Authors would like to thank Andrew Bird for the silage samples and Audrey Farbos of the Exeter Sequencing Service for her assistance in preparing DNA sequencing libraries. Exeter Sequencing Service and Computational core facilities at the University of Exeter. Medical Research Council Clinical Infrastructure award (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) and BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

1. Site Yeri <ol><li> Böyle bir çiftlikte gibi uygun bir siteden silaj örneği toplayın. Burada, çiftlik Ballydulea, Co Cork, İrlanda (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W) yer oldu. </li></ol> 2. DNA Ekstraksiyon Not: DNA ekstraksiyonu, üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Resim örnek bulunan bir negatif kontrol, kütüphane Hazırlama yöntemi içinde kullanıldı. <ol><li> Verilen parçalama tüplerinde 978 uL sodyum fosfat tamponu ve 122 ul toprak lizis tamponu numune 400 mg - 100 ekleyin. </li><li> 6.0 m / s kadar bir hızda 40 saniye boyunca homojenleştirici lizis tüpleri yerleştirerek örnekleri homojenize. </li><li> Santrifüj lizatları 15 dakika 14.000 xg&#39;de ve Protein Çökelti Çözüm 250 ml (PPS) içeren temiz bir mikro-santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. 10 kez ve santrifüj tersini çözüm karıştırın5 dakika boyunca 14.000 x g&#39;de. </li><li> Temiz bir 15 mL santrifüj tüpünde 1 ml DNA bağlama matrise süpernatant ekleyin. 3 dakika boyunca sürekli tersini tüp çözüm karıştırın. Karışım, daha sonra, 3 dakika razı yüzer 500 uL atmak için izin verir. kalan süpernatant karıştırın. </li><li> 1 dakika için 14,000 x g&#39;de bir eğirme filtresi ve santrifüj süspansiyon 600 ul aktarın. süzüntü atın ve kalan süspansiyon işlemi tekrarlayın. </li><li> daha sonra 1 dakika için 14,000 x g&#39;de santrifüj, pipetleme karışım, sıkma filtre içinde DNA bağlama matrisi yıkama tamponu 500 ul ekle. </li><li> süzüntü atın ve 2 dakika tüm yıkama tamponu kaldırılır sağlamak için 14.000 xg tekrar sıkma filtresi santrifüj. 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de santrifüj kurutun. </li><li> Pre-sıcak (70 ˚C) DNaz içermeyen su (DES) ve yeniden askıya sıkma filtre içinde DES 100 uL DNA bağlayıcı matris. Temiz bir 1.5 ml mikro santrifüj tu spin filtre aktarınolacak ve 1 dakika DNA Zehir için 14.000 xg&#39;de santrifüj. daha fazla analiz yapılana kadar -20 ° C&#39;de arıtılmış, DNA saklayın. </li></ol> 3. DNA Saflaştırma kullanılarak DNA saflaştırma Boncuk Not: Alınan DNA saf DNA örneği sağlamak için saflaştırma boncuklar kullanılarak saflaştırılmıştır Önceki metagenomic kütüphanesi hazırlanmasında elde edildi. <ol><li> kullanımdan önce, 30 dakika boyunca 23 ° C&#39;de boncuk inkübe edin. DNA örneğine boncuk 2 hacim ilave edin ve 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de çözelti inkübe edilir. </li><li> 5 dakika için bir ayrıştırma mıknatıs üzerine numuneler ve süpernatant atılır. 200 uL taze% 80 etanol (EtOH) ile iki kez boncuk yıkayın. Hava, 10 dakika boyunca taneciklerin kurutulması. </li><li> ayırma mıknatıs örnekleri çıkarın ve elüsyon tamponu (EB) 50 mcL, pipetleme ile karıştırın. </li><li> daha sonra tekrar 3 dakika için ayrılma mıknatıs üzerine örnekleri yer, 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de süspansiyon inkübe edin. </li><li> Trtemiz bir tüpe DNA içeren süpernatant, ansfer. boncuk atın. </li><li> Dördüncü bölümde uyarınca saflaştırılmış DNA niceliğini. </li></ol> Saflaştırılmış DNA 4. Niceleme Not: Saflaştırılmış DNA, bir florimetre ve üreticinin talimatları izlenerek, çift sarmallı (dsDNA) yüksek duyarlılık (SS) deneyi kiti kullanılarak ölçülmüştür. <ol><li> reaktiftir tamponu: 1 oranını 199 kullanarak bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> çalışma çözeltinin 190 mcL her DNA standardının 10 mcL ekleyin. </li><li> çözümü çalışma 190 mcL saflaştırılmış DNA 10 uL ekleyin. Nihai hacim 200 ul olmalıdır. 