Name: evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells at JoVE.com

This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

Not: protokol şeması prosedürleri, bir zaman çizgisi de dahil olmak üzere, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. CVE 1. Hücre Kültürü ve Pasaj <ol><li> Tam büyüme ortamı içinde kültür CVE hücreleri (bEnd.3 hücreleri) (yüksek glukoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı, DMEM) T75 cm2&#39;lik doku kültür şişesi içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. % 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> Çıkarın ve hücre kültür ortamı atılır. % 0.25 tripsin-% 0.03 EDTA çözeltisi ile hücre tabakasını durulayın, ve daha sonra 1 ekleyin - şişeye Tripsin-EDTA solüsyonu 2 mL, 3 37 ° C &#39;de balon devam - 5 dak. Hücre tabakası ayrılmış kadar bir ters mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. tam büyüme ortamı 10 ml ekleyin ve hafifçe pipetleme hücreleri aspire. </li><li> 5 dakika, selüler artığın ayrılması için 700 x g&#39;de 15 ml santrifüj tüpüne ve spin içerisine sıvı ve hücre süzün. </li&gt; <li> santrifüj tüpten atın. tam büyüme ortamında 10 ml ekleyin ve hücre topağı yeniden askıya. 5 dakika boyunca 700 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> santrifüj tüpten atın. Yeniden askıya 2.0 x 10 5 hücre / ml bir konsantrasyonda tam büyüme ortamında hücre pelletini (hemasitometre kullanarak saymak suretiyle belirlendi, tripan-mavisi boyama ile ölü hücreleri hariç). Not: Taze çözülmüş hücreler deneyler için en az 3 geçişleri için alt kültürlenir. </li></ol> Hücre Kültürü Tabaklar 2. Tohum ve tedavi Hücreler <ol><li> 96 oyuklu bir hücre dışı akı hücre kültürü plakasının Tohum hücreleri: de 80 uL /. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücre kültürü plakası yerleştirin. Not: kuyu başına 16 × 10 3 hücreleri 60 ulaşacak - 24 saat içinde% 80 confluency. </li><li> hücreler, bir kimyasala maruz kaldığı takdirde, hücreler plaka tabanına takılmaktadırlar, sonra, tedaviler ekleyin (8-24 saat izleyenlereding). Not: Transfeksiyon deneyleri için, tam büyüme ortamında antibiyotik ilave değildir. </li></ol> Bioanalyzer kullanarak Mitokondriyal Fonksiyon 3. Değerlendirme <ol><li> Deneyin başlamasından önce, plakaya hücre dışı akı kalibrant çözeltisi 150 uL ilave edilmesi ve CO2 olmadan 37 ° C &#39;de O / N inkübe edilerek kalibratörü ile hücre dışı bir akış sensörü kartuşu hidrat. </li><li> plaka yıkayıcı istasyonunu kullanarak, pH 7.0 dışı akı deney ortamı içine hücre kültür ortamı değiştirin. 60 dakika - 30 CO 2 olmadan 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 8 mcM oligomycin, 4.5 uM FCCP, 10 uM rotenone ve DMEM 10 uM antimisin çalışma çözümleri hazırlayın. Yük 25 uL kartuş enjeksiyon portlarına stok çözümleri: Port A, oligomycin; Liman B, FCCP; Liman C, hücre dışı akı deney ortamı ile rotenone ve antimisin. Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi analiz protokolü uygulamak. </li><li> Bioanalyzer içine sulandırılmış kartuşu yükleyin ve &quot;Başlat&quot; düğmesine tıklayarak kalibrasyonu yapın. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, kartuş alt plaka kaldırmak ve &quot;Unload Kartuşu&quot; istemini tıklayarak hücre plaka yükleyin. Tüm ölçümlerin sonuna kadar tahlil devam edin. </li><li> veri dosyasını açın ve Bioanalyzer gelen oran değerlerini elde. Bir tablo dosyasına veri verir. </li></ol> 4. Veri Analizi NOT: Veri analizler için hesaplamalar aşağıda formüle edilmiştir. OCR Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi değerler Bioanalyzer alet elde edilir. <ol><li> Bazal değerden (ölçüm 3) - Bazal solunum hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçümleri 10) çıkarın. NOT: Bazal solunum = Bazal - olmayan mitokondriyal solunum = Oranı ③ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li><li> ATP verimlilik hesaplamak içinbazal değerden (ölçüm 3) - on ATP bağlı solunum (6 ölçümleri 4) çıkarın. NOT: ATP üretimi = Bazal - ATP bağlı solunum = Oranı ③ - Oranı ④ ~ ⑥. </li><li> Maksimum solunum dan (ölçümler 7-9) - Maksimum solunum hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçümleri 10) çıkarın. NOT: Maksimal solunum = Maksimum solunum - olmayan mitokondriyal solunum = Oranı ⑦ ~ ⑨ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li><li> Yedek kapasitesini hesaplamak için, maksimum solunum bazal değer (ölçüm 3) (- 9 ölçümler 7) çıkarın. NOT: Yedek kapasite = Maksimum solunum - Bazal = Oranı ⑦ ~ ⑨ - Oranı ③. </li><li> ATP bağlı solunum (ölçüm 4) den - Proton sızıntı hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçüm 10) çıkarın. NOT: Proton kaçak = ATP bağlı solunum - olmayan mitokondril solunum = Oranı ④ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol>
