We would like to thank Gero Miesenb&#246;ck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.

1. Çözüm ve Medya <ol><li> Aşağıdaki Stoklar, Medya ve Tabaklar hazırlayın: <ol><li> 10x YNB hazırlamak için, suyun 1 L amino asitleri eksik maya azot baz 67 g çözülür. 0.22 mikron nitroselüloz filtre ile süzme ile sterilize edin. </li><li> 2 (h stokunun w / steril% 50),% dekstroz ve 1 x amino asit / besleyici karışımı (10x stok) 1x YNB kullanılarak YNB orta hazırlayın (100X&#39;lik bir stok, Aşama 1.1.4 bakınız). gerektiği gibi plazmid seçimi için, bireysel amino asitler ya da besin ihmal. Mup1 ekspresyon indüksiyonu için, ilave olarak, amino asit / besleyici karışımından metiyonin sayın. </li><li> (H stokunun w / steril% 50) (10x stok) 1x YNB kullanılarak YNB plakaları,% 2 dekstroz hazırlayın, 0.7 g / L amino asit / besleyici karışımı (adım 1.1.5) ve% 2.5 agar. ağar, 25 g su ve 860 ml başına amino asit / besin karışımı 0.7 g otoklav tarafından plaka ortamı hazırlayın. mi O karışım 100 10x YNB üzerine ilave edildi ve 40, daha sonra, 55 ° C&#39;ye kadar soğumaya eklemesine izin verinF% 50 glükoz. , Plakalar (10 cm tabak başına ortamın yaklaşık 30 mi) dökün ortamı oda sıcaklığında katılaşmaya izin ve mağaza plakalar 4 ° C &#39;de. </li><li> iyonu giderilmiş su, 100 ml aşağıdaki çözündürülmesiyle (sıvı ortam için) 100 x amino asit / besleyici stok çözelti hazırlayın: 0.1 g L-Metionin, 0.3 g L-lösin ve L-lizin, ve 0.2 g L-histidin, her her biri L-triptofan, adenin ve urasil (spesifik suşları için gerektiği şekilde başka amino asitler ve besin dahil edilebilir). çözünmesi için gerekirse hafif ısı kullanın ve 0.45 mikron nitroselüloz filtre ile sterilize edin. ışıktan korunarak oda sıcaklığında saklayınız. Plazmid seçimi için, gerektiği gibi, belirli bileşenlerin bulunmadığı stok çözelti hazırlayın. </li><li> birleştirerek amino asit / (plakaları için) besin karışımının hazırlanması Aşağıdaki: adenin 0.5 g, L-lösin 4 g, 2 g L-histidin, L-lizin, L-metiyonin, L-triptofan, her, L- tirosin ve urasil. Bir havanda eziyet ve pro ile saklamakışıktan koruması. Plazmid seçimi için, gerektiği gibi, belirli bileşenlerin bulunmadığı karışımlarını hazırlamak ve plaka ortamında (adım 1.1.3 bakınız) her bir litresi için, amino asit karışımı ve 0.7 g kullanın. </li></ol></li><li> konkanavalin A (ConA) ile slayt yüzeyini kaplayarak mikroskopi için 8-iyi odasının slaytlar hazırlayın. slaytı, her sıra için, su içinde çözülmüş, 2 mg / ml ConA 25 ul ekle. Bir pipet kullanarak, kuyunun alt yüzeyi boyunca CnA yayılmış, sonra en az 4-8 saat oda sıcaklığında hava içinde kurumasına slayt sağlar. İdeal olarak, ConA kaplama 24 saat içinde odasının slaytlar kullanın. </li><li> Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Longtine et al merkezli entegrasyon metodu kullanılarak söz endositik kargo GFP veya pHluorin çerçeve içi füzyon maya suşları oluşturur. ve Goldstein ve McCusker 25,26. Not: pHluorin direnci kanamisin genleri (KANMX6) ve nourseothricin kasetler etiketleme ihtiva eden plasmidler ( <em&gt; NATMX4) daha önce 20 tarif edilmiştir. <ol><li> Genomik entegrasyon 20,25 site özel ek sekanslar ihtiva eden primerler ile seçilebilir işaretleyiciler içeren GFP ya pHluorin kasetleri yükseltin. </li><li> Lityum asetat yöntemi 27 kullanarak istenen maya suşu içine çıkan PCR ürünü Transform. </li><li> Uygun ilaç içeren YPD plakalar üzerinde büyüyen hücreleri tarafından kasetin entegrasyonu için seçin. tabak, otoklav 10 g maya özü, 20 g pepton, 0.1 gr triptofan ve 960 ml su içinde 25 g agar hazırlamak. Plakaları, dökme önce, karışım daha sonra kan şekeri ve KANMX6 seçimi için, 200 ug / ml bir son konsantrasyona kadar