2 dakika boyunca 23 ° C&#39;de, standart ve DNA örnekleri inkübe edin. </li><li> Ekrandaki yönergeleri kullanarak florometrede DNA örnekleri daha önce standartları analiz edin. </li></ol> 5. Shotgun Sıralama Kütüphane Hazırlık NOT: av tüfeği sıralama kütüphanesi kullanılarak hazırlanmıştırÜreticinin talimatlarını kullanarak ticari kütüphane hazırlık seti. <ol><li> 0.2 ng / ml kullanarak EB DNA örnekleri sulandırmak. Bu konsantrasyonun altında olan herhangi bir örneği, negatif kontrol, yani, mevcut konsantrasyonda bırakılır. </li><li> tampon ve 5 uL enzim karışımı 10 uL saflaştırılmış DNA 5 ul karıştırın. 5 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> tampon nötralize 5 uL ilave edin ve 5 dakika boyunca 23 ° C&#39;de çözelti inkübe edilir. </li><li> Örnek özel sıralaması endekslerinin her 5 uL ve 15 uL PCR ana karışımı ekleyin. </li><li> bir PCR, 10 s, 30 s boyunca 55 ° ve 30 saniye için 72 C, 95 ° C 12 döngü önce 3 dakika, 30 saniye süreyle 95 ° C, 72 ° C&#39;de numune inkübe edin. 5 dakika boyunca 72 ° C&#39;de son örnekleri inkübe edin. </li><li> daha önce olduğu gibi, ancak EB 30 uL nihai elüsyon ile topuk kısmı arıtma ile hazırlanan DNA saflaştırılır. </li></ol> 6. Library Miktar ve Kalite Kontrol NOT: hazırlanmış kütüphanelerin miktarı ve kalitesi ticari bir kit ve cihazlar kullanılarak değerlendirildi. <ol><li> kullanımdan önce, 30 dakika boyunca 23 ° C&#39;de kitleri inkübe edin. </li><li> 2,000 rpm&#39;de 1 dakika için tampon ve vorteks 2 uL DNA 2 ul ekleyin. </li><li> o tüpün dibinde olduğundan emin olmak için numune aşağı doğru döndürün. </li><li> aracı haline örnek tüpleri, analiz bandı ve ipuçları takın ve yazılım tarafından yönlendirildiği gibi analizi gerçekleştirmek. </li></ol> 7. Adı geçen DNA Sekanslama <ol><li> 300 bp eşleştirilmiş uç sıralama 45 kullanarak bir sıralama servis ve diziye hazırlanan ve sayısal DNA dizileme kütüphaneleri örnekleri aktarın. </li></ol> Ham Sıra Verilerin 8. Analiz NOT: Linux işletim sistemini kullanan her program için komutlar protokol adımı aşağıda gösterilmiştir. s için kullanılan boru hattıSequence veri analizi, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. programlar analizden önce kullanıcı tarafından monte edilmelidir. Bu işlem, her bir örnek için tek tek gerçekleştirilmelidir. <ol><li> Analiz ve ileri ardından komut satırı / yol Dosyaya / fastqc için yazarak FastQC 46 kullanılarak DNA dizisi veri görselleştirmek ve ham raw_read1.fastq raw_read2.fastq okur ters. </li><li> -o output_fastqc ve -f fastq ham okuma dosyalarının dosya biçimini yazarak bir çıkış klasörü belirtin. </li><li> Çıktı dosyası (Şekil 2) görüntüleyin. yol Dosyaya / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq. </li></ol> 9. Kalite Kontrol Kesme ve Filtreleme Sıra Veri <ol><li> Komut satırı java-jar / yol Dosyaya / trimmomatic-0.35.jar içine yazarak kırpma programı, Trimmomatic 28 çalıştırın. </li><li> Belirtin dosyalar &#39;PE&#39; yazarak uç dosyaları eşleştirilmiş. Devlet bu 16 merkez processing birimi (CPU) -threads 16 yazarak program tarafından kullanılmalıdır. </li><li> Ham ileri isimlerini yazarak QC kontrolüne iki dosyaları listelemek ve okur ters. çıkış dosyalarının önek -baseout Silaj yazarak belirlenir. </li><li> ILLUMINACLIP yazarak program seçenekleri tanımlayın: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LİDERİ: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 ÜRÜN: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36. </li><li> Tamamlandığında, daha önce olduğu gibi FastQC kullanılarak kesilmiş dizileri analiz ve başarılı yapılmıştır kırparak sağlamak için ham dizi verilerine çıktı karşılaştırın. NOT: yazılım aracı, Trimmomatic, önde gelen düşük kaliteli veya N üsleri kaldırarak daha okur kesilmiş (aşağıda kaliteli 3), düşük kaliteli veya N üsleri firar kaldırma (aşağıda kalite 3) ve her bir 4-baz geniş sürgülü pencere okumak taramaları yapılabilir. parametreler tabanı başına ortalama kalite herhangi 36 baz uzunluğunda altına okur düşmesi daha sonra 20 altına düşerse ve ne zaman kesmek için kuruldu. Son olarak, 15 baz FR kesilmiş edildiom her başkanı okumak ve okuma