	<li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium.">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li><li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles.">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li><li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription.">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47 (2012).</li><li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Ca2+]i+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2+-induced+Ca2++release.">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li><li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension.">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).</li><li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase.">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li><li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier.">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li><li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke:+Mitochondrial+Mechanism.">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002 (2015).</li><li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction.">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li><li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke.">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li><li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress.">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li><li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells.">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li><li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c.">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity.">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li><li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier:+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat.">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li><li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle.">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li><li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells:+A+role+for+mitoBKCa+channels.">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li><li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy.">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350 (2015).</li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Bu protokol, serebral vasküler endotel hücrelerinde biyoenerjik fenotipinin değerlendirilmesi için bir yöntemi temsil eder. Bu endotel hücre mitokondriyal değerlendirme için temel bir tahlil olarak hizmet eder ve bu CVE hücrelerde mitokondriyal sinyal yolağı etkileyebilir uyaranlara mekanizmalarının incelenmesi amacıyla tasarlanan deneylerde için en uygunudur. Ayrıca, BBB bozulması ile ilişkili hastalıklar için potansiyel terapötik test etmek için bir yöntem sağlar. Protokol çerçevesinde kritik adımlar Hücre dışı akı bioanalyzers gerçek zamanlı olarak OCR ölçme yeteneğine sahiptir. Bu tahlilde, uygun hücre yoğunluğu tespit önemlidir. Hücre yoğunluğu oyuk başına 8 x 10 3 hücre altında ise, taban OCR (Şekil 2 ve Şekil 3) analiz edilecek olan çok düşük olduğu; Hücre yoğunluğu oyuk başına 32 x 10 3 hücre üzerinde ise, hücreler oligomycin ya FCCP işlemesi yanıt yokNTS (Şekil 2 ve Şekil 3). Bizim deneysel modelinde bu hücre hattı için en uygun hücre yoğunluğu 7 ve tedavileri 10,14 uyaranlara tekrarlanabilir sonuçlar ve hassasiyet gösteren kuyu başına 16 × 10 3 hücredir. 24 oyuklu Bioanalyzer kullanılırsa, hücre yoğunluğu, yeni titrasyonları tahlili için gerekli olacaktır. CVEs diğer endotel hücreleri ya da doku tipleri 15,16 ile karşılaştırıldığında mitokondri büyük bir hacme sahip olduğunu daha fazla enerji üretimi ve biyoenerjetik metabolizmayı ölçmek için daha az hücre ihtiyacını öne belgelenmiştir. Biz primer beyin endotel hücreleri çeşitli test ve fare serebrovasküler endotel hücrelerini 7 ölümsüzleştirdi ve insan serebrovasküler endotel hücrelerini (yayınlanmamış veri) ölümsüzleştirilmiş var. 160 pmol / dak - Bu hücreler 40 içinde olarak kabul edilebilir bir OCR (bazal solunum OCR ulaşmak için benzer bir hücre yoğunlukları gerekli96 oyuklu plakalar, ve 50-24 oyuklu plakalar 400 pmol / dakika) biyoenerji deney yapıldı. Kaczara ve ark., Daha yüksek bir hücre yoğunluğuna 17 kullanılan insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC), içinde bioenergetic metabolizma ölçüm bildirmiştir. Grubumuz, diğer doku veya organlardan damar hücrelerini değerlendirmek vermedi. Teorik olarak, Bioanalyzer potansiyel olarak herhangi bir hücre tipi kullanılabilir ancak, hücre yoğunluğu, hücre kültür ortamı ve kültür koşulları (bazı özel hücrelerin de büyüme plakaları kaplanmış gerektirebilir) için tahlil optimize etmeyi gerektirir. Deneyler OCR oranını kabul edilebilir aralık içinde olduğundan emin olmak için tamamlanmış olması gereklidir. diğer organlarda endotel hücrelerinde OCR hücre yoğunluğu artan, beyinlerinden CVEs daha düşük ise, kabul edilebilir bir OCR aralığında almak için yardımcı olabilir. Hücreler enerji ana kaynağı olarak oksidatif fosforilasyon kullanmıyorsanız Alternatif olarak, Bioanalyzer bir optima olmazl deneyi. Bioanalyzer reaktifler uygulandığı sırasına göre, elektron taşıma zinciri sıralı bozulması için izin verir. İlk olarak, oligomycin mitokondriyal kompleks V (ATP sintaz) inhibe eden, uygulanır. İkinci olarak, FCCP, bir elektron uncoupler proton gradyanı bozulmasına yol açar, uygulanır. Son olarak, mitokondriyal Kompleksi I ve III inhibe rotenon ve antimisin, sırasıyla elektron akışının toplam inhibisyonuna yol uygulanır. ilaca maruz kalma sırası ilaçların spesifik elektron taşıma zincir reaksiyonu engellemek için gereklidir ve ardışık değişiklikler mitokondriyal fonksiyon yansıtacak şekilde ölçülebilir. Değişiklikler ve Sorun Giderme CVE hücrelerinde uyaranlara mitokondriyal yanıtı değerlendirmek için, hücrelerin hücre kültürü plakası altına yapıştırılır sonra uyaranlar (zaman çizelgesi bkz hücrelere uygulanır tavsiye edilirŞekil 1 &#39;de gösterilen; Genellikle) en az 6 saat sürer. tedaviler ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, tutarlı hücre yoğunluğunu tutmak için son derece önemlidir. ön işlemler hücre tohumlama önce tasarlanmış, her ön-tedavisi için hücre yoğunluğu dikkatle tohumlama için ölü hücreleri hariç, ölçülmelidir. transfeksiyon deney tasarımı dahil edilirse, üreticinin transfeksiyon protokolü bakın. Şekil 4&#39;de sunulan veriler göstermiştir miR-34A miR-34a aşırı ekspresyonu ile metabolik fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek için antibiyotik içermeyen hücre kültür ortamı ve Mito-stres testi gerektiren bir lipofektamin transfeksiyon kiti kullanılarak CVE hücrelerine transfekte edilmiştir . Daha önce 13 yayınlanan plazmid dozları da, optimize edilebilir. protokole yapılabilir bir diğer değişiklik reaktifler konsantrasyonları değişiyor. oligomycin, FCCP ve / veya rotenone ve antimisin bir titrasyon eğrisi komple olabilirTed. Yüksek performans için kullanılan bu deney, çeşitli ilaçların analiz Buna ek olarak, hücre canlılığı ve önceki yayınlarda 7,13 tanımlanmıştır hücre çoğalmasını ölçmek için bir paralel tahlil içerir önerilmektedir. OCR değerleri anlamlı hücre sayısı (Şekil 2 ve 3) etkilenen ve hücre çoğalması ve canlılığı deneyleri veri normalleşme fayda vardır. Ancak, bu testlerin tamamlanması her laboratuvar takdirine kalmıştır. Tekniğin Sınırlamalar Bu protokolün en önemli kısıtlılığı, biz sadece çalışmada in vitro hücre kültürü modeli kullanılmış olmasıdır. Şu anda, endotel hücre mitokondrial fonksiyon hitap edebilir hiçbir kullanılabilir ex vivo modeller ya da hayvan modelleri vardır. Yeni modeller in vivo biyoenerjetik fonksiyonunun değerlendirilmesi için geliştirilmiş olması bekleniyor ve <em&gt; ex vivo gelecekteki çalışmalarda. Başka bir sınırlama biyoenerjetiğin tedbirler aşağıdaki bariyer değerlendirmelerinin uzantısıdır. İlk olarak, biyoenerjitik ölçümler tamamlandıktan sonra, hücre canlılığı, elektron taşıma zincirinin tam parçalanmadan sonra azalır, çünkü deneyler gerçekleştirilemez; İkinci, özel hücre kültürü plakaları ve ekler biyoenerjetik değerlerini tespit etmek için gerekli olan ve bariyer değerlendirmeler için ekler uymaz. Bu nedenle, biyoenerji tahlil sonra tamamlanabilir pek çok işlevsel tahliller değildir. Bununla birlikte, özel cihazlar biyoenerji deneyi öncesinde fonksiyonel tahliller yapmak için geliştirilebilir beklenmektedir. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için önceki teknikler hücrelerden 18 den mitokondri izolasyonu gerektirmiştir. bu neBioanalyzer kullanılarak W tekniği izole mitokondri değerlendirilmesi daha selüler ortamın fazla muhafaza sağlam hücrelerde mitokondriyal aktivite ölçümü sağlar. Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Bu protokol, tasarlanmış ve bEnd.3 hücre hattı için geliştirilmiş, ancak aynı zamanda primer serebral vasküler endotelyal (pCVE) hücreleri 7 ya da endotel ile uyumlu olduğunu ve pCVE hücreleri 7 kullanarak önceki yayında bu göstermiştir edilir. endotel diğer türleri kullanıldığında, kültür plakasının kaplama ve büyüme faktörleri kullanımı gerekebilir. Bununla birlikte, titrasyon testi gibi diğer hücre tipleri için tavsiye edilir. Bu protokol, CVE hücre Biyoenerjetiğin değerlendirilmesinde kabul edilmesi genel bir yöntem sunmaktadır ve bu daha da mekanizma çalışmaları da bu şekilde tedavi yanıtları tatbik edilebilir.

Yaygın serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri tarafından oluşturulan kan-beyin bariyeri (KBB) vasküler biyoloji için her şeyden çok farklı ve benzersiz işlevlere sahiptir olduğu kabul edilmektedir. Bu endotel hücreleri, kimyasal enerji kaynağı olarak adenosin trifosfat hücre kaynağı (ATP) en oluşturmak için mitokondri kullanımı. CVE hücreleri için ATP sağlamanın yanı sıra, mitokondri 1-4 sinyal hücresel vasküler endotel hücreleri, çeşitli hücresel işlemleri, apoptoz 5 ve hücre döngüsü kontrol edilmesi ve hücre büyümesini 6. CVE hücrelerde mitokondriyal biyoenerjik fonksiyonunun bozulması düzenleyen bozulmuş vasküler endotel aktivitesine yol açan, mitokondriyal biogenezi etkiler ve serebrovasküler hastalıklar ve nörodejeneratif bozukluklar, örneğin, felç 7,8 ve Alzheimer hastalığı (AD) 9 şiddetlendirebilir. Bu CVE hücrelere hakaretler lipopolysac maruz kaldıktan sonra göstermiştirsakarit (LPS) CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu bozabilir ve inme 7 sonuçlarını kötüleştirebilir. Bütilhidrokuinon (TBHQ) CVE hücrelerinde 10 oksidatif fosforilasyon ile müdahale ederek inme mortaliteyi artırmaktadır. Bu nedenle, CVE hücreleri sadece pilot merkezi sinir sistemi için bir mekanizma ile ilgili bir dizi çalışma (CNS) hastalıkları biyoenerjik fonksiyonunun niceliksel model, aynı zamanda, vasküler biyoloji mitokondriyal fonksiyonu hedefleme terapötik ilaç taramasında bir buluş sağlar. İzole mitokondri biyoenerjitik fonksiyonu ölçmek için kullanılmıştır. Biz 7 ve diğerleri 11 ekstraselüler akı Bioanalyzer kullanarak sağlam CVE hücrelerinde hücresel Biyoenerjetiğin değerlendirmelerini bildirdi. analizör endojen hücresel biyoenerjetik değerlendirme avantajı sağlar. Bu, hassas ve tutarlı deney CVE hücrelerin mitokondrial metabolizmanın büyüklüğüne ve Şti bioenergetic bozukluğu değerlendirmek için kullanılabilirMuli, CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu etkileyen mitokondriyal sinyal yollarının mekanizmalarını ve ekran ilaçlar ya da tedaviler araştırmak. Bu protokolde, rotenone ve antimycin A. oligomycin, karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazonun (FCCP): Oksijen Tüketim Hızı (OCR) dört mitokondriyal bozucuların kullanımını birleştirerek bir farmakolojik profil yaklaşımı kullanılarak Bioanalyzer tarafından kaydedilir biz detay tek bir deneyde, ölçme ve bazal mitokondriyal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi dahil olmak üzere CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonel parametrelerin hesaplanması için izin veren bir optimize edilmiş bir yaklaşım.

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 passages</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>10% final concentration</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1&amp;times;100 stocking</td></tr><tr><td>0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1.0 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM final concentration</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>1.0 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0.5 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>1.0 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Plate wash station</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux bioanayzer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux cell culture plate</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux sensor cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux calibrant solution</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux assay medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH buffered prior to assay</td></tr></tbody></table>

evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells

Kan-beyin bariyer (KBB) bütünlüğü beyin hasarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri BBB oluşturan hücre tiplerinden biri olan; Bu hücreler optimum mitokondriyal fonksiyonunu gerektiren çok yüksek-enerji talebinin var. hastalık veya kaza durumunda, bu hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu hastalık veya BBB açılması ile sonuçlanır, değişmiş olabilir. Bu yazıda, bütün, sağlam hücreleri ve bir Bioanalyzer kullanarak CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için bir yöntem tanıtmak. Bir mito-stres tahlil ya fiziksel ya da kimyasal, bozulmuş olan hücreler meydan ve onların biyoenerjitik fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda mitokondriyal fonksiyon üzerinde doğrudan etkiye sahip yeni tedavi ajanlarının ekrana kullanışlı bir yol sağlar. Mitokondriyal para çeşitli hesaplanmasına imkan oksijen tüketim oranları elde etmek için gerekli olan hücre yoğunluğuna optimizeATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite de dahil olmak üzere metre. Ayrıca mıkroRNA, miR-34a giriş, mitokondriyal aktivite belirgin bir ve saptanabilir bir azalmaya sebep olduğunu göstererek tahlilin hassasiyetini göstermektedir. Bu çalışmada gösterilen veriler bEnd.3 hücre hattı için optimize edilmiş olsa da, biz de daha ileri preklinik ve klinik modellerde programı düşündüren, birincil CVE hücreleri için protokol optimize ettik.

Oksidatif strese yanıt olarak CVE hücrelerinin bioenergetic fonksiyonunu değerlendirmek için, biz primer beyin mikrovasküler endotel hücreleri 12 ile aynı karşılaştırmalı bariyer özellikleri gösteren fare beyin mikrovasküler endotelin hücre çizgisi bEnd.3 seçti. kinetik ve yanıtın nispi yoğunluk çeşitli hücre tipleri arasında farklılık olduğu göz önüne alındığında, deney birinci seriye ait metabolik profil deneyinde kullanılacak bEnd.3 hücrelerinin uygun tanımlanmasıyla ölçülebilir OCR seviyelerini elde etmek için dizayn edilmiştir, gösterilen değerlendirmenin ardından Şekil 2. veri miktarı ve Şekil 3&#39;te. Bazal solunum, maksimal solunum sunulan ve yedek solunum kapasitesi hücre yoğunluğu ile orantılı tepki gösterdi edilir. Bununla birlikte, ATP üretimi aşırı birleşik hücre kültürü olduğunu düşündüren oyuk başına 64 x 10 3 hücreleri seçildi düşerkenBu deney için uygun değildir. Mitokondriyal bozucuların yanıt göre oyuk başına 3 ila 10 x 32 hücreler, - Optimal hücre yoğunlukları 8 arasında gerçekleşir. Takip eden deneyler için, oyuk başına 16 x 10 3 hücre tohum yoğunluğu OCR değişikliklerin uygun tespiti için izin vermek için kullanılmıştır. Oyuk başına 16 x 10 3 hücreleri kullanılarak, OCR beklenen yanıtları gözlendi ve mikroRNA miR-34A CVE hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu (Şekil 4) azalttığını göstermiştir. Biz daha önce miR-34a bu hücrelerin 13 oksidatif fosforilasyon azalttığını bildirdi. Tekrarlanan deneyler de maksimal solunum ve yedek kapasite önemli ölçüde anlamlı bir değişiklik olsa bile bazal solunum, ATP üretimi ve proton sızıntısı olsa, 24 saat sonrası transfeksiyon de CVEs içinde miR-34a aşın azalarak olduğunu gösterdi (Şekil 4) . Bu veriler,CVEs mitokondriyal fonksiyon değişiklikleri tespit etmek için Bioanalyzer hassasiyetini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Hücre, plaka için. Denemeye zaman çizelgesi 1. Stratejik Planlama Şekil ve kartuş hazırlık gösterilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Şekil çeşitli hücre yoğunlukları olan CVE hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun 2. Örnek ham veriler. Oksijen tüketimi oranları farklı hücre yoğunlukları olan CVE hücrelerinde ölçüldü. Veriler ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı; FCCP: karbonil siyanit-4- (trifluorometoksi) fenilhidrazon;<html> Rot / Anti-A: rotenone ve antimycin A. ①, ② ve ③ bazal solunum gösterir; ④, ⑤ ve ⑥ ATP solunum bağlantılı olduğunu gösterir; ⑦, ⑧ ve ⑨ fazla solunum gösterir; ⑩, ⑪ ve ⑫ olmayan mitokondriyal solunum gösteriyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Çeşitli Hücre Yoğunlukları ile CVE Hücreleri Bioenerjetik Fonksiyon Şekil 3. Temsilcisi Sonuçlar. Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite Biyoenerjetiğin tarafından oluşturulan ham verilerden hesaplanan Şekil formülleri kullanarak 2 fonksiyonel tahlil Bölüm 4&#39;te belirtilen . Veri ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Şekil 4: miR-34a tarafından Azalmış Bioenerjetik Fonksiyonun Temsilcisi Sonuçlar (A) Mitokondriyal Fonksiyon Ham veri 24 saat sonrası transfeksiyon de miR-34a aşın şu.. (B) Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite Bioenerji Şekil 4A fonksiyonel tahlil tarafından oluşturulan ham verilerden hesaplanır; parametreleri miR-34a Bölüm 4 aşırı ifadesinin belirtilen formüller hesaplanmıştır 24 saat sonra, transfeksiyon olan CVE hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu azaltır. Veriler ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı. ****, P &lt;0.0001.dosyaları / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tablo 1. Enstrüman çalıştırın Protokolü.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells at JoVE.com

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Endotel hücre mitokondri, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü korumak açısından kritik önem taşımaktadır. Bu serebral vasküler endotel hücrelerinde bioenergetic fonksiyonu ölçmek için bir protokolü getirmektedir.

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

evaluation-bioenergetic-function-cerebral-vascular-endothelial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Görüntüleme.  West Virginia University.  Endotel hücre mitokondri, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü korumak açısından kritik önem taşımaktadır. Bu serebral vasküler endotel hücrelerinde bioenergetic fonksiyonu ölçmek için bir protokolü getirmektedir. 

Video: Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of cardiovascular disease. Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. Percent capillary recruitment is assessed by dividing the increase in capillary density induced by postocclusive reactive hyperemia (postocclusive reactive hyperemia capillary density minus baseline capillary density), by the maximal capillary density (observed during passive venous occlusion). Percent perfused capillaries represents the proportion of all capillaries present that are perfused (functionally active), and is calculated by dividing postocclusive reactive hyperemia capillary density by the maximal capillary density. Both percent capillary recruitment and percent perfused capillaries reflect the number of functional capillaries. The forearm blood flow (FBF) technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function: The ratio FBFmax/FBFbase is computed as an estimate of vasodilation, by dividing the mean of the four FBFmax values by the mean of the four FBFbase values. Forearm vascular resistance at maximal vasodilation (FVRmax) is calculated as the mean arterial pressure (MAP) divided by FBFmax. Both the capillaroscopy and forearm techniques are readily acceptable to patients and can be learned quickly.
The microvascular and endothelial function measures obtained using the methodologies described in this paper may have future utility in clinical patient cardiovascular risk-reduction strategies. As we have published reports demonstrating that microvascular and endothelial dysfunction are found in initial stages of hypertension including prehypertension, microvascular and endothelial function measures may eventually aid in early identification, risk-stratification and prevention of end-stage vascular pathology, with its potentially fatal consequences.

Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. The forearm blood flow technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function.

Mikrovasküler ve Endotel Fonksiyonu Noninvaziv Değerlendirilmesi

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

Tıp

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Nörobilim

Ultrasound Assessment of Endothelial-Dependent Flow-Mediated Vasodilation of the Brachial Artery in Clinical Research

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The endothelium acts as a barrier, preventing leukocyte adhesion and aggregation, as well as controlling permeability to plasma components. Functionally, the endothelium affects vessel tone.
Endothelial dysfunction is an imbalance between the chemical species which regulate vessel tone, thombroresistance, cellular proliferation and mitosis. It is the first step in atherosclerosis and is associated with coronary artery disease, peripheral artery disease, heart failure, hypertension, and hyperlipidemia.
The first demonstration of endothelial dysfunction involved direct infusion of acetylcholine and quantitative coronary angiography. Acetylcholine binds to muscarinic receptors on the endothelial cell surface, leading to an increase of intracellular calcium and increased nitric oxide (NO) production. In subjects with an intact endothelium, vasodilation was observed while subjects with endothelial damage experienced paradoxical vasoconstriction.
There exists a non-invasive, in vivo method for measuring endothelial function in peripheral arteries using high-resolution B-mode ultrasound. The endothelial function of peripheral arteries is closely related to coronary artery function. This technique measures the percent diameter change in the brachial artery during a period of reactive hyperemia following limb ischemia.
This technique, known as endothelium-dependent, flow-mediated vasodilation (FMD) has value in clinical research settings. However, a number of physiological and technical issues can affect the accuracy of the results and appropriate guidelines for the technique have been published. Despite the guidelines, FMD remains heavily operator dependent and presents a steep learning curve. This article presents a standardized method for measuring FMD in the brachial artery on the upper arm and offers suggestions to reduce intra-operator variability.

Endothelial dysfunction is associated with numerous disease states and is predictive of adverse cardiovascular events in humans. Flow-mediated vasodilation (FMD) is a non-invasive ultrasound method of evaluating endothelial function. Methodological choices and operator experience may affect results. A systematic approach to FMD in human studies is discussed here.

Klinik Araştırmalarda Brakial Arter Ultrason değerlendirilmesi Endotel Bağımlı Akış Dolayımlı Vazodilatasyon

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

Vasküler Fonksiyon ve Morfoloji Non-invaziv Değerlendirmelerine Bir Metodolojik Yaklaşım

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Biyoloji

Hücre Bariyeri Bütünlüğünü Değerlendirmek için Transendotelyal Direnç Ölçümü

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Yazar Spotlight: Hücre Bariyeri Bütünlüğünü Değerlendirmek için TEER Algılama Uygulamaları 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mikrovasküler ve Endotel Fonksiyonu Noninvaziv Değerlendirilmesi

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi

Klinik Araştırmalarda Brakial Arter Ultrason değerlendirilmesi Endotel Bağımlı Akış Dolayımlı Vazodilatasyon

Vasküler Fonksiyon ve Morfoloji Non-invaziv Değerlendirmelerine Bir Metodolojik Yaklaşım

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler