Name: evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
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This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

注：プロトコルのスキームは、手続きのタイムラインを含め、 図1に示されています。 CVE細胞の1文化とパッセージ<ol><li>完全増殖培地中で培養CVE細胞（のbEnd。3細胞）（高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地、DMEM）は、T75のcm 2の組織培養フラスコ中、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。 5％CO 2インキュベーター内で37℃で成長します。 </li><li>取り外して、細胞培養培地を廃棄します。 0.25％トリプシン、0.03％EDTA溶液で細胞層を洗浄し、次いで1加算 - フラスコにトリプシンEDTA溶液2mLを3 37℃でフラスコを保つ - 5分。細胞層が分離されるまで、倒立顕微鏡下で細胞を観察します。完全増殖培地の10 mLを加え、穏やかにピペッティングすることにより細胞を吸引します。 </li><li>細胞破片を除去するために、5分間、700×gで15 mLの遠心管とスピンに流体および細胞をデカントします。 </l私&gt; <li>遠心管からの上清を捨てます。完全増殖培地の10 mLを加え、細胞ペレットを再懸濁します。 5分間、700×gで細胞をスピン。 </li><li>遠心管からの上清を捨てます。再懸濁（血球計を用いて計数することによって決定さ、トリパンブルー染色によって死細胞を除外）2.0×10 5細胞/ mlの濃度で完全増殖培地中で細胞ペレットを。 注：たて解凍した細胞は、実験のために少なくとも3継代のためのサブ培養されます。 </li></ol>細胞培養プレート上の細胞を2シードとトリート<ol><li> 96ウェルの細胞外フラックス細胞培養プレート上の種子細胞：80μL/ウェル。 5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞培養プレートを置きます。注：ウェル当たり16×10 3細胞が60に到達します- 24時間以内に80％の密集度に。 </li><li>細胞が化学物質にさらされている場合は、細胞がプレートの底に付着された後、治療を追加（8から24時間後の参照します鼎）。 注：トランスフェクション実験のために、完全増殖培地に抗生物質を追加しないでください。 </li></ol>バイオアナライザを使用したミトコンドリア機能の3.評価<ol><li>アッセイの開始に先立ち、プレートに細胞外フラックス較正溶液150μLを添加し、CO 2なしで37℃でO / Nをインキュベートすることによって較正を有する細胞外フラックスセンサカートリッジを水和。 </li><li>プレート洗浄ステーションを使用して、pH7.0の細胞外フラックスアッセイ培地中に、細胞培養培地を変えます。 60分- 30のためのCO 2なしで37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 8μMのオリゴマイシン、4.5μMFCCP、10μMのロテノン、およびDMEM中で10μMのアンチマイシンAの作業溶液を調製します。カートリッジの注入口に原液の負荷25μL：ポートA、オリゴマイシン;ポートB、FCCP。ポートC、細胞外フラックスアッセイ培地とロテノンとアンチマイシンA。 表1に記載したように、アッセイプロトコルを実装。 </li><li>バイオアナライザに水和カートリッジをロードし、「スタート」ボタンをクリックしてキャリブレーションを行います。キャリブレーションが完了した後、カートリッジ底板を取り外し、「アンロードカートリッジ」プロンプトをクリックして、セルプレートをロードします。すべての測定が終了するまで試験を続けます。 </li><li>データファイルを開いて、バイオアナライザーからのレート値を取得します。スプレッドシートファイルにデータをエクスポートします。 </li></ol> 4.データ解析注：データ解析のための計算は、以下の処方されます。 OCRは、 図2に示すような値は、バイオアナライザー機器から得られます。 <ol><li>基底値から（測定3） - 基礎呼吸を計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12測定10）を引きます。 注：基礎呼吸=基礎 - 非ミトコンドリア呼吸=レート③ - レート⑩〜⑫。 </li><li> ATP productiを計算するには基底値から（測定3） -で、ATP-リンク呼吸（6測定4）を引きます。 注：ATP産生=基礎 - ATP結合型呼吸=レート③ - レート④〜⑥。 </li><li>最大呼吸から（測定7から9） - 最大呼吸を計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12測定10）を引きます。 注：最大呼吸=最大呼吸 - 非ミトコンドリア呼吸=レート⑦〜⑨ - レート⑩〜⑫。 </li><li> スペア容量を計算するには 、最大呼吸から基底値（測定3）（ - 9測定7）を引きます。 注：予備能力=最大呼吸 - 基礎=レート⑦〜⑨ - レート③。 </li><li> ATP-リンク呼吸（測定4）から- プロトンリークを計算するために、非ミトコンドリア呼吸（12計測10）を引きます。 注：プロトンリーク= ATP結合型呼吸 - 非ミトコンドリアリットルの呼吸=レート④ - レート⑩〜⑫。 </li></ol>