G418 ya da ya da nourseothricin 100 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyon için, 40 ml% 50 eklemek 55 ° C&#39;ye kadar soğuması NATMX4 seçimi. </li><li> PCR ile tek tek koloniler GFP ya pHluorin etiketinin entegrasyonu teyit ve / veya anti-GFP antikorları kullanılarak Western lekeleme,yanı sıra floresan mikroskobu 20 tarafından etiketlenen proteinin tespiti ile. Not: Belirli maya kökleri ve bu çalışmada kullanılan plazmidler, sırasıyla Tablolar 1 ve 2&#39;de sıralanmıştır. </li></ol></li></ol> Konstitütif İçselleştirilmiş Endositik Cargo kararlı durum Floresans 2. Endpoint Testi <ol><li> (Varsa) plazmid bakımı için gerekli olan amino asitler ya da besin eksik YNB ortamın 5 ml hücreler (~ 3 küçük koloni) inoküle. 250 rpm çalkalanarak, 30 ° C&#39;de yörüngesel çalkalamalı bir enkübatörde 16-24 saat boyunca hücrelerin büyütün. Alternatif olarak, amino asitler ya da plazmid seçimi için besin eksik YNB plaka üzerine hücre çizgi bir p, 1-2 mm kolonisi ile 30 ° C &#39;de bir gece boyunca hücreler büyür. </li><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, her bir gece boyunca kültür yoğunluk (OD 600) ölçülür. Pla için amino asitleri veya besin eksik YNB ortamında 0,35-0,4 OD 600 / ml 5 ml seyreltme hazırlayınSmid bakımı ve çalkalanarak 30 ° C&#39;de yaklaşık 3 saat büyür. kullanarak hücrelerin bir tabakta çizgili, bu adımı atlayın ve adım 2.4 (aşağıya bakınız) ile devam edin. </li><li> Şimdi 0,6-1,0 OD 600 / ml arasında olmalıdır hücrelerin yoğunluk (OD 600), ölçün. 2 dakika boyunca 8.000 rpm&#39;de (6,800 xg) 1.5 kadar bir mikrofüj tüpüne kültür ml ve pelet hücreleri aktarın. süpernatant 1475 ul çıkarın. </li><li> bir floresan mikroskobu hücreleri getirin. Her bir örnek görüntüleme önce, geri kalan ortam içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla, bir slayt hazırlayın ve bir kapak slip altında hücre süspansiyonu 3 ul monte edin. Plazmid seçimi için uygun bir şekilde YNB ortamı kullanılarak, protokol 3&#39;te aşağıda tarif edildiği gibi alternatif olarak, 8 oyuklu odası preparatların hazırlanması. İdeal olarak, bir 100X, 1.4 veya daha yüksek sayısal açıklık (NA) yağ daldırma objektif lens, 12 veya 16-bit kamera ve uyarma / emisyon filtreleri ile görüntü hücreleri GFP floresan için optimize edilmiş. NOT: kullanan hücreler o çizgiler büyüdüğü takdirdena plaka, bir kapak kayma taze YNB orta 3 ul koyarak slayt hazırlamak. Bir pipet kullanarak, plakadan hücrelerin küçük koloni toplama YNB ortama hücreleri dağıtmak ve görüntüleme hemen önce bir cam lam üzerine elde edilen süspansiyon monte edin. </li><li> Görüntü bir deney içindeki tüm görüntüler için aynı satın alma parametreleri (örneğin, filtre setleri ve maruz kalma süresi) ile her bir durum için hücrelerin 4-6 rastgele alanlar. NOT: her alan için bir aydınlık ya da DIC görüntü Toplama pHluorin sinyali MVB ve vakuoler bölümlerinde söndürülür hücreleri için yararlı olabilir. </li><li> her bir durum için, en az 30-50 hücrelerin floresans yoğunluğunu ölçülmesi (protokol 5). </li></ol> Ayarlı endositoza uğrayabilmektedir kargoların endositozun Niceleme 3. Kinetik Testi <ol><li> metionin yoksun YNB ortamın 5 ml maya hücreleri (koloni başına çap olarak yaklaşık 2 mm) 2-3 koloniler inoküle ekleyinPlazmid seçimi muhafaza etmek için itional amino asitler ya da besin. çalkalanarak 30 ° C&#39;de 16-24 saat boyunca kültürler büyütün. NOT: Bu yazıda, düzenlenmiş endositik kargo proteinleri çalışmak için protokoller metiyonin permease, Mup1 kullanımı yapacak. düzenlenmiş endositoza uğrayabilmektedir diğer yükler de pHluorin ile etiketleme için uygundur (örneğin, urasil yokluğunda plazma membranında birikir ve Fur4 permeaz