başından itibaren 200 üsleri korumak için kırpılmış edildi okur. Bu son adım, uzun sequencing zaman bazı kalite sorunları aşmak için yapıldı (&gt; 200 bp) okur. Bu özel örneklerin 28 için ayarlanabilir. java-jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout silaj ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LİDERİ: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 ÜRÜN: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36 </li></ol> 10. metagenome Meclisi <ol><li> , Eşleşmemiş kesilmiş Birleştirme eşleşmemiş okur tarafından takip kedi yazarak okur; silage_read2_unpaired.fastq silage_read1_unpaired.fastq. yazarak yeni bir dosya dosyaları yazın&gt; silage_merged_unpaired.fastq cat silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> De novo sıralı DNA monte etmek için, yazarak / yol-to tarafından kollar (St. Petersburg genom montajcı) 30 kullanın-dosya / spades.py. 16 CPU&#39;lar --meta yazarak uygulanan gereken metagenomic parametresi 16 t yazarak ve kullanılacak olduğunu belirtin. </li><li> ileri kesilmiş tanımlamak kullanarak -1 silage_read1_paired.fastq okur ve ters -2 silage_read2_paired.fastq tarafından okur. Birleştirilmiş çiftlenmemiş -s silage_merged_unpaired.fastq tarafından belirlenir okur. </li><li> silage_spades -o yazarak çıkış klasörü tanımlayın. yol Dosyaya / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11. Eşli uç Oku Bindirme <ol><li> DNA dizisinin çiftleri komut satırı / yol Dosyaya / flash içine yazarak FLAŞ (Short hızlı Uzunluğu Ayarı okur) 29 kullanılarak okur Birleştirme. 16 CPU&#39;lar Silaj -o yazarak 16 ve çıkış öneki -t kullanılarak kullanılması gerektiğini belirtin. </li><li> kesilmiş tespit silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq yazarak okur yol Dosyaya / flaş 1 -t6 -o silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq parladı </li></ol> 12. Taksonomik Sınıflandırma <ol><li> Tür / yol-dosya / kraken ve / yol Dosyaya / standart --db yazarak veritabanını belirtin. </li><li> 16 CPU&#39;lar --threads 16 yazarak kullanılması gerektiğini tanımlamak ve FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt --output kullanarak bir çıkış klasörü tanımlamak. girdi dosyasının adını yazın; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq yol Dosyaya / kraken --db standart --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq NOT: Kraken 7 kullanılarak monte DNA dizisi iskelelerinin sınıflandırılması mevcut tüm Prokaryot genom dizileri içeren en son standart Kraken veritabanı karşı tamamlandı. </li><li> -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int kesim yazarak çıktı dosyası ve yeni bir dosya aktarma kolonlar 2 ve 3 </li><li&gt; Web tarayıcısında çıktı dosyasını açın. -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int kesilmiş </li><li> KtImportTaxonomy yazarak Kronu 12 içine yeni bir dosya aktarın. FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int yazarak giriş dosyası belirtin. FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html -o yazarak çıkış dosyası belirleyin. yol Dosyaya / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. Fonksiyonel Notu <ol><li> MG-RAST 47 web sitesi, http://metagenomics.anl.gov/ gidin. Gerekirse yeni bir kullanıcı olarak kayıt. Giriş yaptıktan sonra, &quot;Yükle&quot; butonuna tıklayın. Adım 10 monte iskeleleri yükleyin. </li><li> Dosyaları yükledikten sonra, &quot;Gönder&quot; ve talimatları izleyin tıklayın ve analiz tamamlanmasını bekliyor. </li><li> Analiz tamamlandıktan sonra, em yoluyla gönderilen linki görmekMG-RAST dan veya alternatif ail, &quot;İlerleme&quot; üzerine tıklayın. tamamlanan işlerin bir listesi vardır. İlgili iş kimliği ve ardından &quot;indirme sayfasına&quot; bağlantısına tıklayın. </li><li> indirme sayfasında, başlığı &quot;Protein Kümelenme% 90&quot; başlığı altında, 550.cluster.aa90.faa tahmin protein dosyasını indirmek için protein butonuna tıklayın. </li><li> Olarak varsayımsal belirli bir cazy enzim sınıfa ait proteinleri sınıflandırmak için, cazy veritabanına 48 indirilen proteinleri karşılaştırın. dosyalarından enzim karbonhidrat-aktif veritabanı (cazy) indirin şunlardır: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip ve PL.zip. Bu dosyalar sırasıyla aşağıdaki enzim sınıfları temsil: Yardımcı Etkinlikler (AA), Karbonhidrat esterazlar (CE), glikosid hidrolazlar (GH), Glukozil transferazlar (GT) ve Polisakarit Liyazlar (PL). </li><li> veritabanı dosyaları halletmek ve USEARCH UBLAST ALGOR kullanarak cazy veritabanı proteinleri protein benzerliği belirleyerek proteinleri açıklamaithm 49. 5 veritabanı .txt dosyaları tip yineleme yapmak (* .txt olarak i için) bash döngü kullanmak için &quot;* .txt olarak i için; yapmak&quot;. </li><li> ublast algoritmasını kullanmak için parametre -ublast ile yazarak / yol Dosyaya / usearch8 tarafından USEARCH çalıştırın. Sonra MG-RAST, &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot; indirilen protein dizi dosyasının adını yazın. </li><li> Veritabanı dosyasını belirtmek için &quot;$ i -DB&quot; ve 1e -5 ° e-değer eşiği belirlemek için tipini, türünü &quot;-evalue 1e-5&quot; kullanılacak. </li><li> Bir hedef dizinin bulunmasından sonra aramayı sona erdirmek ve bu nedenle, hedef enzim sınıfına, örneğin, GH, tip 1 &quot;-masaccepts&quot; ait olarak, protein sekansı sınıflandırmak için. </li><li> 16 CPU&#39;lar türü kullanılan &quot;16 -threads&quot; ve atab ayrılmış metin türü &quot;-blast6out&quot; olarak çıktı dosyasının formatını belirtmek için gerektiğini tanımlamak için kullanılır. Çıktı dosya türü &quot;$ i.ublast&quot; tanımlamak için. t, bash döngü sona erdirmek içinYPE &quot;; done&quot; * .txt Olarak i; do / yol Dosyaya / i -evalue usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -DB $ 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 $ i.ublast -blast6out; tamam </li></ol> 14. görselleştirme cazy Açıklaması <ol><li> bash döngü kullanarak her enzim sınıfı için protein kimliği listeleri, bir Venn diyagram olarak cazy açıklama çıkışı görselleştirmek oluşturmak için. &quot;* .ublast Içinde i için; yapmak&quot; yazın. </li><li> Çıktı dosyası ve yeni bir dosyaya sütun 1 aktarmak için yazın &quot;kedi $ i | -f 1&gt; $ i.list kesti&quot;. </li><li> döngü ve türünü sonlandır &quot;; done&quot;. </li><li> bir metin editörü .list dosyaları açın. , Web sitesine gidin 5 gibi set sayısını seçmek ve ayrı bir kutuda her liste dosyasının içeriğini yapıştırın. Bir .SVG dosyası olarak ortaya çıkan şeması indirin. i * .ublast en çok; Kedi $ i do | kesme -f 1&gt; $ i.list; tamam </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Siliko analizinde bir çevresel örneklerin içinde mevcut olan mikrobiyal topluluklar için mükemmel bir fikir verebilir iken, taksonomik sınıflandırmaların ilgili kontroller ile birlikte ve sıralama uygun bir derinlik bütününü yakalamak için elde edildiğini yapılabilir göstermiştir kritik olduğunu 51 mevcut nüfus. herhangi bir hesaplama analizi ile, benzer bir hedefe ulaşmak için birçok yollar vardır. Bu çalışmada kullanılan metodlar silaj mikrobiyomları üzerinde analizler bir dizi elde etmek için bir araya getirildi uygun ve basit yöntemler, örnekleridir. Çeşitli ve biyoinformatik araçları ve teknikleri giderek artan sayıda örneği Phylosift 8 ve MetaPhlAn2 52 için, metagenomic verileri analiz etmek için kullanılabilir ve bu numunenin kendi alaka soruşturma ve analiz req öncesinde değerlendirilmelidir53 edinilmiş. Metagenomic analiz yöntemleri sınıflandırma, sıralama derinliği ve sıralama kalitesi için kullanılabilir için veritabanları ile sınırlıdır. Burada gösterilen biyoinformatik işleme yerel, yüksek enerjili makinede yapıldı; Ancak bulut tabanlı sistemler de mevcuttur. Bu bulut tabanlı hizmetler, uygun bir güçlü yerel iş istasyonunda yüksek maliyetli yatırımı kalmadan gerekli hesaplama gücü kiralama için izin verir. Bu yöntemin bir potansiyel uygulama bu nedenle gıda zincirine girmesini engel hiçbir zararlı bakteri mevcut olduğundan emin olmak için tarımda kullanılmadan önce silaj değerlendirmek olacaktır.

Metagenomiks DNA&#39;nın doğrudan analizi çevre örnekleri 1 içinde bulunan biyolojik toplulukların saflaştırılmış ve ilk sediment 2&#39;de bulunan Kültüre edilemeyen bakteri tespit etmek için kullanılır idi. Metagenomiks yaygın olarak, insan mikrobiyomu 3 belirleme okyanus 4 içinde ve hatta kahve makineleri 5 üzerinde geliştirmek bakteri topluluklarının analizi için mikrobiyal nüfusu sınıflandırılması gibi uygulamalar, bir dizi için kullanılır olmuştur. Yeni nesil dizileme teknolojileri tanıtılması büyük sıralama hacmi ve çıkış sonuçlandı. Sonuç olarak, DNA dizilemesi, 6 daha ekonomik hale gelmiştir ve gerçekleştirilebilir sekanslama derinliği büyük ölçüde güçlü bir analitik araç haline metagenomics sağlayan artmıştır. Metagenomic sıralama pratik, moleküler açıdan &quot;Front-end&quot; geliştirmeleri in büyümesini tahrik vartaksonomik sınıflandırma 7-9, fonksiyonel açıklama 10,11 ve DNA sekans verileri görsel temsilini 12,13 kullanılabilir siliko biyoinformatik araçları. Mevcut sayısının artması, kaçınılmaz sıralı genomları 15 bir &quot;arka uç&quot; referans veritabanı karşı gerçekleştirilen mikrobiyal topluluklar, sınıflandırılmasında daha hassasiyet sağlayan prokaryotik ve ökaryotik 14 genomları sıralı. Iki temel yaklaşım metagenomic analiz için kabul edilebilir. Daha geleneksel bir yöntem, bakteriyel genom bölgesini kodlayan 16S rRNA geninin analizidir. 16S rRNA yüksek prokaryot türler arasında korunmuş ancak dokuz hiper-değişken bölgeleri sergiler (V1 - V9) türleri tanımlama 16 için istismar edilebilir. uzun dizileme giriş (≤ 300 bp eşleştirilmiş sonu), özellikle de iki hiper değişken bölgeleri kapsayan DNA sekanslarının analizi için izinV3 - V4 bölgesi 17. Böyle Oxford Nanopore 18 ve PacBIO 19 gibi diğer sıralama teknolojileri, ilerlemeler tüm 16S rRNA gen bitişik sıralı izin yoktur. 16S rDNA göre kütüphaneleri türlerin belirlenmesi için hedeflenen bir yaklaşım sağlar ve doğal saflaştınlmış numuneler içinde meydana düşük kopya sayısı DNA algılanmasını sağlamak da, av tüfeği sıralama kütüphaneleri ya da 16S çoğaltılabilir olmayan DNA bölgeleri içerebilir türlerinin tespiti için izin rRNA işaretleyici astar dizileri kullanılan, ya da şablon dizisi ve yükseltme primer dizisinin arasındaki farklar 20,21 çok büyük çünkü. DNA polimerazlar, DNA replikasyon yüksek aslına olmasına rağmen başka, taban hataları yine PCR amplifikasyonu sırasında oluşabilir ve bu dahil hataları türler 22 menşeli hatalı sınıflandırma ile sonuçlanabilir. Şablon SEQ PCR amplifikasyonu ayrımcıDİZİLERİ da oluşabilir; Kullanılan nihai amplikon, havuzda gibi timin glikol gibi 23 ve benzer şekilde, doğal olmayan baz modifikasyonları temsil altında yüksek bir GC içeriğine sahip DNA dizileri, DNA polimeraz 24 dizileri DNA&#39;nın çoğaltılmasında hatalarına neden durdurmak için olabilir. Buna karşılık, bir av tüfeği sıralama DNA kütüphanesi bir numune çıkarılır ve daha sonra önceden sekanslama için hazırlık için daha kısa DNA zinciri uzunluklarda parçalanmış olan saflaştırılmış DNA tümü kullanılarak hazırlanmıştır bir DNA kütüphanesidir. Finansal maliyet güvenilir bir dizi derinliği amplikon sekanslama 26 daha büyüktür