hv1+proton+channels+differentially+regulate+the+pH+of+neutrophil+and+macrophage+phagosomes+by+sustaining+the+production+of+phagosomal+ROS+that+inhibit+the+delivery+of+vacuolar+ATPases.">Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases.</a> J Leuko Biol. 95 (5), 827-839 (2014).</li><li>Morgan, D., Capasso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-gated+proton+channels+maintain+pH+in+human+neutrophils+during+phagocytosis.">Voltage-gated proton channels maintain pH in human neutrophils during phagocytosis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 18022-18027 (2009).</li><li>Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+measurements+in+Ehrlich+ascites+tumor+cells+utilizing+spectroscopic+probes+generated+in+situ.">Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ.</a> Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).</li><li>Levine, A. P., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NADPH+Oxidase+and+Microbial+Killing+by+Neutrophils,+With+a+Particular+Emphasis+on+the+Proposed+Antimicrobial+Role+of+Myeloperoxidase+within+the+Phagocytic+Vacuole.">The NADPH Oxidase and Microbial Killing by Neutrophils, With a Particular Emphasis on the Proposed Antimicrobial Role of Myeloperoxidase within the Phagocytic Vacuole.</a> Microbiol Spectr. 4 (4), (2016).</li><li>Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+burst+of+phagocytic+cells+is+associated+with+a+rise+in+vacuolar+pH.">The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH.</a> Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).</li><li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+(C-SNARF-4)+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li><li>Van Erp, P. E. J., Jansen, M. J. J. M., De Jongh, G. J., Boezeman, J. B. M., Schalkwijk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+measurement+of+intracellular+pH+in+cultured+human+keratinocytes+using+carboxy-SNARF-1+and+flow+cytometry.">Ratiometric measurement of intracellular pH in cultured human keratinocytes using carboxy-SNARF-1 and flow cytometry.</a> Cytometry. 12 (2), 127-132 (1991).</li><li>Minamikawa, T., Takamatsu, T., Kashima, S., Fushiki, S., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+calcium+imaging+with+ultraviolet+laser-+scanning+microscopy+and+indo-1.">Confocal calcium imaging with ultraviolet laser- scanning microscopy and indo-1.</a> Micron. 24 (6), 551-556 (1993).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Intracellular+Calcium.">Measurement of Intracellular Calcium.</a> Physiol Rev. 79 (4), (1999).</li><li>Hillson, E. J., Dewitt, S., Hallett, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+methods+for+the+measurement+and+manipulation+of+cytosolic+free+calcium+in+neutrophils.">Optical methods for the measurement and manipulation of cytosolic free calcium in neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 125-137 (2007).</li><li>Bernardo, J., Long, H. J., Simons, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+cytoplasmic+and+phagosomal+consequences+of+human+neutrophil+exposure+to+Staphylococcus+epidermidis.">Initial cytoplasmic and phagosomal consequences of human neutrophil exposure to Staphylococcus epidermidis.</a> Cytometry Part A. 77 (3), 243-252 (2010).</li><li>Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC6+channel+translocation+into+phagosomal+membrane+augments+phagosomal+function.">TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).