urasil, harici urasil uygulanan tepki olarak içselleştiren); Bu kargolar için, medya koşulların bu yükler için özel anlatım, indüksiyon ve içselleştirme koşullarını yansıtacak şekilde modifiye edilmelidir. </li><li> Yaklaşık 3 saat görüntüleme önce her gecede kültür yoğunluk (OD 600) ölçün. Plazmid bakım metiyonin ve ilave amino asitler ya da besin eksik YNB ortamında 0,35-0,4 OD 600 / ml&#39;de 5 ml&#39;lik bir seyreltme hazırlayın ve çalkalanarak 30 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> Mikrolara önceden dengeyeAdım 3.2 3 saat inkübasyon sırasında 30 ° C çevre odasını veya ısıtmalı sahne (varsa) baş. </li><li> Transferi 2 dakika boyunca 8.000 rpm&#39;de (6,800 xg) 1 kadar bir mikrofüj tüpüne hücre kültürünün mi, ve pelet hücreleri. süpernatan 975 ul çıkarın. </li><li> görüntüleme (protokol 1.2) için bir ConA ile tedavi edilen, 8-iyi cam tabanlı bölme slayt hazırlayın. </li><li> her bir plazmid seçimi için metiyonin ve ilave amino asitler ya da besin eksik YNB ortamı 200 ul ekle. Kalan süpernatant adım 3.4 den hücre pelletini ve her bir merkezi haline hücre süspansiyonu 2.5 ul bırakın. aşağı yukarı pipetleme kuyu yüzeyinde hücreleri dağıtmak ve hücreler 5-10 dakika yerleşmek için izin verir. </li><li> 30 ° C (adım 3.3) dengelenmiş bir ters floresan mikroskop odası slayt yerleştirin. aydınlık aydınlatma kullanarak hücrelerin bir alan bulun. </li><li> 100 ug / ml metionin ihtiva eden YNB ortamı 50 ul ekle20 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için metionin kuyudaki ortam 200 ul (30 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış). alt yüzer hücreler önlemek amacıyla kuyudaki ortam bozmamak. </li><li> Hücreler görüntüleme başlamadan önce 2 dakika süreyle dengelenmeye bırakın. Hemen ilk fotoğraf çekiminden önce, istenen odak düzlemine mikroskop ayarlamak (genellikle, bir ekvatoral odak düzlemi en iyi şekilde çalışır). </li><li> GFP filtre kullanarak (örneğin bir zaman serisi içindeki tüm görüntüler için, 100X 1.4 NA immersiyon yağı hedefi ve 500 msn edinme zamanı aynı edinme parametreleri kullanılarak, 45-60 dakika süreyle 100 5 dakika aralıklarla GFP ve aydınlık (veya DIC) görüntüler elde msn alma süresi DIC filtre kullanarak). NOT: mikroskop sahne ve görüntüleme yazılımı odak düzlemi sürüklenme otomatik olarak düzeltilmesi için izin vermezseniz, elle her bir görüntüleme zaman noktası öncesinde odağı yeniden ayarlanması gerekebilir. Ayrıca, satın alma süreleri olacaknedeniyle aydınlatma ve filtreler farklılıklara mikroskoplar arasında değişir ve en iyi şartlar deney başlamadan önce manuel olarak belirlenmelidir. Mup1 dışında bir endositik kargo kullanılırsa, yükün içselleştirme kinetiklerini yansıtmak için, elde etme süresi ve görüntüleme aralıkları, hem de deney süresini değiştirmek için gerekli olabilir. </li><li> Her bir zaman noktasında tek tek hücrelerin floresans yoğunluğunu ölçülmesi (protokol 5) ve birinci görüntünün ilk yoğunluğu yüzdesi olarak değerleri ifade eder. </li></ol> Ayarlı endositoz GeçecekANKARA Endositik Cargos Niceleme 4. Endpoint Testi <ol><li> protokol 3&#39;te tarif edildiği gibi görüntüleme için hücrelerin hazırlanması (3.6 ile 3.1 adım). </li><li> Görüntü hemen aydınlık ve GFP filtre setleri kullanılarak, metionin eklemeden önce her bir durum için hücrelerin 4-5 rastgele alanlar. </li><li> 100 ug / ml metionin ihtiva eden YNB ortamı 50 ul ekle (savaş öncesikuyudaki ortam 200 ul), 30 ° C&#39;ye kadar Med 20 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için metionin. alt yüzer hücreler önlemek amacıyla kuyudaki ortam bozmamak. </li><li> 0 dakika zaman noktası (aşama 4.2) aynı edinim koşulları kullanıldığında metiyonin ilave edildikten sonra hücreler resmi 4-5 rastgele alanları 30 dakika. </li><li> Her bir zaman noktası için, en az 30-50 hücrelerin floresans yoğunluğunu ölçülmesi (protokol 5). formülü kullanarak 30 dakika sonra içselleştirilmiş Mup1-pHluorin yüzdesi olarak ifade değerler: - x% 100 [0 dak ortalama yoğunluğu] / [30 dk yoğunluğunu ortalama 0 dk yoğunluğunu ortalama]. NOT:. Aynı anda her testin başlangıç zamanını şaşırtıcı sekiz uç noktaları deneyleri kadar gerçekleştirmek mümkündür Tablo 3 sekiz eşzamanlı deneyleri için örnek iş akışı sağlar. </li></ol> 5. Post-satın alma Analizi <ol><li> 1 olarak satın alma yazılımı ihracat görüntüleri6-bit etiketli görüntü dosyası biçimi (.tif veya .tiff formatında). Not: Diğer dosya formatları da uygun olabilir ve ideal kayıpsız sıkıştırma algoritmaları kullanmak gerekir. 8-bit görüntüler, genel olarak ölçümü için uygun değildir. </li><li> varsa ( &#39;Dosya&#39; menüsünden &#39;Aç&#39; seçeneği serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı (kullanarak açık dosyaları. ölçümü için floresan görüntü kullanın ve bir referans olarak aydınlık / DIC görüntü hücrelerinin yerini belirlemek ve ölü hücreleri hariç ), DIC tarafından görüntülenen ve GFP uyarma / emisyon filtreleri ile bakıldığında autofluorescent olan canlı hücreler daha koyu görünür hangi. </li><li> floresan görüntü bir arka plan çıkarma gerçekleştirin. dengesiz bir arka plan sinyali ile görüntüler için, &#39;İşlem menüsünden&#39; bulundu &#39;Arka Plan Çıkarma&#39; algoritmasını kullanır. Miktar belirleme amaçları için genellikle yeterli olmaktadır varsayılan ayarı (50 piksel top yarıçapı haddeleme) kullanın. Not: Alternatif bir backgroüniforma arka plan ile görüntüler için und çıkarma yöntemi adım 5.3.1.-5.3.2 anlatılmıştır; Bununla birlikte, yukarıdaki yöntem, homojen bir arka plan için de kullanılabilir. <ol><li> Üniforma kökenli görüntülerde (yani, arka plan yoğunluğu tüm kenarlarda ve görüntünün merkezine yaklaşık sabittir), manuel arka plan çıkarma işlemleri. Ana ImageJ penceresinde bulunan &#39;serbest Seçmeler&#39; butonuna tıklayın, ve hücreleri içermeyen görüntü içinde 3-5 rastgele bölgeleri seçin. </li><li> &#39;Analiz&#39; menüsünde bulunan &#39;Set Ölçümler&#39; işlevini açın &#39;Mean Gray Değer&#39; parametreyi seçin ve (aynı zamanda &#39;Analiz&#39; menüsünde bulunur) &#39;Tedbir&#39; fonksiyonunu kullanarak yoğunluk değerlerini ölçmek. 3-5 ölçülen bölgelerden ortalama değerini hesaplayın ve bu görüntüdeki sonraki tüm ölçümlerden çıkarılır. </li></ol></li><li> Kinetik deneyler ölçümü için (protokol 3), Tim için tek bir yığın görüntü oluşturmakE serisi. kronolojik sırayla her zaman noktasından floresan görüntüleri açın ve (Yığınlar alt menüsü altındaki &#39;Resim&#39; menüsünde bulunan,) işlevini &#39;Stack Görüntüler&#39; kullanarak bir yığın oluşturur. </li><li> mümkün olduğunca hücre dışında tüm hücre ama küçük alanı da kapsayacak şekilde emin, serbest seçim aracını kullanarak bir hücreyi Anahat. </li><li> Aşağıdaki parametreleri ölçün: &#39;Alan, Entegre Yoğunluk&#39; ve &#39;Mean Gri Değeri&#39;. &#39;Analiz&#39; menüsünde bulunan &#39;Set Ölçümler&#39; fonksiyonunu kullanarak seçiniz parametreleri. NOT: Entegre Yoğunluk seçilmiş bölge içindeki tüm piksel yoğunluğunun toplamına karşılık gelir ve ortalama Gri Değer hücre boyutu yoğunluk değerlerini düzeltir [Entegre Yoğunluk / Alan], karşılık gelir. </li><li> &#39;Araçlar&#39; alt menüsü altındaki &#39;Analiz&#39; menüsünde bulunan YG Yöneticisi &#39;açın. ROI Manager penceresinde vurgulanır regio girmek için &#39;Ekle&#39; butonuna tıklayınn faiz (ROI) yeni bir bölge olarak. </li><li> Tekrarlayın görüntüde