Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.

1. Toplama ve Proses Suyu Numune (Escher ve ark Modifiye. 9) <ol><li> Çevrede su numunesi ile en 1 g sodyum azid ve 50 mg askorbik asit ihtiva eden bir temizleme 1 L amber cam şişe doldurun. 72 saat sonra 4 ° C saklayınız numune ve proses. NOT: Sodyum azit çok zehirlidir ve dikkatle ele alınması gerekir. koruyucu giysiler (göz / yüz, eldiven, giysi) kullanın ve düzgün işleyen bir duman başlığı içinde tartın. tartmak için metal bir spatula kullanmayın. </li><li> 1.6 uM cam elyaf filtre ile ve daha sonra 5-10 ml / dakika bir akış hızında, bir ön şartlandırılmış Katı Faz Ekstraksiyon (SPE) kartuşundan örnek geçirin. akış hızını kontrol etmek için vakum pompasının basıncı ayarlayın. </li><li> Vakum, 15 dakika boyunca kartuş kurutun. </li><li> 10 ml aseton içindeki ardından 10 ml metanol, kartuşu Zehir: heksan (1: 1, hac / hac). </li><li> Yüksek saflıkta, hafif bir azot akımı altında yaklaşık 1 ml&#39;ye elüat konsantre edilir. çözücüdimetilsülfoksid (DMSO) 500 ul ekleyerek ve aşağı 500 ul özü buharlaştırılması ile değişimi. </li><li> Bir amber cam bir numune alıcı viale aktarın özü. -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Deney Özgü Referans Kimya ve Su Özü dilüsyonları hazırlayın <ol><li> Kalibrasyon eğrisi için 9 dilüsyonları hazırlayın. <ol><li> % 100 DMSO içinde deney özel bir referans kimyasal bir stok çözeltisi yapın. nihai konsantrasyon ER analizi için 2 uM 17β-estradiol ve GR analizi için 100 uM deksametazon olmalıdır. -20 ° C&#39;de stok solüsyonları saklayın. </li><li> steril bir tüp içinde deney ortamı 285 ul uygun referans kimyasal stokunun 15 ul ekleyin (tüp # 1). Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından örnek karıştırın. </li><li> 8 ek borular (borular # 2-9) &#39;de deney ortamı içinde,% 5 DMSO içeren bir çözeltiye 200 ul ekle. </li><li> küvet ile tüp # 2 tüp # 1 100 ul tablet aktarınE # 9, 3 katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirmek için. Her bir seyreltilmiş örnek bir tümbölen alınarak ve aşağıdaki borunun eklemeden önce bir pipet ile iyice karıştırılması gerekir. </li></ol></li><li> deney ortamı 190 ul DMSO içerisinde 10 ul karıştırılmasıyla bir çözücü kontrol örneği hazırlayın. </li><li> Her su ekstraktı için dört dilüsyonları hazırlayın. <ol><li> birinci tüp içinde, deney ortamı 95 uL su özütü 5 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Diğer üç tüplerde deney ortamı içinde,% 5 DMSO, 50 ul ekle. </li><li> sonraki bir tüpten çözeltisi 50 ul transfer ile 2 kat seyreltme gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 3. FRET Biyoassay Davranış Hücre Süspansiyon Hazırlamak <ol><li> üreticinin talimatlarına göre analiz, belirli bir ortam hazırlar. Deney ortamı, 4 ° C&#39;de saklanır ve kullanılmadan önce bir su banyosunda 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılmalıdır. </li><li> kriyojenik serbest üzerinden ER veya GR bölünme-tutuklanan hücrelerin bir şişe alınzer yumuşak çalkalama ile 2 dakika süreyle 37 ° C su banyosu içinde flakon yerleştirerek hücrelerin hızlı bir şekilde eritin. % 70 etanol ile şişeyi arındırmak ve Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yerleştirin. </li><li> aseptik teknikler kullanılarak şişe açılır ve deney ortamında 10 ml hücre transfer edin. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> steril bir cam pipet kullanılarak süpernatan aspire ve deney ortamında 6 ml hücre pelletini. </li><li> Bir canlı bir boya çözeltisi 5 ul hücre süspansiyonu 5 ul karıştırın ve bir sayma bölmesine bir kısım ilave edin. </li><li> ışık mikroskobu ya da otomatik hücre sayacı kullanılarak canlı hücre sayısını ve hücre süspansiyonu, canlı hücrelerin yoğunluğunu tahmin ediyoruz. Deney ortamı, ml başına 550.000 canlı hücreler bir son yoğunluk elde etmek gerektiğinde seyreltilir. </li></ol> 4. Plaka 96-kuyu Siyah Duvar Clear-alt Plate Hücreler ve seyreltilmiş Su Extract ekle <ol><li> bir tabak oluşturunHer su ekstraktı için 9-nokta denemesi özel kalibrasyon eğrisi, QA / QC örnekleri ve çoklu dilüsyonları içeren düzen. 96 oyuklu bir plaka taslağına bir örnek, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> tekrarlanan hücresiz kontrol oyuklarına deney ortamı 90 ul ekle. </li><li> steril pipet haznesindeki hücre süspansiyonu dökün ve çok kanallı pipet kullanılarak kuyu hücre süspansiyonu 90 ul ekle. </li><li> Uygun oyuklara kademe 2 sırasında hazırlanan seyreltilmiş numunelerin 10 ul ekle. oyuk başına nihai DMSO konsantrasyonu% 0.5 düzeyinde olmalıdır. </li><li> Bir kapak plakası kapatılır ve 16 saat 37 ° C&#39;de bir% 5 CO2 inkübatöründe yerleştirin. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54725/54725fig1.jpg" /> Şekil 1: a. 96 oyuklu plaka taslağına Örnek çok-yuvalı plaka bir deney, belirli bir kalibrasyon eğrisi, 3 tip içerecek şekilde tasarlanmıştırQA / QC kontrolleri ve su ekstraktı başına 4 dilüsyonları (medya sadece DMSO içinde temiz bir ortamda hücreler ve hücreler orta çivili). Her kontrol ve su ekstresinin seyreltme üçlü kuyular analiz edilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 5. Yükleme Çözüm hazırlayın ve her Şey ekle <ol><li> İnkübasyondan sonra, plaka, oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Bu FRET Biyolojik deney için, 5.6 ile 5.2, doğrudan ışık olmadan yapılmalıdır yineleyin. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir 6x yükleme çözeltisi hazırlayın. </li><li> her bir kuyunun 6x yükleme solüsyonu 20 ul ekleyin. </li><li> seyreltilmiş, su Sitotoksisitenin değerlendirmek için her bir oyuğa Hücre canlılığı reaktifi 10 ul ekle. </li><li> alüminyum yapışkan film ile plaka mühür. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta plaka inkübe edin. </li></ol> 6. ölçün Sitotoksisite ve Endokrin Etkinlik Tepki <ol><li> Üreticinin talimatları izleyerek alt-okuma yetenekleri ile mikroplaka okuyucu ayarlayın. </li><li> FRET transaktivasyon Biyoassay, mavi floresan (409/460 nm, uyarma (Ex) / emisyon (Em) dalga boyu) ve yeşil (409 Ex / 530 Em nm) kanalları ölçün. </li><li> sitotoksisite deneyi için 560 Ex / 590 Em nm&#39;de floresan ölçmek. </li></ol> 7. Veri Kalitesinin belirleme QA / QC Çekler değerlendirin <ol><li> ve hücreler sadece (temiz analiz ortamında hücreleri) kontrol hücre içermeyen (sadece medya) ortalama ham floresan karşılaştırın. Ortam sadece arka plan flüoresan hücrelerin sadece kontrol cevabına kıyasla en az% 25 daha düşük olması gerekir. </li><li> Ham FRET veri işlemek. hem &#39;blue&#39; ve &#39;yeşil&#39; veri setleri için de içeren tüm hücreden hücre içermeyen kontrol çukurlarında ortalama floresan çıkarmak. hesaplamakHer deneysel kuyu için mavi / yeşil oranı. </li><li> DMSO kontrolleri ile sadece hücreler-ve hücrelerin mavi / yeşil oranını karşılaştırın. bu denetimlerin floresan değerleri% 15 Bağıl Standart Sapma (RSD) içinde olmalıdır. </li><li> bir günlük moleküler kütleye (M log) olarak ifade numune konsantrasyonuna karşı mavi / yeşil oranı olarak tahlil özel kalibrasyon eğrisi çizilir. Eğim, R 2 hesaplayın ve EC 50 (% 50 etki konsantrasyonu) oturum açın. Kalibrasyon parametreleri Tablo 1 &#39;de listelenen beklenen aralıkta olmalıdır. </li><li> tüm üçlü kuyular için RSD hesaplayın. çoğaltır arasında değişkenlik% 20 daha az olmalıdır. </li><li> sitotoksisite verileri (560 EX / 590 Em nm), tüm hücre içeren kaynaklardan gelen hücre içermeyen kontrol ortalaması (örneğin, ortam geri plan) çıkarılır. </li><li> Her numune için ortalama arka plan çıkarılır floresan hesaplayın. DMSO kontrolü bir yüzdesi olarak ortaya çıkan floresan verilerini çizilir. Numune seyreltileri olmamalıhücreleri yalnızca DMSO kontrollere göre% 20&#39;den fazla, hücre ölüm sergiler. </li></ol> 8. Veri Analizleri <ol><li> Asgari kalibrasyon tepki artı yanıt ortalamanın iki standart sapma olarak Algılama (LOD) tahlil Sınırı hesaplayın. </li><li> Bir doz tepkisini gösteren örnekler için AK 50 türetmek &#160; Referans kimyasal 10 ve% 50 etki konsantrasyonları arasındaki kalibrasyon eğrisinin lineer regresyonunun eğim ile su ekstresi. </li><li> / EC sayılı su numunesi 50 referans kimyasal BEQ = EC 50: formülü kullanarak Biyoanalitik Eşdeğer Konsantrasyon (BEQ) hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ToxCast+program+for+prioritizing+toxicity+testing+of+environmental+chemicals.">The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals.</a> Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).</li><li>Reif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+profiling+and+prioritization+of+environmental+chemicals+using+ToxCast+data.">Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data.</a> Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).</li><li>Maruya, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tiered,+integrated+biological+and+chemical+monitoring+framework+for+contaminants+of+emerging+concern+(CECs)+in+aquatic+ecosystems.">A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems.</a> Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).</li><li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+multiple+hormonal+activities+in+wastewater+effluents,+surface+water,+using+a+panel+of+steroid+receptor+CALUX+bioassays.">Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).</li><li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+in+vitro+bioassays+to+measure+estrogenic+activity+in+environmental+waters.">Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).</li><li>Jarosova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe-wide+survey+of+estrogenicity+in+wastewater+treatment+plant+effluents:+the+need+for+effect-based+monitoring.">Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).</li><li>Sonneveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+screening+models+for+androgenic+and+estrogenic+activities.">Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities.</a> Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).</li><li>Piersma, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+an+alternative+in+vitro+test+battery+for+detecting+reproductive+toxicants.">Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants.</a> Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).</li><li>Escher, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+organic+micropollutants+in+wastewater,+recycled+water+and+drinking+water+with+in+vitro+bioassays.">Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).</li><li>U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , (2012).</li><li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+wastewater+and+recycled+water+quality:+a+comparison+of+lines+of+evidence+from+in+vitro,+in+vivo+and+chemical+analyses.">Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses.</a> Water Res. 50, 420-431 (2014).</li><li>Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+the+budget:+accounting+for+glucocorticoid+bioactivity+and+fate+during+water+treatment.">Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).</li><li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genomics+profiling+of+environmental+chemical+modulation+of+human+nuclear+receptors.">Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors.</a> Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).</li><li>Mehinto, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+in+vitro+bioassays+for+screening+of+endocrine+active+chemicals+in+recycled+water.">Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water.</a> Water Res. 83, 303-309 (2015).</li><li>Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrutinizing+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+wastewater+treatment.">Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).</li><li>Tang, J. Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+characterization+of+urban+stormwater+with+bioanalytical+tools.">Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools.</a> Water Res. 47, 5594-5606 (2013).</li><li>Scott, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+endocrine+activity+in+Australian+rivers+using+chemical+and+in+vitro+analyses.">An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).</li><li>Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminants+of+emerging+concern+in+municipal+wastewater+effluents+and+marine+receiving+water.">Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).</li><li>WateReuse Research Foundation (WRRF). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Direct potable reuse: a path forward. , (2011).</li><li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+application+of+bioanalytical+tools+as+surrogate+measure+of+chemical+contaminants+in+recycled+water.">Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water.</a> Water Res. 49, 300-315 (2014).</li><li>Schriks, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+glucocorticoid+activity+in+various+surface+waters+in+the+Netherlands.">Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands.</a> Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).</li><li>Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+glucocorticoid+receptor+agonist+in+effluents+from+sewage+treatment+plants+in+Japan.">Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan.</a> Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).</li><li>Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+effects+of+effluents+from+sewage+treatment+works.">Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works.</a> Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).</li><li>Kidd, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+a+fish+population+after+exposure+to+a+synthetic+estrogen.">Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).</li><li>Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+estrogen+and+androgen+receptor+activities+in+200+pesticides+by+in+vitro+reporter+gene+assays+using+Chinese+hamster+ovary+cells.">Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells.</a> Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).</li><li>Kugathas, S., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+glucocorticoids+in+the+environment:+First+results+on+their+potential+impacts+on+fish.">Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish.</a> Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).</li><li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+panel+of+high-throughput+reporter-gene+assays+to+detect+genotoxicity+and+oxidative+stress.">Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).</li><li>Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+designer+drugs:+when+transformation+may+not+eliminate+risk.">Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk.</a> Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu 17β-estradiol (E2), ng / L konsantrasyonlarda 23,24 de, bu maddeler için garanti tarama çevresel estrojenler iyi belgelenmiş gücü. Bu çalışmada, atık su Pis su ER tepkisi (BEQ aralığı: 2,3-17 ng E2 / L) E2 / L ng 4 0.5 &lt;yüzey suyuna (için BEQs ise, Avustralyalı atıksu arıtma tesislerinin 20 ikincil atık bildirilen biraz daha yüksek oldu ) E2 ng 11 / L) 16 yerde yüzey ve yağmur suyu (&lt;1 için rapor aralığında idi. yüzey suyu numunelerinde ölçülen ER a...