ulaşmak için gerekli olsa da tüfek dizilemesi ile oluşturulan DNA dizilerinin taksonomik sınıflandırma, 16S rRNA dizilemesi amplikon 25 daha doğru karşılaştırılır. av tüfeği sıralama Metagenomiks büyük yararı olmuştur kez numune çeşitli genomlar sıralı bölgeleri gen zenginleştirilmesi için kullanılabilir olmasıdırtaksonomik 27 sınıflandırılmıştır. Metagenomic dizi verileri biyoinformatik araçlar giderek artan aralığı ile analiz edilir. Bu araçlar, örneğin, uygulamalar geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için edebiliyoruz, eşleştirilmiş ucunun üst üste ham dizi verilerinin 28 kalite kontrol analizleri, dizinin de novo montaj komşularla ve iskeleler 30,31, taksonomik sınıflandırma ve görselleştirme okur 29 okur dizisi okur ve dizileri 7,12,32,33 ve monte dizilerin 34,35 fonksiyonel ek açıklama toplandı evi. Mısır gibi fermente tahıllar (Zea mays) dan dünya çapında çiftçiler tarafından üretilen silaj, ağırlıklı olarak büyükbaş hayvan yemi olarak kullanılır. Silaj bakteri Lactobacillus sp ile işlenir. fermantasyon 36 yardım ancak bugüne kadar, silaj bulunan diğer mikrobiyal populasyonların sınırlı bilgi var etmek. Fermentn süreci silaj 37 içinde yaygın hale istenmeyen ve zararlı mikro-organizmaların yol açabilir. Maya ve küf ek olarak, bakteri silaj fermente anaerobik ortam yapılarına uyarlanabilir ve daha sık çiftlik hayvanlarında hastalıkların yerine silaj 38 bozulması ile ilişkilidir. Silaj siloları doldurma ve böylece silaj 39 pH artan bütirik asit, laktik asit, anaerobik sindirim ürünü dönüştürmek mümkün olduğunda yanlışlıkla topraktan eklenebilir bütirik asit bakterileri kalır. PH bu artış normal, optimum silaj fermantasyon koşulları 38 altında büyümeyi sürdürmek mümkün olacağını bozucu bakterilerin bir yükselişe yol açabilir. Clostridium spp. Listeria spp. ve Bacillus spp. Gastr hayatta bakteri sporlarına olarak, özellikle süt sığırı yemi silajında, özel bir önem taşıyorointestinal yolu 40 hayvan ve insan ölümlerine 37,39,41-44 için, nadir durumlarda, gıda zinciri girmek gıda bozulmaları yol ve olabilir. o silaj bozulma nedeniyle veteriner tedavisi ve hayvancılık kaybının tam ekonomik etkilerini tahmin etmek zor Dahası, bir salgın meydana gelmesi ise bir çiftlik zararlı olması muhtemeldir. Metagenomic yaklaşım kullanarak biz olmak iyileştirici önlemler sağlayan, silaj örneklerinde mevcut mikrobiyal nüfusu sınıflandırmak ve ayrıca da, potansiyel olarak hayvancılık üzerinde zararlı bir etkisi olurdu silaj bozulma ile ilişkili mikrobiyal topluluklar belirleyebilir varsayılmaktadır silaj önce alınan bir besin kaynağı olarak kullanılmak üzere.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit for Soil</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>DNA Extraction</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>DNA Purification</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 and 401425</td><td>DNA Quantification</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - provided by a sequencing service</td></tr><tr><td>High Power Analysis Workstation</td><td>Various</td><td></td><td>Local or cloud based, user preferred system</td></tr></tbody></table>