kalan hücreler için 5.6 ile 5.4 arasındaki adımları. Ve görüntünün kenarına dokunacak herhangi bir hücre; aydınlık / DIC ve floresan (Şekil 2F bkz ölü hücreler DIC görüntülerde koyu görünür ve GFP uyarma / emisyon ile inceledi autofluorescent sitoplazmik sinyal var) tarafından değerlendirilen herhangi bir ölü hücreleri hariç. YG Yöneticisi &#39;penceresinde&#39; Diğer &#39;düğmesini tıklayarak .zip dosyası olarak seçilen ROI&#39;ları kaydedin ve bir elektronik tablo veya istatistiksel analiz yazılımı tüm ölçümleri ihracat. </li><li> Kinetik tahliller miktarının (protokol 3) için, anahat ve adımları 5.4 ve 5.5 açıklandığı gibi ilk zaman noktasından bir hücreyi ölçün. Deneyde sonraki tüm zaman noktalarında ölçülmesi için aynı ROI kullanın. </li><li> Son nokta tahlilleri (protokolleri 2 ve 4), her bir durum için 30-50 hücre ölçüldüğünde en az. En az 2-3 görüntüler için ölçümü gerçekleştirin ve her tüm hücreleri dahilanalizinde adım 5.8 belirtilen kriterlere uygun görüntüsü. </li><li> Post hoc analiz için Tukey çoklu karşılaştırma testi ile takip tek yönlü ANOVA kullanılarak numuneler arasındaki istatistiksel anlamlılık değerlendirin. </li></ol> Akış Sitometrisi ile Mup1-pHluorin endositozun 6. Nüfus Analizi <ol><li> metionin ve plazmid seçimi muhafaza etmek için ilave amino asitler ya da besin eksik YNB 0.5 ml ortamda maya hücrelerinin (koloni başına çap olarak yaklaşık 2 mm) 2-3 koloniler inoküle. bir silindir tamburu üzerinde, 30 ° C&#39;de 16-24 saat boyunca 5 ml yuvarlak tabanlı tüplerde hücreleri büyütün. </li><li> Plazmid bakım metiyonin ve ilave amino asitler ya da besin eksik YNB ortamın 1.5 ml ilave edilir, ve bir silindir tambur üzerinde, fazladan bir 3 saat boyunca 30 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> Aktarım iki adet 5 ml&#39;lik yuvarlak dipli tübe hücre 1 mi. İlk tüp (Met koşul) için YNB Met orta 0.25 ml ekleyin ve YNB ortamı 0.25 ml 100 ug içeren/ Ml ikinci tüpe metionin 20 ug / ml (+ Met durum) bir son metionin konsantrasyonu elde edildi. bir silindir tamburu üzerine, 45 dakika boyunca 30 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Yük içselleştirme bir ölçüsü olarak, floresanlı bir izotiyosiyanat (FITC) filtresi bir hücre boyutu ölçümü ve Mup1-pHluorin floresan yoğunluğu olarak ortaya dağılım (FS) seçerek, akış sitometrisi ile analiz hücreleri. </li><li> Kullanılan maya hücrelerinin boyut aralığı ve floresan yoğunluğu için algılama optimize etmek için FS ve FITC kanallarının voltajını ayarlamak için kaydırıcı düğmelerini kullanın (Bu deneyler için kullanılan ayarlar FS 50 V ve FITC için 400 V idi). Not: her iki kanal için gerilim kullanılan akış sitometresi bağlı olarak değişecektir. Bu adım, daha önce ya da metionin (adım 6.3) ile 45 dakika işlemi sırasında yapılmalıdır. </li><li> yüksek akış hızı ayarı kullanarak, her bir durumda 10.000 hücreleri için FS ve floresan yoğunluğu ölçmek. fluo karşı FS bir dağılım grafiği oluşturmakyoğunluğu rescence: &#39;grafiği eklemek tıklayın FITC (x-ekseni) ve FS (y-ekseni) seçin ve grafik 1.000 puan (yazılım 10,000 hücre ölçüldü olsa bile, 1000 hücreleri değerlerini gösterecektir). NOT: maksimal tutarlılık için, hücreler metiyonin ilave edildikten sonra 45-50 dakika analiz; örneklerin çok sayıda içeren deneyler için, akış sitometri analizi için gerekli zamanı karşılamak için metionin ilave yalpalayarak. </li><li> Bir kontrol olarak, vahşi tip (WT) hücreler için Met ile + Met koşulları içerir. kapı fonksiyonunu kullanarak, parlak hücrelerin yaklaşık% 5&#39;i kapısının sağında düşmek öyle ki, WT + Met koşulunu kullanarak dikey bir kapı atayın. deneyde tüm diğer koşullar için bu yolluk kullanın. </li></ol>