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The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

このプロトコルは、脳血管内皮細胞に生体エネルギーの表現型を評価するための方法を表しています。これは、内皮細胞ミトコンドリアの評価のための基本的なアッセイとして働き、それはCVE細胞におけるミトコンドリアシグナル伝達経路に影響を与えることができる刺激のメカニズムを研究するために設計された実験のために最適です。それはまた、BBB-破壊関連疾患のための潜在的治療薬を試験するための方法を提供します。 プロトコル内の重要なステップ細胞外フラックスbioanalyzersはリアルタイムにOCRを測定する能力を持っています。このアッセイでは、適切な細胞密度を特定することが重要です。細胞密度はウェル当たり8×10 3細胞未満であると、基底OCR（ 図2及び図3）分析されるには低すぎます。細胞密度はウェル当たり32×10 3個の細胞を超えている場合、細胞は、オリゴマイシンに応答又はFCCPの下水処理しませんNTS（ 図2及び図3）。我々の実験モデルでは、この細胞株に対する最適な細胞密度は7と治療法10,14を刺激するために複製可能な結果と感度を示しているだけでなく、あたり16×10 3細胞です。 24ウェルバイオアナライザーを使用する場合は、細胞密度の新しい滴定アッセイのために必要とされるであろう。 CVEは、他の内皮細胞または組織型15,16に比べて、ミトコンドリアの大容量を有することには大きなエネルギー生産と生体エネルギー代謝を測定するための少数の細胞の必要性を示唆し、文書化されています。当社は、プライマリとして脳内皮細胞のいくつかのタイプを、テストし、7マウス脳血管内皮細胞を不死化し、人間の脳血管内皮細胞（未発表データ）を不死化しています。 160ピコモル/分 - これらの細胞は、40内の許容可能なOCR（基礎呼吸OCRに到達するために同様の細胞密度を必要と96ウェルプレート、50 - 24ウェルプレート、400ピコモル/分）生体エネルギー分析を行いました。 Kaczara らは、より高い細胞密度17を使用したヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）において、生体エネルギー代謝を測定することを報告しました。 当社グループは、他の組織または器官からの血管細胞を評価しませんでした。理論的には、バイオアナライザーは、潜在的に任意の細胞型に使用することができるが、それは（いくつかの特定の細胞がよく成長するコーティングされたプレートを必要とするかもしれない）、細胞密度、細胞培養培地、および培養条件についてのアッセイの最適化が必要です。なお、実験は、OCRの速度が許容範囲内であることを確認するために完了していることが要求されます。他の臓器の内皮細胞におけるOCRは、細胞密度を増加させる、脳からのCVEよりも低い場合に許容可能なOCRの範囲内で取得することができます。細胞はエネルギーの彼らの主な情報源として酸化的リン酸化を使用していない場合あるいは、バイオアナライザーは最適解ではないでしょうLアッセイ。 バイオアナライザーは、試薬が適用される順序に基づいて、電子伝達鎖の連続的破壊を可能にします。まず、オリゴマイシンは、ミトコンドリア複合体V（ATP合成酵素）を阻害する、適用されます。第二に、FCCP、電子脱共役剤は、プロトン勾配の破壊につながる、適用されます。最後に、ミトコンドリア複合体IおよびIIIを阻害ロテノン及びアンチマイシンAは、それぞれ、電子流の合計阻害をもたらすために適用されます。薬物が特定の電子伝達連鎖反応を遮断、逐次変化はミトコンドリアの機能を反映するように測定することができるので、薬物曝露の順序は必須です。 修正およびトラブルシューティング CVE細胞における刺激に対するミトコンドリアの応答を評価するために、細胞を細胞培養プレートの底に付着させた後の刺激を細胞に適用されることをお勧めします（タイムラインを参照してください。図1に示されています。それは、通常、少なくとも6時間）を要します。処理により複製可能な結果を​​得るためには、一貫性のある細胞密度を維持するために極めて重要です。前処理は、細胞播種の前に設計されている場合、それぞれの前処理のための細胞密度は、慎重に播種するための死細胞を除外し、測定されるべきです。トランスフェクションは、実験計画に含まれている場合は、製造元のトランスフェクションプロトコールを参照してください。 図4に示されるデータで実証、のmiR-34Aは、miR-34aの過剰発現と代謝機能の変化を評価するために、抗生物質を含まない細胞培養培地およびミトストレステストを必要とリポフェクタミンのトランスフェクションキットを使用して、CVE細胞にトランスフェクトしました。プラスミドの用量はまた、以前に公表13のように、最適化することができます。プロトコルに対して行うことができるもう一つの変化は、試薬の濃度を変えています。オリゴマイシン、FCCP、および/またはロテノンとアンチマイシンAの滴定曲線はcompleすることができますテッド。 このアッセイは、ハイスループットの様々な薬剤の分析のために使用されている場合に加えて、我々の以前の刊行物7,13に記載された細胞生存率および細胞増殖を測定するための平行分析を含むことが示唆されています。 OCR値は有意に細胞数（ 図2及び3）の影響を受け、そして細胞増殖および生存率アッセイは、データの標準化の利益しています。しかし、これらのアッセイの完了は、個々の研究室の裁量です。 テクニックの制限事項このプロトコルの主な制限は、我々は唯一の研究ではin vitro細胞培養モデルを使用したことです。現在、内皮細胞のミトコンドリア機能に対処することができる利用可能なエクスビボモデルまたは動物モデルは存在しません。新しいモデルは、インビボで生体エネルギー機能の評価のために開発されることが期待されていると<eメートル&gt; ex vivoでの今後の研究インチ別の制限は、生体エネルギー対策以下のバリア性評価を拡張したものです。まず、生体エネルギーの測定が完了した後、細胞生存率は、電子伝達鎖の完全な破壊後減少する、ための実験を行うことができません。第二に、特定の細胞培養プレートおよびインサートは生体エネルギー値を検出するために必要なバリア性評価のための挿入に適合しません。したがって、生体エネルギーのアッセイ後に完了することができ、多くの機能アッセイは存在しません。しかしながら、特殊な装置が生体エネルギーアッセイの前に、機能的アッセイを行うために開発されることが期待されます。 既存の/代替方法に関して技術の意義ミトコンドリアの機能を評価するための従来の技術は、セル18からミトコンドリアの単離を必要としました。このNEバイオアナライザーを使用してワット技術は、単離されたミトコンドリアを評価するよりも細胞環境のより多くを保持する無傷の細胞におけるミトコンドリア活性の測定を可能にします。 このテクニックをマスターした後、将来のアプリケーションや行き方このプロトコルは、設計とのbEnd。3セルライン用に開発されたが、それはまた、主要な脳血管内皮（pCVE）セル7または他の内皮と互換性があり、我々はpCVEセル7を使用して、我々の以前の出版物でこれを実証しているされています。内皮細胞の他のタイプが使用される場合、培養プレートのコーティングおよび成長因子の使用が必要とされ得ます。ただし、滴定アッセイは、同様に他の細胞型のために推奨されます。このプロトコルは、CVE細胞の生体エネルギーの評価に採用される一般的な方法を提供し、それはさらに、このようにメカニズムの研究や治療応答に適用することができます。

広く、脳血管内皮（CVE）細胞によって形成され、血液脳関門（BBB）は、血管生物学の最も重要非常に異なるユニークな機能を有することが認識されます。これらの内皮細胞は、化学エネルギー源としてアデノシン三リン酸（ATP）の細胞供給の大部分を生成するために、ミトコンドリアを使用しています。 CVE細胞についてATPを提供することに加えて、ミトコンドリア1-4シグナリングセルラなどの血管内皮細胞における種々の細胞プロセス、アポトーシス5、および細胞周期の制御、細胞増殖6。CVE細胞におけるミトコンドリアの生体エネルギー機能の調節不全を調節します損なわれた血管内皮の活動につながる、ミトコンドリア生合成に影響を与え、脳血管疾患および神経変性疾患、 例えば 、脳卒中7,8およびアルツハイマー病（AD）9を悪化させる可能性があります 。私たちは、CVE細胞への傷害がlipopolysacへの暴露を、以下のことが実証されています糖類（LPS）は、ストロークが7成果CVE細胞中のミトコンドリア機能を損なうと悪化します。 t-ブチルヒドロキノン（TBHQ）はCVEセル10における酸化的リン酸化を妨害することによって、脳卒中死亡率を増加させます。したがって、CVE細胞だけでなく、パイロットの中枢神経系のメカニズムに関連した一連の研究（CNS）疾患における生体エネルギー機能の定量的なモデルは、だけでなく、血管生物学にミトコンドリアの機能を標的と治療薬の薬剤スクリーニングにおける画期的な製品を提供します。 単離されたミトコンドリアは、生体エネルギー関数を測定するために使用されてきました。私たちは7、その他11は、細胞外フラックスバイオアナライザーを使用して、無傷のCVE細胞における細胞生体エネルギーの評価を報告しています。アナライザは、内因性細胞生体エネルギー評価の利点を提供します。この感受性と一致するアッセイは、CVE細胞のミトコンドリア代謝を測定し、STIによって生体エネルギー障害を評価するために使用することができますMULIは、CVE細胞内のミトコンドリアの機能に影響を与えるミトコンドリアのシグナル伝達経路のメカニズム、および画面の薬や治療法を調査します。このプロトコルでは、ロテノン、及びアンチマイシンAのオリゴマイシン、カルボニルシアニド-4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）：酸素消費速度（OCRは）は、4つのミトコンドリア攪乱の使用を組み合わせることにより、薬理学的プロファイリングのアプローチを用いてバイオアナライザーによって記録されます我々は、詳細単一のアッセイで、測定および基底ミトコンドリア呼吸、ATP産生、プロトンリーク、最大呼吸、および予備呼吸容量を含むCVE細胞におけるミトコンドリア機能パラメータの計算を可能に最適化されたアプローチを。

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 passages</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>10% final concentration</td></tr><tr><td>Penicillin/Steptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>1&amp;times;100 stocking</td></tr><tr><td>0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1.0 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM final concentration</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>1.0 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0.5 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>1.0 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 &amp;micro;M final concentration</td></tr><tr><td>Plate wash station</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux bioanayzer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux cell culture plate</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux sensor cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux calibrant solution</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux assay medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH buffered prior to assay</td></tr></tbody></table>

evaluation of bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells

血液脳関門（BBB）の完全性は、脳損傷を防ぐために重要です。脳血管内皮（CVE）細胞がBBBを構成する細胞の種類の一つです。これらの細胞は、最適なミトコンドリア機能を必要とする非常に高いエネルギー需要を有します。疾患または損傷の場合には、これらの細胞におけるミトコンドリア機能は、疾患またはBBBの開口部に生じる、変更することができます。本稿では、我々は全体の、無傷の細胞およびバイオアナライザーを使用して、CVE細胞内のミトコンドリア機能を測定する方法をご紹介します。ミトストレスアッセイは、物理的または化学的に、摂動された細胞をチャレンジし、それらの生体エネルギー機能を評価するために使用されます。さらに、この方法はまた、ミトコンドリア機能に直接影響を持っている新しい治療薬をスクリーニングする便利な方法を提供します。我々は、ミトコンドリアパラ様々な計算を可能にする酸素消費速度を得るために必要な細胞密度を最適化しましたATP産生、最大呼吸、および余力を含めメートル、。また、マイクロRNA、のmiR-34aの導入は、ミトコンドリア活性の顕著なおよび検出可能な減少をもたらすことを実証することによって、アッセイの感度を示しています。本論文で示したデータはのbEnd。3細胞株のために最適化されているが、我々はまた、前臨床および臨床モデルでの有用性を示唆し、一次CVE細胞のためのプロトコルを最適化しました。