Mevcut su kalitesi izleme doğru ve kesin yaban hayatı ve insanlar maruz kalma bir vekil olarak kimyasal kirleticilerin oluşumunu ölçmek için yeteneği esas alınmaktadır. Ancak, bu kimyasal-by-kimyasal izleme ve değerlendirme paradigma Karşı karşıya olduğumuz sürekli değişen kimyasal evren ayak uydurmak mümkün değil. Biz kader ve sentetik ve doğal kimyasalların etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek, biz biyolojik etkileri beklenen hitap eden ölçüm araçları aramaya devam, ve aynı zamanda bu kimyasal üretim, kullanım ve çevre girdi değişikliklere karşı bağışık bulunmaktadır. Bu tür araçlar bilinmeyen ya da yeni kimyasallar ve dönüşüm ürünleri, dikkatimizi hak edip anlamak için özellikle önemlidir. Ayrıca, suda mevcut kimyasallar kompleks karışımlar zayıf tek tek kimyasal izleme ile ele alınmaktadır. Böylece, daha iyi adrese yüzey suları tha bu sorunları mevcut izleme araç kutusunu modernizasyonu sorunuyla karşı karşıyat tedavi atiksuyun ve kentsel / yağmursuyu ikinci tur atılmasını alırsınız. Son yıllarda, biyoanalitik teknikler su kalitesi değerlendirmesi için tarama araçları olarak söz göstermiştir. Bilinen yoluyla hareket eden kimyasallara tepki özellikle, in&#39;vitro biyoanalizlere olarak, eylemin 1,2 spesifik modları çevresel izleme topluma 3 büyük ilgi görmektedir. Sayısız araştırmalar içme, yüzey ve Atıksuların 4 -6 endokrin aktivitesini ölçmek için in vitro biyoanalizlere istihdam var. Ayrıca, biyo-deneylerde bir dizi molekül başlatma olaylar (örneğin, reseptör aktivasyonu), potansiyel olarak istenmeyen sonuç yolu ile zararlı etkileri ile bağlantılı olabilir 7,8 analiz hedef alır. Su kalitesi değerlendirmesi için bioscreening evrimi açısından değerlendirilmiştir edilerek in vitro biyoassay uç noktaları farklı yüzlerce nispeten hızlı olmuştur onlarınyarar 9,10. Şu anda, Biyoanalizlerin sadece bir avuç su kaliteleri 5,6 arasında ayrım yeteneği gösterirken (laboratuarlar içinde) iyi ölçüm hassasiyeti elde gösterilmiştir. Özellikle muamele edilmiş atık suyun, östrojenler ve glukokortikoid steroid oluşumu başarılı olmuştur nitro trans aktivasyon 11,12 kullanarak oluşturmaktadır. kimin hücre hatları tescilli (ve dolayısıyla yaygın olarak kullanılabilir değil) Ancak bugüne kadar birçok çalışma istihdam var biyoassayler, sürekli bakım ve manipülasyon, ya da her ikisi gerektirir. Sonuç olarak, yetenek topluluk engellenmiş kalır su kaynaklarına bu tarama teknolojisini transfer etmek sonuçta, protokolleri standardize laboratuvarlar arası kalibrasyon egzersizleri, ve. ABD ToxCast programı ile incelenen in vitro biyo-deneyler arasında en az bir teslimatçı &quot;dondurma ve çözme, kullanımı kolay 13 ticari olarak temin edilebilir4; biçimleri. Bu takım durdurulmuş hücreli &quot;setleri&quot; tedavi 14 farklı seviyelerde ifade eden sudan ekstre kimyasal aktivitesinin ölçülmesi sağlam olması gösterilmiştir. satıcı protokolleri bireysel kimyasalların veya karışımların biyo ekrana mevcut olmasına rağmen onlar su numunelerinin uygulanabilir önce, bazıları değişiklik gerektirir. Arıtılmış atıksu çıkış 15, yağmursuyu akış 16, alıcı sular 17,18 ve daha yakın dönüştürülmüş su 19,20 su kalitesi, topluluğun ilgileneceği olan sulu ortam asal örnekleridir. Bu çalışma, ticari olarak mevcut kullanarak su örneklerinde endokrin aktivitesini ölçmek için tek bir standart protokol sunar, bölünme-tutuklandı in vitro trans biyo-deneylerde. Biz tw için tepki arka doz cevap verebilen ve tekrarlanabilirlik kapsamlı bir değerlendirme ile protokol sağlamlığını gösterdiÖzellikle faiz Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör transaktivasyonunun (ER ve GR, sırasıyla) o bitiş noktaları. protokol Kaliforniya&#39;da tatlı su sistemlerinden tedavi atiksuyun ve yüzey suyunun ekran örneklerine uygulanmıştır.

<table><tbody><tr><td>GeneBLAzer ER alpha DA assay kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K1393</td><td>Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.</td></tr><tr><td>GeneBLAzer GR DA assay kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K1391</td><td>Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.</td></tr><tr><td>PrestoBlue cell viability reagent&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% in PBS</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8154</td><td>Also available at ThermoFisher</td></tr><tr><td>Corning 96-well black wall, clear-bottom plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Individually wrapped, sterile with lid</td></tr><tr><td>Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 &amp;micro;M</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>WHA1820025</td><td></td></tr><tr><td>Microplate aluminum sealing film</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>T592100</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent</td><td>Waters</td><td>WAT106202</td><td></td></tr><tr><td>17&amp;beta; Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E2758</td><td>CAS #50-28-2</td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A61-100</td><td>Also available at Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Dexamethasone&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D4902</td><td>CAS #50-02-2</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D8418</td><td>Molecular grade</td></tr><tr><td>Solvents (acetone, hexane, methanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S2002</td><td>Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fume-hood. Also available at EMD Millipore.</td></tr><tr><td>Automated cell counter or hemocytometer</td><td>Various*</td><td></td><td>Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.</td></tr><tr><td>Class II biological safety cabinet</td><td>Various*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Various*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic freezer&amp;nbsp;</td><td>Various*</td><td></td><td>Liquid nitrogen storage dewar is recommended.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescence microplate-reader</td><td>Various*</td><td></td><td>&amp;nbsp;The reader must have bottom read capabilities.</td></tr><tr><td>* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

screening for endocrine activity in water using commercially-available in vitro transactivation bioassays

In vitro trans biyoanalizlere Bununla birlikte onların benimsenmesi ve yaygın uygulama nedeniyle standart yöntem ve sağlam, kullanıcı dostu teknoloji kullanılabilirlik eksikliği kısmen engellemiştir edilmiştir, su kalitesi izleme araçları olarak söz göstermiştir. Bu çalışmada, piyasada mevcut, bölünme-tutuklandı hücre hatları kantitatif çevresel kalite uzmanları ilgilendiren su örneklerinde bulunan kimyasalların endokrin faaliyeti taranması için kullanılmıştır. Kapsamlı kalite güvence / kalite kontrol dahil tek, standart bir protokol (QA / QC) denetler hücre tabanlı Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) testi kullanılarak (sırasıyla, ER ve GR) Östrojen ve Glukokortikoid Reseptör aktivitesi için geliştirilmiştir. Kaliforniya (ABD) tatlı su sistemlerinden tedavi belediye atık suyun ve yüzey suyunun numuneleri, katı faz ekstraksiyon kullanılarak çıkarılan ve standardize proto kullanarak endokrin aktivitesi için analiz edildiCol. Arka plan ve bitiş noktası özgü referans kimyasallar için doz-yanıt güvenilir ölçümü için gerekli gördüğü QA / QC kurallarına araya geldi. Yüzey su örnekleri için biyoassay tarama yanıtı büyük ölçüde saptanabilir değildi. Bunun aksine, ikincil arıtma tesisleri atık örnekleri ER 392 ng deksametazon GR / L ve 17 ng 17β-estradiyol / L&#39;ye kadar, tahmini biyo-analizi eşdeğer konsantrasyonlarda (BEQs) ile en yüksek ölçülebilir aktiviteye sahiptir. bir tersiyer atık su örneği için biyolojik yanıtın, tedaviden sonra endokrin aktif kimyasalların daha düşük bir bakiye gösteren ikincil atık için ölçülen daha düşüktü. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilir kullanan nitro trans biyo-deneylerde, bölme durdurulmuş hücreli &quot;setleri&quot;, su içinde endokrin aktivitesi için taranması için adapte edilebileceğini göstermiştir.

Bu çalışmada, tedavi belediye atiksuyun 4x 24 saat kompozit numuneler, Güney Kaliforniya&#39;da tatlı su sistemlerinden yüzey sularının 6 kapmak örnekleri ve ultra saf su içeren bir alan boş bu protokolü göstermek için seçildi. 4 atık örneklerinin 3 konvansiyonel aktif çamur atıksu arıtma tesislerinde ( &quot;ikincil atık&quot;), ve kum / karbon filtrasyon eklendi sonrası biyolojik arıtma ( &quot;üçüncül atık&quot;) ile gelişmiş atık su arıtma tesisi dörd...

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays at JoVE.com

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan<em&gt; İn Vitro</em&gt; Transaktivasyon biyolojik tayinler

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

screening-for-endocrine-activity-water-using-commercially-available

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

7.5K Görüntüleme.  Southern California Coastal Water Research Project Authority. A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Video: Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and enables to perform rapid, automated and simple SPE. The pre-concentrated solution is compatible with analysis by immunoassay, with a low organic solvent content. A method is described for the extraction and pre-concentration of natural hormone 17&#946;-estradiol in 100 ml water samples. Reverse phase SPE is performed with octadecyl-silica sorbent and elution is done with 200 &#181;l of methanol 50% v/v. Eluent is diluted by adding di-water to lower the amount of methanol. After preparing manually the SPE column, the overall procedure is performed automatically within 1 hr. At the end of the process, estradiol concentration is measured by using a commercial enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). 100-fold pre-concentration is achieved and the methanol content in only 10% v/v. Full recoveries of the molecule are achieved with 1 ng/L spiked de-ionized and synthetic sea water samples.

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Küçük Kirleticilerin İmmünolojik Analizi Su Örneklerinin Otomatik Katı Faz Ekstraksiyon Basit Bir Yöntem

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Çevre

Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.

Endocrine Disrupting Compounds (EDC) pose a substantial risk to the aquatic environment. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. The methodology provided in this paper allows for an assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to EDC removal.

Atıksu Arıtma Süreçlerinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi için Kimya ve Ekotoksikolojik Yöntemlerinin bir pil kullanılması östrojenik Potency çıkarmak

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in ...

Using Tg(Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryos to Test the Estrogenic Effects of Endocrine Disrupting Compounds

There are many endocrine disrupting compounds (EDC) in the environment, especially estrogenic substances. The detection of these substances is difficult due to their chemical diversity; therefore, increasingly more effect-detecting methods are used, such as estrogenic effect-sensitive biomonitor/bioindicator organisms. These biomonitoring organisms include several fish models. This protocol covers the use of zebrafish Tg(vtg1: mCherry) transgenic line as a biomonitoring organism, including the propagation of fish and the treatment of embryos, with an emphasis on the detection, documentation, and evaluation of fluorescent signals induced by EDC. The goal of the work is the demonstration of the use of the Tg(vtg1: mCherry) transgenic line embryos to detect estrogenic effects. This work documents the use of transgenic zebrafish embryos Tg(vtg1: mCherry) for the detection of estrogenic effects by testing two estrogenic substances, &#945;- and &#946;-zearalenol. The described protocol is only a basis for designing assays; the test method can be varied according to the test endpoints and the samples. Moreover, it can be combined with other assay methods, thereby facilitating the future use of the transgenic line.

Using TgVtg1:mcherry Zebrafish Embryos to Test the Estrogenic Effects of Endocrine Disrupting Compounds

Present here is a detailed protocol for the use of zebrafish embryos Tg(vtg1: mCherry) for the detection of estrogenic effects. The protocol covers the propagation of the fish and treatment of embryos, and emphasizes the detection, documentation, and the evaluation of fluorescent signals induced by endocrine disrupting compounds (EDC).

Endokrin Bozan Bileşiklerin Östrojenik Etkilerini Test Etmek Için Tg(Vtg1:mcherry) Zebrabalığı Embriyolarının Kullanılması

There are many endocrine disrupting compounds (EDC) in the environment, especially estrogenic substances. The detection of these substances is difficult ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Biyokimya

In Silico Modeling Method for Computational Aquatic Toxicology of Endocrine Disruptors: A Software-Based Approach Using QSAR Toolbox

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological systems. In particular, quantitative structure-activity relationship (QSAR) models have been increasingly applied to assess the environmental effects of a plethora of toxic materials. In recent years, some more highlighted types of toxicants are endocrine disruptors (EDs, which are chemicals that can interfere with any hormone-related metabolism). Because EDs may significantly affect animal development and reproduction, rapidly predicting the adverse effects of EDs using in silico techniques is required. This study presents an in silico method to generate prediction data on the effects of representative EDs in aquatic vertebrates, particularly fish species. The protocol describes an example utilizing the automated workflow of the QSAR Toolbox software developed by the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) to enable acute ecotoxicity predictions of EDs. As a result, the following are determined: (1) calculation of the numerical correlations between the concentration for 50% of lethality (LC50) and octanol-water partition coefficient (Kow), (2) output performances in which the LC50 values determined in experiments are compared to those generated by computations, and (3) the dependence of estrogen receptor binding affinity on the relationship between Kow and LC50.

Quantitative structure-activity relationship (QSAR) modeling is a representative bioinformatics-assisted method in toxicological screening. This protocol demonstrates how to computationally assess the risks of endocrine disruptors (EDs) in aquatic environments. Utilizing the OECD QSAR Toolbox, the protocol implements an in silico assay for analyzing toxicity of EDs in fish.

Endokrin Bozucuların Hesaplamalı SuToksikolojisi için Silico Modelleme Yöntemi: QSAR Toolbox Kullanarak Yazılım Tabanlı Bir Yaklaşım

Computational analyses of toxicological processes enables high-throughput screening of chemical substances and prediction of their endpoints in biological ...

Biyomühendislik

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Bir Zebra balığı Larva Lusıferaz Muhabir Sistemi ile glukokortikoid Signaling&#39;den için bir Kimyasal Tarama Prosedürü

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Biyoloji

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

A Rapid In Vivo Bioassay for Developmentally Active Enhancers

A potential regulatory sequence (PRS) can be identified by several approaches including conservation analysis and transcription factor-specific chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (TF ChIP-seq). TF ChIP-seq generates a large data set (TF-regulatome) that includes PRSs and background interactions. These approaches require secondary low throughput validation in model systems that replicate the temporal and spatial specificity of the PRS. 
In this report, a protocol is described to rapidly validate activity of PRSs in their developmental context. Following selection of candidate PRSs, the associated sequences are isolated, cloned into a GFP reporter construct, and then transfected into chick embryos. For PRSs that are anticipated to be functional during early development, from gastrulation through early organogenesis, whole embryo electroporation (EP) is recommended. With this technique transfection, incubation and monitoring occurs ex ovo during early gastrulation. The entire embryo is transfected and as structures form, they can be monitored live for PRS activity. This ex ovo approach supports development up to early limb bud outgrowth. 
If the functional activity of a PRS is expected to be later in development or if the investigation is to ascertain its activity during the development of a specific organ, targeted regional electroporation (TREP) is used. This approach requires injection of construct DNA directly into the developing organ, precursor or adjacent cavity prior to electroporation. An approach to transfect the presumptive limb bud using TREP is also outlined and illustrated. TREP supports a rapid organ-specific validation of a PRS' activity. Both techniques can also be used to investigate regulatory domains by site-directed mutagenesis of the PRS-reporter construct. 
The chick as a bioassay offers a rapid effective tool for PRS validation, functional domain determination, and further characterization of the regulatory events responsible for development.