The authors declare no competing interests.

Maya hücrelerinde endositik olaylar miktarının pHluorin uygulamaları floresan etiketi proteini (Şekil 1A) sitoplazmik kuyruğuna kaynaşık olduğu transmembran yüklerinin kullanır. pHluorin etiketi nötr ortamlara maruz kalan, ama pHluorin etiketi asidik koşullar karşılaştığında söndürülür haline olduğunda burada tarif edilen deneyler için, kargolar parlak floresan vardır. Böylece, pHluorin-etiketli endositik kargo kolayca plazma zarının sitoplazmik yüzüne ve erken endozomlard...

Veziküler trafik ökaryotik hücrelerde organel kimliği ve işlevini muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynar ve tek tek hücre bölümlerinde protein ve zar bileşimi düzenlemek için önemli bir mekanizmadır. endositoz yoluyla üretilen keseler daha sonra geri dönüşüm veya lizozoma hedefleme için yüzeyinden zar ve proteinleri uzaklaştırmak ise plazma membranında, ekzositik veziküllerin füzyon, hücrenin yüzeyine yeni proteinler ve membranlar sağlar. Bu nedenle, endositoz besin alımı ve hücre dışı ortama yanıtları için önemlidir. Ekzositoz ve endositoz plazma zarı yüzey alanı düzenleyen ve hasarlı proteinlerin ciro izin dengelenir. maya ve memeli hücrelerinde yapılan çalışmalar en çeşitli yanıt olarak bir endositoz katılan proteinlerin büyük sayıda, hem de belirli bir yükün içselleşmesini çerçevesinde çok endositik yollar ya da hareket belirledikvironmental koşullar. en iyi çalışılmış yol klatrin ve sitosolik yardımcı proteinleri oluşmakta endositik vezikül stabilize etmek için bir kaplama yapısına monte edildiği klatrin aracılı endositoz (STE) vardır. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae yapılan deneyler dinamikleri ve birçok endositik proteinler 1-3 için işe alım düzenine temel anlayışlar vermiştir. Özellikle, CME makine yüksek evrim boyunca muhafaza edilir maya STE ile ilişkili proteinlerin çoğunluğu, insan ortologlarını olduğu; böylece, maya tomurcuklanan yüksek ökaryotlarda korunmuş olan endositoz mekanizmalarını anlamak için önemli bir araç olmuştur. Örneğin, tomurcuklanan maya kullanılarak çalışmalar ek endositik aksesuar işe ardından CME yapılarının bu oluşumunu ve olgunlaşmasını (maya olarak kortikal aktin yamalar anılacaktır) Klatrin ve kargo bağlayıcı adaptör proteinleri ile başlayan, pek çok protein sıralı akınıdır tespit proteinler,ARP2 / 3-aracılı aktin polimerizasyonu aktivasyonu ve vezikül kesme 1,2 katılan proteinlerin işe. aktin yamaları kortikal için CME makine proteinlerinin İşe çok sipariş edilen ve basmakalıp bir süreçtir ve birçok protein için işe kesin sipariş CME makine diğer bileşenleri ile ilgili olarak kurulmuştur. Daha da önemlisi, son çalışmalar memeli hücrelerinde 4 Klatrin kaplı çukurlar CME proteinler için işe benzer bir düzen doğruladı. CME ek olarak, çok sayıda hücre tipleri, plazma zarının 5-7 vezikül oluşumu ve içselleşmesini teşvik etmek için alternatif mekanizmalar kullanan bir veya daha fazla klatrin bağımsız endositik (CIE) yollarına sahiptirler. Maya, biz son zamanlarda küçük GTPaz Rho1 ve aktive guanin nükleotid değişim faktörü (GEF), ROM1 8,9 kullanan bir CIE yolu belirledi. Rho1 aktin polimerizasyonu 1 teşvik formin Bni1 aktiveMaya 12 klatrin bağımsız endositoz bu formu için gerekli olan 0,11. Ayrıca, proteinlerin α-arrestin ailesi ubikitin ligaz Rsp5 CME 13-17 yoluyla kargo yayılmasını ve daha sonra içselleşmesini teşvik etmek ve aynı zamanda CIE 18 yer alan proteinlerle muhtemelen doğrudan etkileşim yoluyla, CIE yolu ile kargo içselleştirme teşvik işe. CIE yollarının çeşitli da Rho1 ortologunun, RhoA 9,19 kullanan klatrin bağımsız ve fagositik yollar dahil, memeli hücrelerinde mevcuttur. Memeli CIE RhoA rolü tam olarak anlaşılamamıştır; böylece, tomurcuklanan maya çalışmalar memeli CIE için geçerli olan ek mekanistik bakış açıları sağlayabilir. endositik olayların doğru ölçümü endositoz düzenleyen spesifik proteinlerin rolleri hakkında önemli bilgiler sağlayabilir ve kargo içselleştirme veya progressio mutasyonların etkilerini ortaya çıkarabilirendositik yolu ile n. Bu amaç için, biyokimyasal yöntemler ligand alımını izlemek ve endositik kargo proteinlerin degradasyon oranları ölçmek için kullanılabilir. canlı hücrelerinde, yeşil floresan proteininin (GFP) ve ilgi kargolara türevleri füzyon kargo taşımacılığı doğrudan görselleştirme izin verir. GFP (maya veya vakuol) lizozom bozulmaya dirençli olduğu Ancak, GFP etiketli yükler endositoz miktarının sınırlı kullanıma sahiptir. Ayrıca, GFP flöresanmm, pH değişiklikleri kısmen duyarlıdır ve 20,21 lümen vakuol içerisinde tespit olmaya devam etmektedir. Sonuç olarak, GFP etiketi floresan kargo kalan bozulmuş olup, kargo yoğunluğuna tüm hücre tabanlı miktar nedeniyle vakuol uzun vadeli GFP floresan yanlış olabilir süre sonra vakuol devam etmektedir. vakuolar GFP floresans sakıncaların üstesinden gelmek için, daha önce superecliptic pH kullandıluorin, nötr pH&#39;ta parlak bir floresant, ancak bu 20,22,23 Lizozom vakuol / lümeni gibi asidik ortamlarda flüoresans kaybeder GFP bir pH-duyarlı varyantı. Endositik kargolar sitoplazmik kuyruk bir pHluorin etiketi yerleştirme plazma membranında ve pHluorin etiket sitoplazmaya (Şekil 1A) maruz kalır erken endozomlardan üzerinde kargoların görselleştirme izin verir. Erken endozomlar, endozomun lümenine tomurcuk veziküller içine taşıma (ESCRT) makine paketleri yüzey lokalize kargolar için gerekli endozomal ayırma kompleksleri, üreten multiveziküler cisim (MVBs) 24 olgun olarak. İç MVB veziküller içine dahil edilmiştir kargolar için, pHluorin etiket vezikül lümenine doğru dönüktür. İç MVB veziküller asitlendirilirler; Onlar MVBs 20 içine olgun olarak böylece pHluorin-etiketli kargolar erken endozomlardan üzerinde floresan kaybedersiniz. vakuol ile MVB daha sonraki füzyon MVB lümen içeriğini teslimindirgenmesi için ve pHluorin etiketler vakuol lümeninin asidik ortamda söndürüldü kalır. Bu yazıda maya sitoplazmik pHluorin etiketleri ile kargoları kullanarak kantitatif endositik testlerin ayrıntılı açıklamalar sağlar. pHluorin etiketli yükleri sentezleyen cinsler, belirli yük özellikleri ve trafik davranışa bağlı olarak, kinetik ve / veya son nokta deneylerinde kullanılabilir. Buna ek olarak, bazı pHluorin-etiketli yüklerin akış sitometrisi içeren yüksek verimli analiz yöntemleri, elverişlidir. Önemli olarak, pHluorin etiketi, canlı hücrelerde endositik olayları incelemek endositoz ve vahşi tip ve mutant suşları endositik fonksiyonunun karşılaştırılması sayılmasına olanak tanıyan bir çok yönlü bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A8626-25G</td><td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Use for preparation of plate media</td></tr><tr><td>BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids)</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Use for preparation of liquid and plate media</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td>Use for coating of chamber slides</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>BP350-1</td><td>Use for preparation of liquid and plate media</td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Fisher</td><td>BP382-100</td><td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Acros</td><td>125121000</td><td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Fisher</td><td>BP386-100</td><td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Fisher</td><td>BP395-100</td><td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Acros</td><td>140641000</td><td>Use for preparation of amino acid mixture</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well)</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td></tr><tr><td>Axiovert 200 inverted microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Custom Build</td><td></td></tr><tr><td>100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Objective should be 100X, 1.4NA or higher</td></tr><tr><td>Sensicam</td><td>Cooke Corporation</td><td></td><td>Camera should have 12-bit or higher dynamic range</td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q Illumination Source</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5 software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