酸化ストレスに応答して、CVE細胞の生体エネルギー機能を評価するために、我々は、原発性脳腫瘍の微小血管内皮細胞12と同じ比較バリア特性が表示され、マウスの脳微小血管内皮細胞株のbEnd。3を選択しました。応答の動態および相対強度は、種々の細胞型の間で変化させることは、最初の一連の実験を示す、代謝プロファイリングするためのアッセイで使用するのbEnd。3細胞の最適な数を特定することによって測定OCRレベルを得るように設計された、指定されました評価に続いて、図2は 、データを図3に定量化し、提示されている。基礎呼吸、最大呼吸、および予備の呼吸容量は細胞密度と比例応答を示しました。しかし、ATP産生が過剰コンフルエント細胞培養があることを示唆し、ウェル当たり64×10 3細胞を選択したときに減少しましたこの実験には適していません。ミトコンドリア攪乱に対する応答に基づいて、ウェル当たり32×10 3細胞、 -最適な細胞密度は8の間に発生します。 その後の実験のために、ウェル当たり16×10 3細胞の播種密度は、OCRの変化の最適な検出を可能にするために使用されました。ウェル当たり16×10 3細胞を使用して、我々は、OCRで予想される応答を観察し、マイクロRNAのmiR-34aはCVE細胞（ 図4）にミトコンドリアの機能を低下させることを実証しました。我々は以前のmiR-34aが、これらのセル13において酸化的リン酸化を減少させたことを報告しています。繰り返し実験はまた、最大の呼吸や予備容量を大幅に有意な変化を持っていなくても、基礎呼吸、ATP産生、およびプロトンリークかかわらず、トランスフェクションの24時間後でのCVEにおけるmiR-34aの過剰発現により減少したことを示した（ 図4） 。これらのデータCVEにおけるミトコンドリア機能の変化を検出するバイオアナライザーの感度を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> 実験図1.戦略計画。セル、プレート、およびカートリッジの準備のためのタイムラインは示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> 種々の細胞密度でCVE細胞における図形生体エネルギー関数の2代表的な生データを酸素消費速度は、異なる細胞密度でCVE細胞で測定しました。データは、平均±SDを表す（N = 5）。 OCR：酸素消費速度; FCCP：シアン化カルボニル-4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン;<html>腐/アンチA：ロテノンとアンチマイシンAに①、②、③と基礎呼吸を示しています。 ④、⑤、⑥とATPが呼吸をリンクされている示しています。 ⑦、⑧、および⑨最大呼吸を示しています。 ⑩、⑪、および⑫非ミトコンドリア呼吸を示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> 様々な細胞密度を持つCVE細胞における生体エネルギー機能図3.代表的な結果。基礎呼吸、ATP産生、最大の呼吸、及び予備容量が第4節に示されている式を用いて、図2に生体エネルギー機能アッセイによって生成された生データから計算されています。データは平均±SD（n = 5）を表します。 OCR：酸素消費速度。<html> F = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> 図4：のmiR-34aの減少生体エネルギー機能の代表的な結果 （A）の24時間後、トランスフェクションでのmiR-34aの過剰発現は、以下のミトコンドリア機能の生データ。 （B）基礎呼吸、ATP生産、最大呼吸、及び空き容量を図4Aの生体エネルギー機能アッセイによって生成された生データから計算されます。パラメータは、のmiR-34aの第4節過剰発現に示した式で計算される24時間トランスフェクション後にCVE細胞でミトコンドリアの機能を低下させます。データは、平均±SDを表す（N = 5）。 OCR：酸素消費速度。 ****、P &lt;0.0001。ファイル/ ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> 表1.インストゥルメントを実行しますプロトコル。

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Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

内皮細胞のミトコンドリアは、血液脳関門の完全性を維持するために重要です。私たちは、脳血管内皮細胞に生体エネルギー機能を測定するためのプロトコルを紹介します。

脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K ビュー.  West Virginia University. 内皮細胞のミトコンドリアは、血液脳関門の完全性を維持するために重要です。私たちは、脳血管内皮細胞に生体エネルギー機能を測定するためのプロトコルを紹介します。 

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Non-invasive Assessment of Microvascular and Endothelial Function

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of cardiovascular disease. Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. Percent capillary recruitment is assessed by dividing the increase in capillary density induced by postocclusive reactive hyperemia (postocclusive reactive hyperemia capillary density minus baseline capillary density), by the maximal capillary density (observed during passive venous occlusion). Percent perfused capillaries represents the proportion of all capillaries present that are perfused (functionally active), and is calculated by dividing postocclusive reactive hyperemia capillary density by the maximal capillary density. Both percent capillary recruitment and percent perfused capillaries reflect the number of functional capillaries. The forearm blood flow (FBF) technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function: The ratio FBFmax/FBFbase is computed as an estimate of vasodilation, by dividing the mean of the four FBFmax values by the mean of the four FBFbase values. Forearm vascular resistance at maximal vasodilation (FVRmax) is calculated as the mean arterial pressure (MAP) divided by FBFmax. Both the capillaroscopy and forearm techniques are readily acceptable to patients and can be learned quickly.
The microvascular and endothelial function measures obtained using the methodologies described in this paper may have future utility in clinical patient cardiovascular risk-reduction strategies. As we have published reports demonstrating that microvascular and endothelial dysfunction are found in initial stages of hypertension including prehypertension, microvascular and endothelial function measures may eventually aid in early identification, risk-stratification and prevention of end-stage vascular pathology, with its potentially fatal consequences.

Capillaroscopy is a non-invasive, relatively inexpensive methodology for directly visualizing the microcirculation. The forearm blood flow technique provides accepted non-invasive measures of endothelial function.

微小血管と内皮機能の非侵襲的評価

The authors have utilized capillaroscopy and forearm blood flow techniques to investigate the role of microvascular dysfunction in pathogenesis of ...

医学

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

神経科学

Ultrasound Assessment of Endothelial-Dependent Flow-Mediated Vasodilation of the Brachial Artery in Clinical Research

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The endothelium acts as a barrier, preventing leukocyte adhesion and aggregation, as well as controlling permeability to plasma components. Functionally, the endothelium affects vessel tone.
Endothelial dysfunction is an imbalance between the chemical species which regulate vessel tone, thombroresistance, cellular proliferation and mitosis. It is the first step in atherosclerosis and is associated with coronary artery disease, peripheral artery disease, heart failure, hypertension, and hyperlipidemia.
The first demonstration of endothelial dysfunction involved direct infusion of acetylcholine and quantitative coronary angiography. Acetylcholine binds to muscarinic receptors on the endothelial cell surface, leading to an increase of intracellular calcium and increased nitric oxide (NO) production. In subjects with an intact endothelium, vasodilation was observed while subjects with endothelial damage experienced paradoxical vasoconstriction.
There exists a non-invasive, in vivo method for measuring endothelial function in peripheral arteries using high-resolution B-mode ultrasound. The endothelial function of peripheral arteries is closely related to coronary artery function. This technique measures the percent diameter change in the brachial artery during a period of reactive hyperemia following limb ischemia.
This technique, known as endothelium-dependent, flow-mediated vasodilation (FMD) has value in clinical research settings. However, a number of physiological and technical issues can affect the accuracy of the results and appropriate guidelines for the technique have been published. Despite the guidelines, FMD remains heavily operator dependent and presents a steep learning curve. This article presents a standardized method for measuring FMD in the brachial artery on the upper arm and offers suggestions to reduce intra-operator variability.

Endothelial dysfunction is associated with numerous disease states and is predictive of adverse cardiovascular events in humans. Flow-mediated vasodilation (FMD) is a non-invasive ultrasound method of evaluating endothelial function. Methodological choices and operator experience may affect results. A systematic approach to FMD in human studies is discussed here.

臨床研究における上腕動脈の内皮依存血流依存性血管拡張の超音波評価

The vascular endothelium is a monolayer of cells that cover the interior of blood vessels and provide both structural and functional roles. The ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

血管機能と形態の非侵襲的なアセスメントに方法論的アプローチ

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

生物学

細胞バリアの完全性を評価するための経内皮抵抗測定

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

著者スポットライト:細胞バリアの完全性を評価するためのTEER検出の応用 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

要約

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微小血管と内皮機能の非侵襲的評価

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成

臨床研究における上腕動脈の内皮依存血流依存性血管拡張の超音波評価

血管機能と形態の非侵襲的なアセスメントに方法論的アプローチ

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

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微小血管と内皮機能の非侵襲的評価

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成

臨床研究における上腕動脈の内皮依存血流依存性血管拡張の超音波評価

血管機能と形態の非侵襲的なアセスメントに方法論的アプローチ

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出 による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録

経内皮電気抵抗検出による bEnd.3血管内皮細胞のバリア機能完全性記録