</li><li>Mart&#237;nez-Zaguil&#225;n, R., Mart&#237;nez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+intracellular+pH+and+Ca2++using+the+fluorescence+of+SNARF-1+and+fura-2.">Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Uygun reaktifler, mikroskop ayarları ve kalibrasyon deneyleri ayarlandıktan sonra, bu yöntem gerçekleştirmek için oldukça basittir. Kritik adımlar şunlardır: S-1 Candida etiketleme kalibre ve görüntü analiz, boyanın herhangi bir aşırı yükleme olduğundan emin olmak için. S-1, nötrofilin 21 için özellikle önemlidir, fakat belirli hücre tipleri kullanılmasını kısıtlar daha alkalik pH ortamlarında uygun bir reaktif,. Makrofaj fagozomların, SNARF-4, ya da S-4 daha fazla asidik ortamlarda, için, çünkü bunun düşük pKa değeri 22 daha uygundur. Ayrıca, daha doğru bir sitoplazmik okumaları için, floresans oranları pH 6&#39;nın altında platoya (Şekil 3) başlaması gösteren S-1 için bir standart eğri olarak, S-4 kullanımı daha iyidir. Diğer boyalar, örneğin, 2&#39; , 7&#39;-bis- (2-karboksietil) -5- (ve-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) ya da pHrodo Kırmızı da cont daha uygun olabilirasidik olması beklenen dahili. Yine sitoplazma boyama hala Candida içeren fagozomların doğru tanımlanması için gereklidir. Bir phagosomal pH göstergesi önemli bir özelliği geri dönüşü olmayan reaktif phagosomal ortamı tarafından değişmez olmasıdır. S-1 nötrofil ortamda dayanıklı olduğu görülmektedir. Bu Levine ve diğerleri tarafından gösterilmiştir. - / - nötrofil 5, bir Hvcn1 fagositozunu ve bir S-1-işaretli Candida parçacık daha sonra tahliye edilmesini göstermektedir (referans 5 Ek video 4). fagosite zaman, partikül (alkali pH nötr) kırmızı, sarı / turuncu döner, fakat partikül nötrofil tarafından serbest bırakılır, bunun orijinal rengine geri döner. S-1 kullanımıyla ilgili sınırlamalar bazı bahsetmek önemlidir. Bu boya rasyometrik ÖLÇÜMÜ sağlayan iki emisyon spektrumunu sahip olmasıkullanan akan bir avantajdır, ancak uzman ekipman görüntüleri elde etmek için gerekli olan; Deneylerde kullanılan mikroskop iki resim aynı anda ya da önemsiz bir zaman gecikmesiyle kayıt gerekir. Yazarlar, bu protokol çalışırken araştırmacı konfokal mikroskopi kullanılarak tecrübeye sahip ya da eğitimli profesyonel erişimi olduğunu varsayalım. onlar her mikroskop için farklıdır ve araştırmacı tarafından optimize edilmesi gerekecektir gibi tüm spesifik mikroskop parametreleri listeler olamaz. boya hücre sitoplazmasına yayılmasını sağlayan S-1 konjüge asetoksimetil ester, flüoresan molekül oluşturmak üzere hücre sitoplazmasında spesifik olmayan esterazlarla parçalanır. Alkali fosfataz gibi esterazlar, hücre kültürü ortamı olarak desteklenmesi için kullanılır insan serumu ve fetal sığır serumu içinde mevcut bulunmaktadır. Bu duruma göre, hücreler, G-1-AM (bakınız bölüm 4.5) ile yüklü olan orta serum içermemelidir. Daha besin Ric gerektiren hücreleri kullanılarak, bu da zor olabilirh ortamı bu protokol boyunca kullanılan dengelenmiş tuz çözeltisi daha onları sürdürmek için. Benzer bir şekilde, örneğin fenol kırmızı gibi diğer floresan ortam bileşenleri, S-1 ölçümlerine müdahale edebilir. Şekil 3 &#39;de hata çubukları, her pH değerinde oranı ölçümleri bazı değişiklikler olduğunu göstermektedir. Her bir deney tekrarları bir uygun sayıda (en az n = 3) ve her biri tek bir deneyde çok sayıda bireysel ölçüm arası koful varyasyonunu yenmek için ihtiyaç vardır. En az 100 her bir durum için fagozomların ve sadece bir Candida içeren görünen kadar phagosomal alanlarında pH ölçümü böylece tavsiye edilir. Fagozomların tamamen (yani, bu tamamen sitoplazma ile çevrili) bir Candida parçacık sardı sahip olanlar olmalıdır miktar tayini için ölçülecek. kantitatif için hücreler / fagozomların seçiminde kasıtsız önyargılara karşı azaltmak için, tüm analizler sırasında yapılmalıdırdeneysel koşullara kör. Burada, bir yoğunluk gradyanı yoluyla plazma tabakanın ardından santrifüj tam kan dekstran sedimantasyonu ile nötrofillerin izolasyonunu tarif eder. hızlı ve verimli bir şekilde nötrofil saf (&gt;% 95) populasyonunu gibi diğer yoğunluk gradyan formüller ya da antikor ya da manyetik ile uzman kitleri kullanılarak nötrofiller negatif seçim yoluyla tam kan merkezkaç olarak kullanılabilen diğer yöntemler vardır, ancak biz, bu tekniği kullanmak boncuklar. Ancak, ikinci rutin nötrofiller izole çoğu grup için pahalı olabilir. Diğer araştırmacılar, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ya da asit sitrat, sodyum (ACD) ile daha alışkın oysa Ayrıca, kan toplama tüpü içinde pıhtılaşma önleyici heparin kullanılır. Seçim için pek çok farklı yöntem vardır gibi, araştırmacının kişisel tercihinize kalmış. Ayrıca,nötrofilleri izole edilmesi ve manipüle zaman aşırı aktivasyonu engellemek için bir dikkatle ele alınmalıdır. Önlem adımlar şunları içerir: tek bir plastik ürünleri kullanılarak, bir cam; filtre-sterilize kontamine endotoksin ayırma tüm tamponları; ne zaman iplik nötrofiller santrifüj aşırı titreşimi önlemek dengeli olduğundan emin olun; Zaman nötrofil santrifüj işleminden sonra topak kalır mümkün olduğu kadar azaltmak; Birden fazla, 5 x 10 6 / mL çözelti nötrofilleri muhafaza etmez; ve tecrit sonra mümkün olan en kısa sürede denemeyi gerçekleştirmek. Kalibrasyon adımları için tarif edildiği gibi bu yöntem, mikroskop, 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılmış bir sahne seti kullanılarak ve aynı pozisyonda bir kez, her 30-60 s anlık alınarak zamanla pH&#39;ı ve phagosomal alanı değişiklikleri ölçmek için adapte edilebilir. Aynı zamanda, teorik olarak, 96 gözlü plakalar içinde daha yüksek verimli deneyler için uyarlanabilir ve Akış sistometri deneyleri için, burada S-1 canpH indikatörü 23 olarak kullanılabilir. Ancak bu ortamlarda, bireysel hücre aktivitesi üzerine vurgu hücre popülasyonu üzerinde daha global bir etkisi ile değiştirilir. Bu yöntem, bireysel araştırmacılar kendi ilgi alanı uyacak şekilde adapte edebileceğiniz bunun üzerine nispeten basit bir deney düzeneği sağlamayı amaçlamaktadır. Araştırmacılar, aynı zamanda, örneğin, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu için, diğer iyonlar hareketinin ölçülmesine iken nötrofil phagosomal pH ve keşfetmek isteyebilir. Örneğin Indo-1, aynı zamanda, 400 ve 475 nm 24 ° C&#39;da iki emisyon spektrumunu olduğu gibi konfokal mikroskopi için hazır çok sayıda floresan Ca2 + göstergeler vardır. Bu emisyon dalga boylarında, S-1 emisyon spektrumu ile üst üste, ama eksitasyon dalga boyu hücrelere zarar olabilir spektrumu, bir ultraviyole (UV) ucunda, bir UV lazer tüm mikroskoplar olağan değildir. Farklı göstergelerin kapsamlı bir incelemesiölçmek hücre içi kalsiyum akısı Takahashi ve arkadaşları tarafından kaplanır. 25 ve Hillson ve diğ. 26. Sonuç olarak, Nunes ve diğerleri gibi farklı floresan boyalar kullanarak phagosomal pH ölçmek için uygun başka yöntemler de vardır. 13 gibi diğer gruplar 27, 28 gösterilmiştir. Diğer araştırmacılar da sitosolik pH 29 veya phagosomal pH 14 ölçmek için S-1 kullanılmıştır. - / - Bununla birlikte, bu protokol, aynı zamanda phagosomal kesit alanı değişiklikleri gözlemlemek ve vahşi tipte ve Hvcn1 ayırt fırsat sağlar sitozol ve fagozomun hem de pH, ölçme benzersizdir fare nötrofiller ile ve olmadan insan nötrofil NADPH oksidaz çalışma.