applications of phluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast

Yeşil floresan proteini (GFP) ve türevleri yaygın protein lokalizasyonu ve hücre iskeleti yeniden ve canlı hücrelerin veziküler kaçakçılığı gibi olaylar dinamiklerini incelemek için kullanılan araçlardır. Kimerik GFP füzyonu kullanılarak niceliksel yöntemler birçok uygulama için geliştirilmiştir; Ancak, GFP, proteoliz biraz dayanıklıdır böylece floresan endositik yolunda kargo ticareti ölçümü engelleyebilir lizozom / vakuol, devam etmektedir. endositoz sonrası endositik trafik olayları ölçülmesi için alternatif bir yöntem, superecliptic pHluorin, asidik ortamlarda söndürülür GFP bir pH-duyarlı bir varyantın kullanır. multiveziküler organları (MVBs) ve lizozom / vakuol lümene sunumuna kargo dahil edildikten sonra floresan nemlendirme transmembran Yük proteinleri sonuçlar sitoplazmik kuyruk pHluorin kimerik füzyon. Bu nedenle, vakuolar floresans söndürme quantifi kolaylaştırırendositoz ve endositik yolunda erken olayların katyon. Bu çalışma, floresan mikroskobu ile endositoz miktarının pHluorin etiketli yükleri yöntemler kullanılarak, hem de akış sitometrisi kullanılarak popülasyon bazlı tahliller açıklanmaktadır.

Yapısal içselleştirilmiş endositik kargo protein ste3 kararlı hal lokalizasyonu ve miktar canlı hücreler, ste3, maya a-faktör feromon alıcısının sitoplazmik bir C-terminal kuyruğu kimerik GFP ve pHluorin füzyonları lokalizasyonunda pHluorin-etiketli yükler endositoz ölçümü için kullanılabileceğini göstermek için, karşılaştırıldı. Ste3 kurucu bozulması 28 için vaküol...

Watch this Scientific Journal Video about Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast at JoVE.com

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

applications-phluorin-for-quantitative-kinetic-high-throughput

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Görüntüleme.  The Johns Hopkins University. Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Video: Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Nörobilim

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biyoloji

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

Vakuolar ve sitosolik pH Ölçümü<em&gt; In Vivo</em&gt; Maya hücre süspansiyonlarında

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Maya 4D mikroskopisi

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...