With the increased use of transcription factor-specific ChIP-seq technology, techniques to validate potential regulatory regions are critical. The authors describe a rapid chick bioassay to validate the activity of regulatory sequences functioning during development.

A potential regulatory sequence (PRS) can be identified by several approaches including conservation analysis and transcription factor-specific chromatin ...

Endokrin Bozulmasını Değerlendirmek için Tiroid Hormonu Eylem Göstergesi Farelerin Görüntülenmesi

In vivo Characterization of Endocrine Disrupting Chemical Effects via Thyroid Hormone Action Indicator Mouse

Thyroid hormones (TH) play a critical role in cell metabolism and tissue function. TH economy is susceptible to endocrine disrupting chemicals (EDCs) that can disturb hormone production or action. Many environmental pollutants are EDCs, representing an emerging threat to both human health and agricultural production. This has led to an increased demand for proper test systems to examine the effects of potential EDCs. However, current methodologies face challenges. Most test systems use endogenous markers regulated by multiple, often complex regulatory processes, making it difficult to distinguish direct and indirect effects. Moreover, in vitro test systems lack the physiological complexity of EDC metabolism and pharmacokinetics in mammals. Additionally, exposure to environmental EDCs usually involves a mixture of multiple compounds, including in vivo generated metabolites, so the possibility of interactions cannot be ignored. This complexity makes EDC characterization difficult. The Thyroid Hormone Action Indicator (THAI) mouse is a transgenic model that carries a TH-responsive luciferase reporter system, enabling the assessment of tissue-specific TH action. One can evaluate the tissue-specific effects of chemicals on local TH action by quantifying luciferase reporter expression in tissue samples. Furthermore, with in vivo imaging, the THAI mouse model allows for longitudinal studies on the effects of potential EDCs in live animals. This approach provides a powerful tool for testing long-term exposure, complex treatment structures, or withdrawal, as it enables the assessment of changes in local TH action over time in the same animal. This report describes the process of in vivo imaging measurements on THAI mice. The protocol discussed here focuses on developing and imaging hyper- and hypothyroid mice, which can serve as controls. Researchers can adapt or expand the treatments presented to meet their specific needs, offering a foundational approach for further investigation.

Yazar Spotlight: THAI Fare Modelini Kullanarak Tiroid Hormonu Bozulmasının İn Vivo Değerlendirmesi

The Thyroid Hormone Action Indicator mouse model was developed to enable tissue-specific quantification of local thyroid hormone action using its endogenous regulatory machinery. Recently, it has been shown that the model is suitable for characterizing endocrine-disrupting chemicals interacting with thyroid hormone economy, both by ex vivo and in vivo methodologies.

Tiroid Hormon Etki Göstergesi Fare ile Endokrin Bozucu Kimyasal Etkilerin İn vivo Karakterizasyonu

Thyroid hormones (TH) play a critical role in cell metabolism and tissue function. TH economy is susceptible to endocrine disrupting chemicals (EDCs) that ...

Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Küçük Kirleticilerin İmmünolojik Analizi Su Örneklerinin Otomatik Katı Faz Ekstraksiyon Basit Bir Yöntem

Atıksu Arıtma Süreçlerinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi için Kimya ve Ekotoksikolojik Yöntemlerinin bir pil kullanılması östrojenik Potency çıkarmak

Endokrin Bozan Bileşiklerin Östrojenik Etkilerini Test Etmek Için Tg(Vtg1:mcherry) Zebrabalığı Embriyolarının Kullanılması

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Endokrin Bozucuların Hesaplamalı SuToksikolojisi için Silico Modelleme Yöntemi: QSAR Toolbox Kullanarak Yazılım Tabanlı Bir Yaklaşım

Bir Zebra balığı Larva Lusıferaz Muhabir Sistemi ile glukokortikoid Signaling'den için bir Kimyasal Tarama Prosedürü

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

A Rapid In Vivo Bioassay for Developmentally Active Enhancers

Tiroid Hormon Etki Göstergesi Fare ile Endokrin Bozucu Kimyasal Etkilerin İn vivo Karakterizasyonu

Tiroid Hormon Etki Göstergesi Fare ile Endokrin Bozucu Kimyasal Etkilerin İn vivo Karakterizasyonu