nötrofil Vücutta en bol bulunan doğuştan gelen immün hücredir. Temel işlevi kan dolaşımına devriye ve içine çeken ve fagositoz 1, 2 olarak bilinen bir süreç karşılaşabilecekleri yabancı madde sindirim oluşur. parçacıklar fagosom adı verilen bir hücre içi bölüm degradasyona uğrar. nötrofil NADPH oksidaz, izoform NoX2, aktivasyonu patojenin ölümü ile sonuçlanacak biyokimyasal reaksiyonların kaskadını başlatır. NoX2 protein alt-birimleri phagosomal membran 3 bir elektron taşıma zinciri kompleksi oluşturmak üzere devam eder. Bir kez süperoksit anyon ve diğer reaktif oksijen türleri üreten fagozomun içinde moleküler oksijene membran boyunca NADPH&#39;den elektrota nakleder, aktive edildi. Bu solunum patlaması olarak bilinir ve verimli mikrobiyal öldürme ve sindirim 2 için gerekli olduğu düşünülmektedir </sup&gt;. o pozitif yük tarafından hareket ve / veya negatif yükü fagozomun dışına hareket telafi olmasaydı Ancak, zar boyunca negatif yük bu özel hareketi yakında NoX2 inaktive edecek. İyi nötrofil şarj telafi çoğunluğu proton kanalı HVCN1 4, 5 ile gerçekleştirilir olduğu tespit edilmiştir. Bu kanal fagozomun sitosolda kendi elektro-kimyasal gradyana aşağı proton pasif hareket edebilmesini sağlar. Proton konsantrasyonunun pH tarafından yansıtılan, yani, oksidaz aktivitesinin, belirli bir seviyesi için, fagozomun pH derecesi ölçülerek şarj telafi protonik olmayan protonik yollarının nispi katılımı hakkında bilgi sağlayabilir. İnsan nötrofil fagosom fagositozu 5 sonra yaklaşık 8.5 20-30 dakika süreyle bir alkalin pH&#39;a sahiptir. Bu NOX ek olmayan proton iyon kanallarının varlığını imagözlenen aksine, asidik bir ortam sağlamak olur füzyon ve HVCN1 ile asidik granüller ve taban tazminat içeriklerini serbest bırakacak şekilde, yük dengeleme 2 ile indüklenen. iyon hareketi de ozmoz ile fagosom boyutunda değişiklik gösterebilirler, bu negatif bir yükü dengelemek için. Yüksek fizyolojik konsantrasyonlarda nötrofil mevcut Bu maddeler iyonları potasyum iyonları fagozomun 6 taşınmak gösterilmiştir ve klorür iyon hareketi nötrofil fonksiyonu 7 için önemli başka bir adaydır. Fagozomun pH düzenlenmesi antimikrobiyal proteaz aktivitesi 5 için hayati önem taşımaktadır. Miyeloperoksidaz (MPO), katepsin G ve elastas için, optimal seviyeler 5, sırasıyla, pH 7-9 ve pH 8-10 iken, pH 6&#39;da en iyi aktiviteye sahip gibi görünmektedir. Bu nedenle, phagosomal pH geçici değişim eğlence farklı enzimler için etkinlik niş sağlayabilirction. pH, nötrofil mikrobiyal öldürmede rol ne anlama yeni nötrofil artırmada mikrobik maddelerin tasarımı için yararlı bilgiler sağlayabilir. nötrofil fagosom oldukça reaktif bir ortamdır. boyalar kolayca okside edilebilir, çünkü bu teknik yapay yol açan, tam olarak pH değerlendirmek zor hale getirir. Tarihsel olarak, flöresin izotiyosiyanat (FITC), hücre içi pH 8, 9 ölçmek için tercih edilen bir boya olmuştur. Bununla birlikte, nötrofil phagosomal pH ölçümü olarak kullanımı için bazı dezavantajları da vardır. O, pH &lt;8 11, doyurur olarak sadece doğru, 5 ila 7,5 ila 8 pH seviyelerini değerlendirmek için de kullanılabilir, yani 6.4 10 bir pKa değerine sahiptir. Nötrofil phagosomal pH daha bazik 5 olmak üzere, FITC potansiyel pH değişiklikleri dizi yakalayamaz. Bir başka özellikleri önemlinötrofillerin bağlamında FITC ile can sorun MPO 12 tarafından photobleached düşünülmektedir olmasıdır. MPO inhibitörü, sodyum azid, 13 ışıkla ağartma sınırlamak için kullanılabilir, fakat sodyum azid ile doğrudan bir MPO bağımsız bir şekilde phagosomal pH&#39;ı düşürür ve bu tür deneylerde 5 kullanılmak için bu şekilde uygunsuz olduğu gösterilmiştir. Diğer hücre içi boyalar ile karşılaştırıldığında, S-1 7.5 10, nispeten yüksek bir pKa değerine sahiptir. asidik koşullarda, molekül protonlanır ve 488 nm veya daha uyarıldığı zaman 560 ve 600 nm arasında bir emisyon sinyali üretir. molekül daha alkalin koşullarında deprotone edildiğinde, emisyon dalga boyu 600 nm üzerindedir. Bu fluorofor konsantrasyonu ve hücre yapısı etkilenmez, bu iki dalga boyunda floresan yoğunlukları bir oran, daha fazla tek fluoresans ölçümleri daha güvenilir olduğu emisyon kayması gösterir. Isı-ölümlü (HK), Candida albicans, tercih edilmesine rağmen, daha büyük bir yüzey alanı daha tutarlı bir floresans okuma verir S-1, örneğin zimosan 14 olarak, bir antijene konjuge edilebilir. Ayrıca (Şekil 3) 5 pH geçici değişiklikler incelemek için bu metodun bir modifikasyonu kullandık. Daha alkali fagozomların 14 başka bir yerde 15, 16, ve hücreleri için anlatılan şekilde sitosolik pH ölçümü için bu yöntem kolayca diğer hücre tipleri de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt; ATCC 10231 Vitroids&amp;nbsp; 80 CFU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RQC14003-10EA</td><td>Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td>Follow manufacturer&#039;s instructions, various providers exist</td></tr><tr><td>Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000</td><td>MP Biomedicals</td><td>2101514</td><td>Use gloves&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL&amp;nbsp;</td><td>Fannin, Wockhardt UK Ltd</td><td>FP1077</td><td>We purchased from UCH inpatient pharmacy</td></tr><tr><td>SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>SS22801</td><td>Use gloves</td></tr><tr><td>5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>C1272</td><td>Use gloves</td></tr><tr><td>Vivaglobin human IgG&amp;nbsp; 160 mg/mL solution</td><td>CSL Behring</td><td>received as a gift</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Normal mouse serum</td><td>Abcam</td><td>ab7486</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Lymphoprep (density gradient medium)</td><td>Alere Ltd</td><td>1114547</td><td>Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&amp;nbsp;</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Magnesium sulphate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Diphenylene iodonium (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Zinc chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td>Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate</td></tr><tr><td>Poly L lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, &gt;610 nm)</td></tr><tr><td>Ibidi &amp;micro; slide 8 well ibiTreat</td><td>Thistle Scientific</td><td>IB-80826</td><td>Other appropriate imaging dishes can be substituted</td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>Any appropriate sonicator will suffice</td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>BioRad</td><td></td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>1.5 mL Protein LoBind Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td>Specially used as &lt;em&gt;Candida&lt;/em&gt; can stick to normal eppendorfs</td></tr></tbody></table>

imaging the neutrophil phagosome and cytoplasm using a ratiometric ph indicator

Nötrofiller doğuştan savunma barındırmak için çok önemlidir ve dolayısıyla tıbbi araştırma önemli bir alan oluşturmaktadır. fagosom, sardı parçacıkların öldürülmesi ve sindirim meydana hücre içi bölme, sıkı bir şekilde düzenlenmesini gerektirir nötrofil patojen öldürme için önemli alandır. Phagosomal pH dikkatli bir şekilde, antimikrobiyal bir proteaz aktivitesinin düzenlenmesinde da kontrol edilir bir yönüdür. Birçok flüoresan pH&#39;a duyarlı boyalar phagosomal ortamı görselleştirmek için kullanılmıştır. S-1, çift emisyon spektrumları, foto-ağartma karşı direnç, ve yüksek pKa&#39;sı dahil olmak üzere diğer pH&#39;a duyarlı boyalar, üzerinde birçok avantajı vardır. Bu yöntemi kullanarak, nötrofil fagosom diğer fagositler göre alışılmışın dışında alkali olduğunu göstermiştir. fagozomun boyutu ve şeklindeki değişiklikler, tespit edilebilir, böylece boyanın farklı biyokimyasal çekimleri kullanarak, fagosom sitoplazmadan tarif edilebilir. Bu f veririyonik hareketi ya da daha fazla izlenmesi.

Şekil 1, değişen phagosomal ortamları göstermek için, farklı kökenlerden gelen nötrofillerin anlık sunulur. nicel analizini kolaylaştırmak için, hücrelerin uygun bir sayısı ile kuyu tohum önemlidir: çok doğru bir kapalı fagozomların görüntülemek için güçleştirir hücrelerin birbirleri üzerine tabaka neden olur; Çok az irade, elbette, her nötrofil fagosite olmayacak özellikle de, daha az sonuç sağlar. Şekil 2, aşırı doymuş bir görüntü olduğu; Maksimum floresan tespit edildiğini nerede kırmızı noktalar göstermek - bu iki kanal arasında görüntü bölme (Malzeme Listesinde veya eşdeğeri tavsiye mikroskop yazılımı kullanılarak) tarafından değerlendirilebilir. Bu lazerin yoğunluğunun azaltılması ile karşılaştırılabilir. Çeşitli tampon sistemleri kullanılarak kalibrasyon eğrileri Levine ve arkadaşları uyarlanmıştır, Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. 5. &lt;/ Sup&gt;. Hata çubukları okumaları arasındaki floresans bazı değişiklikler olduğunu göstermektedir. Şekil 4, phagosomal pH ve alanı ile ilgili veri sunulabilir bir örnek verir. Bu yaklaşım, her bir ölçüm aşırı döşeme Boxplot ile görüntülenmesine olanak sağlar. Bununla birlikte, veriler aynı zamanda bir histogram çubuk grafik olarak görüntülenebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig1.jpg" /> Şekil 1: insan ve farelerden alınan nötrofillerin Uygun anlık görüntüler. sağında için pH değerine karşılık gelen S-1-lekeli fagozomların yaklaşık renk ve görülebilir bir kalitatif bir anahtardır. kırmızı daha alkalikliğini gösterir iken sarı renkli, daha asiditeyi gösterir. / -, - (A) Hvcn1 gösteren fare kemik iliği nötrofiller fagositoz 20 dakika sonra. fagozomların çok kırmızı alkalin ve şişmiş görünür. sağ alt kısmında kırmızı okbir hücre içi Candida görüntü noktaları, bir hücre dışı parçacığa sol üst noktalarında ok ise. (B) Candida yutan yabani tip fare kemik iliği nötrofilleri göstermektedir; - / - hücrelerinin de Hvcn1 çok daha az alkalin. (C), fagositoz sonra aynı noktada insan periferal kan nötrofilleri gösterir. Bunlar fare yabanıl tipteki hücrelerden göre biraz daha alkali görünür, ancak fagozomların hala Hcvn1 kadar büyük ve kırmızı değildir - / - hücrelerinde. (D) 5 uM difenilen iyodonyum (DPI) varlığında, Candida fagosite insan nötrofilleri gösterir. Tüm fagozomların 6 ya da daha az bir pH&#39;a sahip olan, çok asidik olan; İlaç, NADPH oksidaz inhibe yüzden telafi edici iyon hareketi vardır. Fagozomun için sigorta asidik granüllerden serbest proton inci V-ATPaz asidik pH 20 ve daha fazla toplanmasına nedenDPI 9 ile işlenmesi üzerine, e phagosomal membran. Sitoplazma diğer koşullardan hücreleri ile karşılaştırıldığında daha fazla alkalin görüntülenir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig2.jpg" /> Şekil 2: Aşırı doyma Hvcn1 arasında - / - fare kemik iliği nötrofil. Floresans veri aşırı doymuş olan analiz görüntülerden hariç tutmak için önemlidir. Bölüm 5.3&#39;de açıklandığı gibi, kompozit görüntü bireysel olarak sunulan her iki kanallı iki resim (sol üst, kırmızı ok) ayrılır. Bu yazılım, aralık göstergesi (alt kırmızı sol ok) ile kontrol edilir, daha sonra aşırı doymuş olan herhangi bir piksel, parlak kırmızı. aşırı doygunluk her iki kanalda da mevcut (1 ve 2) bulunmaktadır. bir magnifBazı hücrelerin ication ve hücre dışı Candida oklar etkilenen bölgelere bakacak şekilde, sağ alt kısmında gösterilir. bu noktaları analiz sahte oranlı metrik ölçüme yol açacak. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55107/55107fig3.jpg" /> Şekil 3: pH ölçümleri S-1 floresan oranları dönüştürülmesi için standart kalibrasyon eğrileri. Hücreler saponin ( &quot;Saponin&quot;) ile geçirgen hale olduğunda ve ( &quot;Tris&quot; olarak adlandırılan), tek başına farklı tamponlar Candida için standart eğriler, S-1 hücre (fagozomun ve hücre dışı iç ve dış okuma gösteren, çok benzerdir ortamı) ile karşılaştırılabilir. hata çubukları ± SD ortalamasını temsil etmektedir. i test edildiği zaman, S-1 oranı / pH eğrisi kısalırn, görüntü analizi de dikkate alınmalıdır sitoplazma ( &quot;Sitoplazma&quot;). Bu şekil, Levine ve arkadaşları modifiye edilmiştir. 5. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55107/55107fig4.jpg" /> Şekil 4: phagosomal pH ve alanın miktarının belirlenmesi. Bu şekil, veri sunumunun bir örneğini sunmaktadır. Phagosomal oranı ve mukabil pH A ile gösterilmektedir (- / - Hvcn1 fare kemik iliği nötrofiller), A: B: grafikleri programlama yazılımı R.A kullanılarak oluşturulmuştur vahşi tipli fare kemik iliği nötrofiller, C: insan periferal kan nötrofilleri, ve D: insan 5 uM, n = DPI 3/300 ile nötrofiller. Bireysel ölçümler bir medi ile boxplot kaplayan ile, küçük kareler olarak gösterilmektedirBir ve çeyrek değerler aralığı. Kırmızı çubuk ortalamayı temsil eder. Şekil 1 &#39;de resimlerde görüldüğü gibi, Hvcn1 - / - hücreleri, vahşi tipli fare ve insan nötrofil ile karşılaştırıldığında çok alkali fagozomların sahiptir. Ayrıca daha büyük bir phagosomal alanı (Şekil 4B, n = 3/300) sahiptir. DPI ile inkübe insan nötrofil çok asitli ve küçük fagozomların varken İnsan nötrofil fagozomların, vahşi tipli fare nötrofiller biraz daha fazla alkali ve daha büyüktür. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <table><tbody><tr><td colspan="4"> Dengelenmiş tuz solüsyonu (BSS) tamponu </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 156 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 3 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 2 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH2 PO4 </td><td> 1.25 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 10 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> NaOH veya HCI ile pH 7.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> YPD suyu </td></tr><tr><td> YPD suyu </td><td> 50 gram </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Arıtılmış su </td><td> 1 L&#39;lik </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklav </td></tr><tr><td colspan="4"> YPD agar için: otoklavlama 15 g eklemeden önce / L ağar </td></tr><tr><td colspan="4"> % 10 dekstran çözeltisi </td></tr><tr><td> Dekstran klinik dereceli </td><td></td><td> 50 gram </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td> &lt;td&gt; </td><td> 4.5 gr </td><td></td></tr><tr><td> Arıtılmış su </td><td></td><td> 500 mL </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de bir cam şişe ve otoklav ekle </td></tr><tr><td colspan="4"> 2x Tuzlu Çözelti </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 18 g </td><td></td></tr><tr><td> Arıtılmış su </td><td></td><td> 1 L&#39;lik </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de bir cam şişe ve otoklav ekle </td></tr><tr><td colspan="4"> % 10 Saponin stok </td></tr><tr><td> BSS tamponu </td><td></td><td> 50 ml </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td></td><td> 5 g </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 37 ° C&#39;ye kadar ısı BSS tamponu, saponin ilave edilir ve karıştırılır. </td></tr><tr><td colspan="4"> 4 ° C &#39;de koruyucu olarak% 0.1 sodyum azid, depo karışımı ekleyin. </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kalibrasyon tamponlar </td></tr><tr><td colspan="4"> Candida standart eğri </td></tr><tr><td colspan="4"> Öncelikle her tamponun 0.15 M stok makyaj </td></tr><tr><td colspan="4"> 0.15 M NaCl solüsyonu Makyaj </td></tr><tr><td colspan="4"> 15 mL nihai hacim: 5 ml + 10 ml 0.15 M NaCI çözeltisi, istenen tampon çözeltisi, 0.15 M </td></tr><tr><td> pH değeri 3 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM glisin </td><td></td></tr><tr><td> pH değeri 4 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM asetat </td><td></td></tr><tr><td> pH değeri 5 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM asetat </td><td></td></tr><tr><td> pH 6 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM asetat </td><td></td></tr><tr><td> pH değeri 7 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH 8 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH 9 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH değeri 10 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM glisin </td><td></td></tr><tr><td> pH değeri 11 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM fosfat </td><td></td></tr><tr><td> pH değeri 12 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM fosfat </td><td></td></tr><tr><td> pH değeri 13 </td><td> 100 mM NaCI </td><td> 50 mM fosfat </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Sitosolik standart eğri </td></tr><tr><td colspan="4"> Daha önce 0.15 M stok tampon çözümler kullanın </td></tr><tr><td colspan="4"> 0.15 M KCl çözeltisi Makyaj </td></tr><tr><td colspan="4"> 15 mL nihai hacim: 5 ml istenen tamponu, 10 mL, 0.15 M KCI çözeltisi 0.15M </td></tr><tr><td colspan="4"> Etanol nigerisin 10 mM stok, her bir nihai hacim çözeltiye 15 uL ilave </td></tr><tr><td> pH değeri 3 </td><td> 100 mM KCI </td&gt; <td> 50 mM glisin </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH değeri 4 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM asetat </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH değeri 5 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM asetat </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH 6 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM asetat </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH değeri 7 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH 8 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH 9 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH değeri 10 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM glisin </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH değeri 11 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM fosfat </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH değeri 12 </td&gt; <td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM fosfat </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td> pH değeri 13 </td><td> 100 mM KCI </td><td> 50 mM fosfat </td><td> 10 uM nigericin </td></tr><tr><td colspan="4"> HCI veya NaOH ile pH tüm kalibrasyon çözeltileri </td></tr></tbody></table> Tablo 1: tamponların bileşim. Bu tablo, protokolünde kullanılan farklı tamponlar uygun bileşimleri tarif etmektedir. Ek kod dosyası. Bu dosya görüntü analizi için gerekli olan AP Levine tarafından yazılan makrolar, bir dizi içerir. Yazarlar, bu kodu kullanarak ilişkili herhangi sorguları adrese denemek için mutlu olurdu. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/55107/Phagosomal_measurement.txt" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator at JoVE.com

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH&#39;ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir.

Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

imaging-neutrophil-phagosome-cytoplasm-using-ratiometric-ph

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Görüntüleme.  University College London.  Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH'ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir. 

Video: Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

Sentez, Hücresel Teslimat ve<em&gt; In vivo</em&gt; Dendrimer tabanlı pH Sensörlerin Uygulamaları

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

Kimya

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites are not distributed evenly in dental biofilms. A complex interplay of sorption to and reaction with organic matter in the biofilm reduces the diffusion paths of solutes and creates steep gradients of reactive molecules, including organic acids, across the biofilm. Quantitative fluorescent microscopic methods, such as fluorescence life time imaging or pH ratiometry, can be employed to visualize pH in different microenvironments of dental biofilms. pH ratiometry exploits a pH-dependent shift in the fluorescent emission of pH-sensitive dyes. Calculation of the emission ratio at two different wavelengths allows determining local pH in microscopic images, irrespective of the concentration of the dye. Contrary to microelectrodes the technique allows monitoring both vertical and horizontal pH gradients in real-time without mechanically disturbing the biofilm. However, care must be taken to differentiate accurately between extra- and intracellular compartments of the biofilm. Here, the ratiometric dye, seminaphthorhodafluor-4F 5-(and-6) carboxylic acid (C-SNARF-4) is employed to monitor extracellular pH in in vivo grown dental biofilms of unknown species composition. Upon exposure to glucose the dye is up-concentrated inside all bacterial cells in the biofilms; it is thus used both as a universal bacterial stain and as a marker of extracellular pH. After confocal microscopic image acquisition, the bacterial biomass is removed from all pictures using digital image analysis software, which permits to exclusively calculate extracellular pH. pH ratiometry with the ratiometric dye is well-suited to study extracellular pH in thin biofilms of up to 75 &#181;m thickness, but is limited to the pH range between 4.5 and 7.0.

A pH-sensitive ratiometric dye is used in combination with confocal laser scanning microscopy and digital image analysis to monitor extracellular pH in dental biofilms in real-time.

Diş Biyofilmler ekstraselüler pH rasyometrik Görüntüleme

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells maintain organismal homeostasis and immunity. Simultaneously, and in contrast to its homeostatic role, it can also drive various pathologies, including cancer and viral infections. Unlike other modes of endocytosis, the tools developed for studying the maturation of macropinosomes remain underdeveloped. Here the protocol describes newly developed tools for studying the redox environment within the lumen of early and maturing macropinosomes. Methodologies for using ratiometric fluorescence microscopy in assessing the pH, production of reactive oxygen species, and the degradative capacity within the lumen of individual macropinosomes in live cells are described. Single organelle measurements offer the advantage of revealing spatiotemporal heterogeneity, which is often lost with population-based approaches. Emphasis is placed on the basic principles of dual fluorophore ratiometric microscopy, including probe selection, instrumentation, calibration, and single-cell versus population-based methods.

We describe protocols for measuring pH, oxidative events, and protein digestion in individual macropinosomes in live cells. An emphasis is placed on dual-fluorophore ratiometric microscopy and the advantages it offers over population-based techniques.

Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Biyoloji

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

İPSC-Makrofajlar tarafından Ölü Nöroblastom Hücrelerinin Fagositozu için İn vitro Nicel Görüntüleme Tahlili

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Nörobilim

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Drosophila melanogaster Malpighi tübül epiteli optik Quantification intrasellüler pH floresan genetik olarak kodlanmış pH göstergesi

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...