metagenomic analysis of silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Biyoinformatik işleme önce, çiğ dizisi kesilmiş edildi okur ve adaptörler Trimmomatic yazılımı 28 kullanılarak uzaklaştırıldı. Kesme ve süzme aşamasından sonra, sırayla% 50 düşürülmüştür okuma sayısı (Tablo 1) okur. Ortalama taban phred puanı (Şekil 2) kalite kontrolden geçtikten sonra&gt; 30 idi. Örtüşen bölgelerde tek uzun okur oluşturmak için FLASH yazılımı 29 kullanılarak birleştirildi vardı DNA dizilerinin çiftleri, örtüşmeyen ayrı bir dosyada tutuldu okur. 45.47% başarılı bir şekilde birleştirilebileceğini (105.343) okur. Üst üste binmesini takiben ortaya çıkan genişletilmiş fragmanlar Kraken yazılımını 7 kullanarak bakteriyel taksonomik sınıflandırma yapıldı ve daha sonra Kronu yazılımı (Şekil 3) ile görüntülendi, okur FLASH kullanarak okur. <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; silaj metagenome mevcut bakteri türlerinin çoğunluğu 4 prokaryotik filumlar içinde bulunan: Firmicutes (% 34), Actinobacteria&#39;lar (% 28), proteobakteride (% 27) ve Bacteroidetes (% 7) . Bu filumlar içinde mevcut sınıflarının dağılımı Şekil 4&#39;te görülebilir. Metagenome en bol türler Lactobacillus spp. (% 24; Firmicutes), Corynebacterium spp. (% 8, Actinobacteria&#39;lar) Propionibakteri türleri. (% 3; Actinobacteria&#39;lar) ve Prevotella spp. (% 3; Bacteroidetes). hastalığa yol açan hayvan sağlığı için önemli ve türleri de gözlenmiştir; Clostridium spp. (% 1), Bacillus spp. (% 0.6), Listeria spp. (% 0.2) silaj numunede mevcut olduğu tahmin edildi. Fonksiyonel açıklama okur monte gerçekleştirildi. Metagenome kesilmiş ve filtre kullanarak Maça assembler 30 kullanılarak toplandıpaired-end ve eşleştirilmemiş 92284 iskele üreten okur. selülaz tanımlamak için, proteinler MG-RAST kullanılarak tahmin ve enzim karbonhidrat-aktif veritabanı (cazy) kullanılarak açıklamalı bulundu. 97.562 tahmin edilen protein arasında, 6357 cazy veritabanı (Şekil 5) oluşturan beş enzim sınıflarından birinde varsayımsal karbohidrat aktif enzim olarak bilgi notları eklendi. Sonuçlar birden fazla cazy enzim sınıfı ek açıklama içeren olanlar da dahil, protein ek açıklamalar dağılımını gösteren InteractiVenn yazılımını 50 kullanarak bir Venn diyagramı olarak görüntülendi. Bunlardan, 3861 glikozit hidrolaz aktivitesi için tahmin edilen ve daha fazla işlevi onaylamak için laboratuarda karakterize edilecektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg" /> Şekil 1: Silaj Analizi için Biyoinformatik Metagenomiks Boru Hattı. Iki temel yaklaşım vardısilaj, taksonomik sınıflandırma ve fonksiyonel ek açıklama mikrobiyomları araştırmak için kullanılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg" /> Şekil 2: Önce tabanı Başına ve Kırpma ve Adaptör Temizleme sonra Dizisi kalitesi. FASTQC dan başına tabanı dizisi kalitesi arsa dizisinin uzunluğu boyunca ortalama phred skor öncesi ve sonrası kalite kontrol okur gösterir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg" /> Şekil 3: Taksonomik sınıflaKatı Silaj bakteriyel mikrobiyomu bir yon. FLASH Kraken 7 kullanılarak gerçekleştirildi ve daha sonra kronu ile görüntülendi gelen kesilmiş ve üst üste dizinin sınıflandırılması okur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg" /> Şekil 4: Katı Silaj bakteriyel mikrobiyomu 4 En Bol şubelerinin taksonomik Sınıf Dağılımı. Dört en bol filum içinde bakteri her sınıfın yüzdesi. Firmicutes: Clostridia (kırmızı) ve Basiller (koyu mavi); Proteobacteria: delta / epsilon (pembe), alfa (mavi soluk), gama (turuncu) ve beta (turkuaz); Bacteroidetes: Flavobacteriia (koyu mavi) ve Bacteroidia(soluk yeşil); Actinobacteria&#39;lar: Coriobacteriia (koyu mor) ve diğer Actinobacteria&#39;lar (koyu yeşil). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg" /> Şekil 5: Katı Silaj mikrobiyomu içinde Öngörülen Proteome cazy Açıklaması. Katı silaj mikrobiyomları tahmin proteom cazy açıklamalarla beş enzim sınıflarının dağılımını gösteren Venn şeması. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Ham okur </td><td rowspan="2"> # Filtreli okur (eşli) </td&gt; <td> # Filtreli okur </td><td rowspan="2"> # Okur parladı </td></tr><tr><td> (Eşli) </td><td> (Çoklu) </td></tr><tr><td> 2.374.949 x2 </td><td> 231.679 x2 </td><td> 1.892.534 </td><td> 105.343 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Dizileme Özeti Tablosu okur.

Watch this Scientific Journal Video about Metagenomic Analysis of Silage at JoVE.com

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Yemlerin metagenomic Analizi

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Microbiology

Genetics

Unit

Microbial Diversity

SCIENTISTS IN ACTION

18.2K Görüntüleme.  University of Exeter. Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Video: Metagenomic Analysis of Silage

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Çevre

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Genetik

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Nanopore DNA sıralama Metagenomic toprak analizleri için

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil and gas. This process revolutionized the U.S. energy industry, as it gives access to resources that were previously unobtainable and now produces two-thirds of the total natural gas in the United States. Although fracking has had a positive impact on the U.S. economy, several studies have highlighted its detrimental environmental effects. Of particular concern is the effect of fracking on headwater streams, which are especially important due to their disproportionately large impact on the health of the entire watershed. The bacteria within those streams can be used as indicators of stream health, as the bacteria present and their abundance in a disturbed stream would be expected to differ from those in an otherwise comparable but undisturbed stream. Therefore, this protocol aims to use the bacterial community to determine if streams have been impacted by fracking. To this end, sediment, and water samples, from streams near fracking (potentially impacted) and upstream or in a different watershed of fracking activity (unimpacted) must be collected. Those samples are then subjected to nucleic acid extraction, library preparation, and sequencing to investigate microbial community composition. Correlational analysis and machine learning models can subsequently be employed to identify which features are explanative of variation in the community, as well as identification of predictive biomarkers for fracking&#39;s impact. These methods can reveal a variety of differences in the microbial communities among headwater streams, based on the proximity to fracking, and serve as a foundation for future investigations on the environmental impact of fracking activities.

Here, we present a protocol to investigate the impacts of hydraulic fracturing on nearby streams by analyzing their water and sediment microbial communities.

Hidrolik Çatlatmanın Akışlar Üzerindeki Etkisini Mikrobiyal Moleküler İmzalar Kullanarak Değerlendirmek

Hydraulic fracturing (HF), commonly called &#34;fracking&#34;, uses a mixture of high-pressure water, sand, and chemicals to fracture rocks, releasing oil ...

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe and quantify the impacts of drought on grain and other agricultural products. The identified metabolites may allow for the identification of the biochemical response that allows the plant to tolerate stressful environments. The methodology presented herein allowed for the total metabolomic analysis of barley flour using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). 
Barley flour metabolite extracts were fractionated into four fractions based on polarity. To allow for analysis by GC/MS, metabolites were derivatized to increase volatility and metabolite separation: fatty acids esters were derivatized into fatty acid methyl esters; sugars were oximated into their straight chain form; and metabolites with hydroxyl groups were converted to their corresponding silyl ethers. The derivatized samples were injected into the GC/MS and the generated mass spectra were used for metabolite identification by comparing the generated spectra to the National Institute of Standards and Technology (NIST) Tandem Mass Spectra library. The method described here can also be used to examine the total metabolome for other plants, furthering our understanding of the biochemical responses of stressed plants.

A method for metabolomic analysis of barley is presented. The method entails fractionation and derivatization of metabolites and analysis thereof by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Metabolomic analysis can be used to determine the effect of intercropping and drought stress on the grain.

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biyoloji

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Saf olmayan Arındırıcı: Sıralama Metagenomes ve Metatranscriptomes Kompleksi Hayvan ilişkili Örneklerinden

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Kanatlı Üretim Örneklerden Bakteriyel Topluluklar Nitel ve Nicel Değerlendirme Karma DNA Ekstraksiyon Yöntemi

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Yemlerin metagenomic Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet