Name: the drosophila imaginal disc tumor model: visualization and quantification of gene expression and tumor invasiveness using genetic mosaics
Uploaded: 2016-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics at JoVE.com

We thank the Bloomington Stock Center (Bloomington, USA), Dirk Bohmann, Katja Br&#252;ckner and Istvan Ando for fly stocks, and antibodies. We thank Marek Jindra and Colin Donohoe for comments on the manuscript. This work was supported by the Sofja Kovalevskaja Award to M.U. from the Alexander von Humboldt Foundation and DFG project UH243/1-1 to M.U. from the German Research Foundation.

NOT: Bu çalışma eyFLP1 kullanır; hareket&gt; y +&gt; Gal4, UAS-GFP; FRT82B, küvet-GAL80 MARCM 82B Yeşil test hattı 11. Böyle w suşların erkeklere MARCM 82B Yeşil test bakireler Geçiş; UAS-a; UAS-b RNAi, FRT82B c mut genotip mitotik rekombinasyon 3. homolog kromozomların doğru kolları arasında oluşacak olan soy verecektir. Bu şekilde, FRT82B sitesine uzak bulunan gen c klonlar homozigot mutant EAD ve beyin neuroepithelium içinde oluşturulur. Bu klonlar gen b (Şekil 1A) için GFP, transgen a ve dsRNA&#39;larını ifade edecektir. X, 2L, 2R, 3L ve 3R üzerinde rekombinasyon için çeşitli eyFLP-MARCM test hatları kurulmuş ve sinek toplum içinde mevcuttur edilmiştir. 1. Fly Taşıma, Haçlar ve Evreleme <ol><li> Birden fazla bo doldurmamak oda sıcaklığında uygun MARCM test stok genişletmekAynı zamanda ttles. Bu yeterli bakireler sonraki haçlar için toplanan böylece her 2-3 günde bir taze şişeler içine yetişkin çevirin. NOT: bakireleri toplarken, bu kadın doğurganlığını uzlaşma olarak CO 2 için uzun süreli maruz kalmasını önlemek. </li><li> Deney ölçeğine bağlı olarak, en az 10 MARCM test bakire ve (örneğin, floresan gazetecilere ve immün görüntülenmesi için) ya da en az 30 bakireler ve 10 erkek (örneğin, için olan şişelerde 4 erkek kullanarak şişeleri sinek haçlar kurmak RNA izolasyonu ve invaziv ölçümü). </li><li> Uzun bir günün 16 saat / 8 saat ışık-karanlık döngüsü altında 25 ° C&#39;de soy kaldırın. larvaların tekrarlanabilir evreleme kolaylaştırmak ve aşırı kalabalık önlemek için yeni şişeler / şişelere her 24 saat anne çevirin. NOT: yumurtlama (AEL) gün sonra 6 başlayarak, geç üçüncü evre kontrol larvaları durdurma besleme, dolaşıp başlatmak ve pupariation girin. Buna karşılık, larva-pupa geçiş başlangıcı de olabilirkoydu veya EAD hiperplastik veya habis klonal tümörleri taşıyan ile larva varolmayan. </li></ol> 2. Üçüncü dönem larva Toplama <ol><li> immün için, yaklaşık 20 geç üçüncü evre larvaları (duvara dolaşan ve gıda karşılaştırılabilir vücut büyüklüğüne olanlar) toplamak. hafifçe şişe ya da viyal larvaları almak ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile doldurulmuş bir embriyo cam tabak içine aktarmak için forseps kullanır. <ol><li> RNA izolasyonu ve invaziv ölçümü için, en az 80 geç üçüncü evre larvaları (duvara dolaşan ve gıda karşılaştırılabilir vücut büyüklüğüne olanlar) toplamak. Yüzey kaplıdır kadar larvaları içeren bir sinek şişeye PBS fışkırtma bir bücür şişe kullanın. </li><li> Bir spatula ile yiyeceklerin üst katmanlarını yumuşatır ve bir Petri kabı içine larvaları içeren gıda püre dökün. Forseps kullanarak, hafifçe larvaları almak ve PBS ile dolu bir embriyo cam tabak içine aktarabilirsiniz. </li></ol></li><li> PBS UNT ile larvaları yıkayınIL artıklarını yiyecek kaynağı kaldırılır. Larva vücuda rasgele GFP pozitif noktalar (Şekil 2A, 2B ve görmek Tartışma Bölüm) taşıyan tüm &quot;leopar larvaları&quot; atmak için 16X büyütme 8 ile floresan stereomicroscope altında larvaları inceleyin. Not: RNA izolasyonu için 1 dakika için% 70 EtOH içinde sondan bir önceki yıkama aşamasını içerir. </li><li> diseksiyon kadar buz üzerinde PBS seçilen larvaları içeren çanak yerleştirin. 30 dakika içinde süreç larva soğuk ve açlık olumsuz etkilerini önlemek için. </li></ol> Larva 3. diseksiyonu <ol><li> Bir stereomikroskop altında EAD incelemek için, yavaşça cam çanak alt karşı larva orta kısmı basın forseps bir çift kullanın. İkinci forseps ile larva ağız kanca kapmak ve vücuttan (Şekil 2C) onları çekin. NOT: çekme kuvveti EAD pai bağlayan optik saplarını kırmak için çoğu zaman yeterlidirBeyin lobları r. Beyin veya parçaları EAD bağlı kalmak ve mevcudiyeti uygulamalar için arzu edilen ise, forseps iki çift bir yardımıyla optik sapları kesti. (Örneğin, ras V12 Scrib 1) EAD ve beyin lobları arasındaki bağlantı giderek overgrowing ve klonal hücrelerin göçmen zamanla gizlenmiş olur invaziv tümörlerde. <ol><li> Bozulmamış bir ventral sinir kablosu (VNC) (Şekil 2B) ile EAD / beyin kompleksini hazırlamak için, vücudun ortasında bir larva kesmek için forseps kullanabilir. arka yarısını atın. </li><li> Bir forseps uçları arasındaki larva vücudunun ön yarısını tutun ikinci forseps ucu ile ağız kanca iterek ve ilk forseps çifti ile üzerine manikür yuvarlayarak larva içten dışa çevirin. </li></ol></li><li> Dikkatle EAD çifti bırakarak tüm yabancı dokuları (örn, tükürük bezleri, yağ vücut ve gut) kaldırmak veya forseps kullanmaağız kanca bağlı EAD / beyin kompleksi. üstteki manikür ağız kanca disentangle. Vücut kaslarının ve epidermis (Şekil 1B, 2C, 2D) kadar uzanan aksonal projeksiyonları kesilmesinin VNC ücretsiz. NOT: Ağız kancalar forseps ile doku güvenli manipülasyon için izin ve yıkama sırasında dokuda daha verimli batan ve kolay tanınmasını kolaylaştırmak. PBS içinde sabitlenmemiş tutulduğunda nispeten hızlı EAD değişim morfolojisi disseke. 20-30 dk diseksiyon zamanı sınırlayın. </li><li> doku aktarmak için, kat kalan vücudu pipetleme bir P20 mikropipet ucu yukarı ve aşağı birkaç kez nakli. Büyük EAD / beyin kompleksleri aktarmak için, makasla P20 mikropipet ucu kesilmiş. Not: kaplama işlemi, aktarım sırasında yapışmasını ve çıkartılan doku kaybını önlemek için önemlidir. Bir P20 mikropipet kullanımı istenmeyen sınırlayıcı seyreltme, fiksatif çözelti içine PBS transferini en aza indirir. <ol><li> immün için transfer400 ul% 4 paraformaldehit (PFA) sabitleyici ile dolu bir 0.5 ml&#39;lik bir tüp içine EAD kesilir. Daha büyük EAD için 1 ml PFA 1.5 ml tüp kullanın / beyin kompleksleri invazivliğinin puanlama için geliyordu. DİKKAT: PFA son derece toksiktir. Koruyucu eldiven ve giysiler giyin. cilt, göz veya mukoza ile temasından kaçının. </li><li> RNA izolasyonu için, soğuk PBS ile dolu yeni bir cam tabak içine parçalara EAD aktarın. Örnek kirliliklerinin en aza indirmek için, halka ve lenf bezlerinden EAD temizlemek için forseps kullanabilir. </li><li> Forseps (Şekil 2E) kullanılarak anten diskler ve ağız kanca arasındaki bağlantıyı kesilmesinin ağız kancaları EAD ayırın. RNA bozulmasını ve gen sentezleme bozulmaları önlemek için, 30 dakika için diseksiyon zaman sınırı. 7. adıma geçin. NOT: Deneyimli bir araştırmacı larva toplama ve yıkama için gerekli 30 dakika hariç zaman içinde yaklaşık 60 larva incelemek olabilir. Toplam RNA verim genotipleri ve developmentÃ arasında değişir EAD büyüklüğüne bağlıdırl aşamaları. geç üçüncü evre larvaları 80-100 kontrol EAD çiftlerinin Diseksiyon 5-8 ug toplam RNA boyun eğmek zorundadır. </li></ol></li></ol> 4. Sabitleme, immün ve Montaj <ol><li> Oda sıcaklığında nutating ise 25 dakika süreyle PFA fiksatif örnekleri sabitleyin. sabitleme süresi doku morfolojisi ve proteinlerin antijenitesini değiştirmeden 60 dakikaya kadar uzatılabilir. </li><li> Nutator kullanılarak 10 dakika boyunca üç kez (% 0.1 Triton X-100 içeren PBS) PBST ile tespit edici ve yıkama örnek alabilir. Her yıkama adımı (400 ul / 0.5 ml tüp) için PBST yeterli hacmi kullanın. NOT: Sabit EAD / beyin kompleksleri immün gerekmez invazivliğinin puanlama için geliyordu. GFP sinyali tespit sonrasında iyice görünür kalır. Nihai diseksiyon için 4.4 adıma geçin. <ol><li> immün, oda sıcaklığında yumuşak çalkalama ile 20 dakika boyunca (% 0,3 BSA ile PBST) bir bloke edici çözeltisi 200 ul blok dokusu. <ol><li> prim ile inkübehafifçe çalkalayarak li antikorlar, 4 ° C&#39;de bir gece boyunca bir blokaj çözeltisinin 100 ul seyreltilmiş. Önerilen antikor seyreltme için birincil antikor veri sayfası veya yayınlanmış literatüre bakın. NOT: Primer antikor seyreltme optimize edilmesi gerekebilir. </li><li> yavaşça karanlıkta 4 ° C de bir gece boyunca, oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalkalanarak ya da PBST içinde beş ila 10 dakika yıkama sonrasında, floresan ikincil antikorlarla leke doku çözüm engelleme seyreltilmiştir. </li><li> Yıkama numuneleri üç kez PBST içinde 10 dakika. </li></ol></li></ol></li><li> DAPI-boyama çözeltisi 500 ul PBST değiştirin. F-aktin etiketlemek için, DAPI lekelemesi çözeltisine floresan boya konjuge Phalloidin ekleyin. Karanlıkta 15 dakika nutation sonra PBST ile 10 dakika boyunca bir kez doku yıkayın. Not: F-aktin etiketleme DAPI lekelemesi bağımsız yapılabilir. </li><li> Nihai diseksiyon adım için, 1 ml pi kullanarak PBS dolu cam tabak içine geri doku transferiPette. ağız kanca off klibi forseps iki çift kullanma. <ol><li> analizi engel olabilecek büyümüş EAD olarak optik sap keserek EAD gelen invazivlik ölçümü için kullanılacak beyinleri ayırın. </li></ol></li><li> objektif sürgü üzerine monte edilen orta bir damla (22 mm x 22 mm&#39;lik bir örtücü cam için 15 ul) yerleştirin. forseps ipuçları sayesinde, ince bir tabaka halinde orta dağıtın. Bir P20 mikropipet ile montaj ortama EAD, beyin veya EAD / beyin kompleksleri aktarın. </li><li> doku dağıtmak ve slayt VNC düzeltmek için forseps ipuçları veya tungsten çubuk kullanın. </li><li> Montaj sırasında kabarcık, ilk tarama bir montaj ortamına lamel kenarı ve forseps yardımıyla monte ortamı üzerine yavaşça düşük oluşumunu önlemek için. lamel kenarlarında aşırı montaj orta emmek için silme filtre kağıdı ya da doku küçük parçalar kullanın. Not: DABCO / Poli (vinil alkol) 4-88 montaj orta sertleşirbir saat içinde, 4 ° C&#39;de. Slaytlar, 4 ° C &#39;de ay depolanabilir. </li></ol> 5. Konfokal Görüntüleme <ol><li> 20X, 40X ve 60X petrol hedefleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanılarak tek konfokal bölümleri ve yığınlarını edinin. </li><li> piksel doygunluk önlemek. Ofset görüntü çözünürlüğü, lazer giriş gücü, kazanç, çerçeve ortalama alma, z-serisi bir adım boyutu dahil, aynı görüntü elde etme parametrelerini kullanın ve farklı genotipleri 21,22 arasında piksel yoğunluğunun karşılaştırmalar için izin tüm genotiplerde bu ayarları korumak. NOT: EAD / beyin kompleksinin görselleştirme için maksimum projeksiyonlar üretmek ve ilgili komşu görüntüleri dikiş. Son görüntü hazırlanması için, panel montajı için yazılan görüntü işleme yazılımı kullanmak ve parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için. </li></ol> Tümör yayılmasını 6. sayısallaştırılması <ol><li> Tümör invasivenes farklı düzeylerde karakterize edecek bir puanlama sistemi tanımlamakistilası uzamsal desen ve beyin ve VNC yayılmasını GFP pozitif hücrelerin miktarı göz önüne alındığında bu. Belgeler (Şekil 3A) için değerlendirme sayfaları hazırlayın. </li><li> Montaj en az 80, 24 mm x 50 mm&#39;lik bir örtücü cam başına montaj orta 40 ul kullanılarak bir slayt her genotip için sağlam beyin sabit. <ol><li> tarafsız puanlama izin vermek için, puanlama prosedürü tarafsız böylece, slaytlar anonim bir nötr bir parti istiyoruz. bağımsız iki laboratuvar üyeleri tarafından anonim slaytlar değerlendirin. sayma bittikten sonra genotipleri ifşa. </li></ol></li><li> GFP filtre seti ile donatılmış bir floresan stereomikroskopta altına monte beyinleri kör skorlama ile malignite derecesi değerlendirin. Zaten çift sayımı (Şekil 3B) önlemek için incelendi var beyinleri etiketlemek için bir işaretleyici kullanın. </li><li> genotip başına tanımlanan invaziv kategorilerin her düşen beyinleri yüzdesini hesaplayın. İstatistiksel s belirleyinignificance bir ki-kare testi (Şekil 3C) kullanarak. </li></ol> 7. RNA İzolasyon, DNaz Tedavi ve Kalite Kontrol Not: Aşağıdaki adımlarda kullanılan tüm reaktifler (çözeltiler, plasticware) RNaz etkinliğinin arındırılmış olmalıdır. Her zaman eldiven giyin ve organik çözücüler ile çalışmak için bir kimyasal kaputu kullanın. <ol><li> 1.5 ml tüp içine kaplanmış P20 mikropipet ucu ile temiz EAD aktarın. </li><li> tüpün dibine doku lavabo edelim, dikkatlice PBS kaldırmak ve 100 ul RNA parçalama reaktifi (en fazla 140 EAD için yeterli) ile değiştirin. </li><li> vorteks Lyse doku. Bu noktada, örnekleri, sıvı nitrojen içinde dondurulur, derin ve -80 ° C&#39;de saklandı veya doğrudan standart RNA izolasyon protokolü ile işlenmiş olabilir. NOT: Birden fazla diseksiyon mermi benzer genotiplerin örnekleri RNA parçalama reaktifi kez toplanmış olabilir. </li><li> RNA parçalama reaktifi ile 0.9 ml örnek hacmi doldurun. kloroform 0,2 ml ilave edilir ve Vigoro örnekleri karıştırın15-20 saniye usly. </li><li> Oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika inkübasyondan sonra, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj örnekleri. </li><li> interfaz bozmadan yeni bir tüp içine renksiz üst sulu faz içeren RNA aktarın. proteinleri ve genomik DNA içerdiği uzak interfaz uzak durun. Not: geri kazanılan birim homojenizasyon için kullanılan RNA liziz reaktifi hacminin yaklaşık% 60 olması gerekmektedir. </li><li> izopropil alkol, 0.5 ml ilave edilerek RNA hızlandırabilir. Vorteks ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri. </li><li> Süpernatantı atın ve% 75 etanol 600 ul kez RNA pelet yıkayın. Kısa bir girdap ve santrifüj (4 ° C&#39;de 7 dakika boyunca 10,000 x) Sonuçta etanol atmak ve 5-10 dk temiz bir kağıt mendille silin açık tüp yerleştirmek için RNA pelet hava kurumaya bırakın. NOT: RNA pelet küçük opak beyaz / st olarak görünür olabilirtüp veya görünmez dibinde olgun. Kalan etanol damla dikkatle P10 mikropipet ucu ile temizlenebilir. </li><li> bir pipet ucu ile bir kaç kez vorteks ya geçirilmesiyle DEPC ile muamele edilmiş su 50 ul RNA çözülür. </li><li> genomik DNA ile kirlenmesini en aza indirmek için, DNase 1 ul (2 U / ml) ve DEPC ile muamele edilmiş su içinde 10 x DNaz tamponu 10 ul ihtiva eden bir karışım, 50 ul ekleyerek DNaz ile total RNA tedavi. Vortex ve aşağı doğru döndürün. </li><li> bir su banyosu ya da 30 ila 40 dakika için bir ısıtma bloğu içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir numune içine DEPC ile muamele edilmiş su, 100 ul ilave edin. </li><li> DNaz gelen enzimatik aktivitesi ve temiz RNA inaktive fenol 200 ul için: 4 ° C&#39;de 7 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de 1 dakika santrifüj için numune çözeltisi, girdap kloroform: izoamil alkol (1: 25: 24). </li><li> Dikkatle yeni bir tüp içine RNA içeren üst sulu faz transfer. eşit hacim ekleme (200 ul)kloroform, mix ve yukarıdan santrifüj adımı tekrarlayın. </li><li> Dikkatli bir şekilde, üst fazı toplayın ve 3 M sodyum asetat ve 1/10 hacimde eklenmesiyle RNA çökeltilmesi, pH 5.2% 100 etanol DEPC H2O ve 2.5 hacim hazırlandı. vorteks ile iyice karıştırın. NOT: Bir yağış karışımı 0.5 ul glikojen (20 mg / ml) ekleme RNA pelet görselleştirmek için yardımcı olur. silikonlu düşük bağlayıcı 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kullanarak, RNA kaybı en aza indirmek. </li><li> en az 1 saat boyunca -20 ° C&#39;de RNA hızlandırabilir. Not: inkübasyon gece boyunca sürdürülür. Örnekler hem -80 ° C &#39;de yerleştirilebilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj ile pelet RNA. Yıkayın ve 7.9 açıklamasında şu kuru pelet. </li><li> DEPC ile muamele edilmiş su 10-15 ul RNA eritin. -80 ° C&#39;de saklayın RNA. </li><li> 230 nm, 260 nm ve bir spektrofotometre kullanılarak 280 nm&#39;de OD ölçümü ile RNA miktarı ve saflık belirler. RNA co hesaplayınkongre uygulayarak ncentration 40 ug / ml RNA eşit nm 260 1 OD söyledi. Not: A 260/230 oranı 2.0-2.2 aralığı içinde olması gerekirken &quot;saf&quot; RNA nın bir 260/280 oranı 2.0 eşittir. 1.7 ve 2.0 arasında bir bir 260/280 oranı RNA örnekleri örneğin cDNA sentezi alt uygulamalar için uygundur. mRNA DİZİ kütüphanelerinin hazırlanması için RNA niteliği ve miktarı, otomatik bir elektroforez sistemi kullanılarak kontrol edilmelidir. 28S / 18S oranı 1.8 üzerinde olmalıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila.">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li><li>Stefanatos, R. K. A., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila:+a+bold+past,+a+bright+future.">Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future.</a> J Genet Genomics. 38 (10), 431-438 (2011).</li><li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+design:+How+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood.">Tissue design: How Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li><li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics.">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24 (5), 251-254 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila.">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+in+Drosophila.">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2583-2589 (2006).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila.">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li><li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior.">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science (New York, NY). 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li><li>Uhlirova, M., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK-+and+Fos-regulated+Mmp1+expression+cooperates+with+Ras+to+induce+invasive+tumors+in+Drosophila.">JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila.</a> EMBO J. 25 (22), 5294-5304 (2006).</li><li>Turkel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BTB-zinc+finger+transcription+factor+abrupt+acts+as+an+epithelial+oncogene+in+Drosophila+melanogaster+through+maintaining+a+progenitor-like+cell+state.">The BTB-zinc finger transcription factor abrupt acts as an epithelial oncogene in Drosophila melanogaster through maintaining a progenitor-like cell state.</a> PLoS Genet. 9 (7), e1003627 (2013).</li><li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+Diverts+a+Host+TNF+Tumor+Suppressor+Activity+into+Tumor+Promoter.">Oncogenic Ras Diverts a Host TNF Tumor Suppressor Activity into Tumor Promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li><li>Khoo, P., Allan, K., Willoughby, L., Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Drosophila,+RhoGEF2+cooperates+with+activated+Ras+in+tumorigenesis+through+a+pathway+involving+Rho1-Rok-Myosin-II+and+JNK+signalling.">In Drosophila, RhoGEF2 cooperates with activated Ras in tumorigenesis through a pathway involving Rho1-Rok-Myosin-II and JNK signalling.</a> Dis Model Mech. 6, 661-678 (2013).</li><li>Jiang, Y., Scott, K. L., Kwak, S. J., Chen, R., Mardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sds22/PP1+links+epithelial+integrity+and+tumor+suppression+via+regulation+of+myosin+II+and+JNK+signaling.">Sds22/PP1 links epithelial integrity and tumor suppression via regulation of myosin II and JNK signaling.</a> Oncogene. 30 (29), 3248-3260 (2011).</li><li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+Drosophila+Tumors+Interrupt+Insulin+Signaling+to+Induce+Cachexia-like+Wasting.">Malignant Drosophila Tumors Interrupt Insulin Signaling to Induce Cachexia-like Wasting.</a> Dev Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li><li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics.">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127 (4), 851-860 (2000).</li><li>Quiring, R., Walldorf, U., Kloter, U., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+of+the+eyeless+gene+of+Drosophila+to+the+Small+eye+gene+in+mice+and+Aniridia+in+humans.">Homology of the eyeless gene of Drosophila to the Small eye gene in mice and Aniridia in humans.</a> Science. 265 (5173), 785-789 (1994).</li><li>K&#252;lshammer, E., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+cross-linker+Filamin/Cheerio+mediates+tumor+malignancy+downstream+of+JNK+signaling.">The actin cross-linker Filamin/Cheerio mediates tumor malignancy downstream of JNK signaling.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 4), 927-938 (2013).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li><li>Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+cell+polarity+drives+tumor+growth+and+invasion+through+JNK+activation+in+Drosophila.">Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila.</a> Curr Biol. 16 (11), 1139-1146 (2006).</li><li>K&#252;lshammer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+among+Drosophila+transcription+factors+Ets21c,+Fos+and+Ftz-F1+drives+JNK-mediated+tumor+malignancy.">Interplay among Drosophila transcription factors Ets21c, Fos and Ftz-F1 drives JNK-mediated tumor malignancy.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1279-1293 (2015).</li><li>Pastor-Pareja, J. C., Wu, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+innate+immune+response+of+blood+cells+to+tumors+and+tissue+damage+in+Drosophila.">An innate immune response of blood cells to tumors and tissue damage in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 144-154 (2008).</li><li>Chatterjee, N., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+&#934;C31+based+reporter+system+for+measuring+AP-1+and+Nrf2+signaling+in+Drosophila+and+in+tissue+culture.">A versatile &#934;C31 based reporter system for measuring AP-1 and Nrf2 signaling in Drosophila and in tissue culture.</a> PloS One. 7 (4), e34063 (2012).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva.">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li><li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva.">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemese,+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein,+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila.">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li><li>Andersen, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+TNF+receptor+Grindelwald+couples+loss+of+cell+polarity+and+neoplastic+growth.">The Drosophila TNF receptor Grindelwald couples loss of cell polarity and neoplastic growth.</a> Nature. 522 (7557), 482-486 (2015).</li><li>Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+remodeling+is+essential+for+Drosophila+disc+eversion+and+tumor+invasion.">Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (8), 2721-2726 (2007).</li><li>Larionov, A., Krause, A., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standard+curve+based+method+for+relative+real+time+PCR+data+processing.">A standard curve based method for relative real time PCR data processing.</a> BMC Bioinformatics. 6 (1), (2005).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development.">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130 (21), 5065-5072 (2003).</li><li>Mirth, C. K., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+body+and+organ+size+in+Drosophila:+recent+advances+and+outstanding+problems.">Integrating body and organ size in Drosophila: recent advances and outstanding problems.</a> Front Endocrinol. 3 (49), (2012).</li><li>French, V., Feast, M., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+size+and+cell+size+in+Drosophila:+the+developmental+response+to+temperature.">Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature.</a> J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).</li><li>Ashburner, M., Bonner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+gene+activity+in+drosophila+by+heat+shock.">The induction of gene activity in drosophila by heat shock.</a> Cell. 17 (2), 241-254 (1979).</li><li>Frazier, M. R., Woods, H. A., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+rearing+temperature+and+oxygen+on+the+development+of+Drosophila+melanogaster.">Interactive effects of rearing temperature and oxygen on the development of Drosophila melanogaster.</a> Physiol Biochem Zool. 74 (5), 641-650 (2001).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>del Valle Rodr&#236;guez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila.">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2011).</li><li>Rynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Transcription+Factor+3+Regulates+Immune+and+Metabolic+Homeostasis.">Activating Transcription Factor 3 Regulates Immune and Metabolic Homeostasis.</a> Mol Cell Biol. 32 (19), 3949-3962 (2012).</li><li>Claudius, A. K., Romani, P., Lamkemeyer, T., Jindra, M., Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+role+of+the+steroid-deficiency+protein+ecdysoneless+in+pre-mRNA+splicing.">Unexpected role of the steroid-deficiency protein ecdysoneless in pre-mRNA splicing.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004287 (2014).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li><li>Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+intestinal+stem+cells+from+adult+Drosophila+midguts+by+FACS+to+study+stem+cell+behavior+during+aging.">Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no conflict of interest.

Teknikler Drosophila genetik mozaikler analiz ve gen fonksiyonu 33 işlemek için en gelişmiş araçlar arasında yer almaktadır oluşturmak için. O gözsüz arttırıcı aktif 9,18 olan dokularda, yani mekansal kısıtlı bir şekilde görsel olarak işaretlenmiş, genetik olarak tanımlanmış klonların indüksiyon izin verdiği eyFLP-MARCM sistemi güçlü ve sağlam olduğunu kanıtlamıştır. Birden çok genetik lezyonlar aynı hücrelerde birleştirilir, bu öz...

Kanser insidans ve mortalite önemli ölçüde dünya çapında, özellikle yaşlılarda, artan hastalıkların en genetik olarak heterojen bir grup, birini temsil eder. Kanser doğasında tümör baskılayıcı mekanizmalarını kaçar ve kontrol dışı bölen bir tümör başlatan hücre klonal kaynaklanır. ölüm ve farklılaşmasını inhibe ederken işbirliği büyüme, çoğalma ve motilitesini teşvik genetik lezyonların kademeli birikimi yüksek, malign metastatik ve ölümcül tümör içine ilk selim üremesine dönüştürür. Bu genetik değişikliklerin yanı sıra, tümör ilerlemesi olan mikro-tümör ve çok sayıda hücre türleri (örneğin, fibroblastlar, immün ve endotel hücreleri) arasındaki çevre stroma ve çapraz-karışma değişiklik gerektiren belirgin hale gelmiştir. tümör stroma etkileşimleri de dahil olmak üzere malign transformasyon altında yatan moleküler ilkelerinin anlaşılması PREVEN geliştirmek için büyük önem taşıyoryon ve erken tarama stratejilerinin yanı sıra, yeni ve etkili tedavi, kanser metastazı ve ilaç direncine karşı koymak. Meyve sineği Drosophila Melanogaster&#39;in onun hızlı nesil zaman nedeniyle kanser araştırmaları 1-4 için çekici bir sistem haline gelmiştir sinekler ve insanlarda, hemen hemen herhangi bir genin işlenmesini kolaylaştıran gelişmiş genetik araçları sınırlı genetik yedekleme ve zenginlik arasındaki düğümleri sinyal olağanüstü koruma bir geçici ve mekansal kısıtlı bir şekilde. Değişen malignite genetik olarak tanımlanmış tümörler tekrarlanabilir MARCM tekniği 5 kullanan bir başka vahşi tip dokusunda progenitörlerin bir alt kümesi gain- ve zarar-fonksiyon mutasyonlar tanıtarak Drosophila tasarlanmış olabilir. MARCM aracı FLP / FRT (FLP rekombinaz / FLP Tanıma Hedef) FLP-out 7 ve Gal4 / UAS (yukarı aktivasyon dizisi) 8 hedef geni ile mitoz rekombinasyon 6 aracılı birleştiririfade sistemleri 9. dsRNA&#39;nın indüklenen gen susturma onkogen ya da floresan proteini cDNA ya ters çevrilmiş DNA Tekrarlar dahil olmak üzere herhangi UAS göre transgenin bu yöntem ifade ile, spesifik bir genetik yeri ve rekombinasyon nedeniyle bir GAL4 represörü kaybetmiş bir hücre klonu ile sınırlı olacak (Şekil 1A). Klon yamalar yeşil floresan (GFP) veya kırmızı floresan proteinleri ile işaretlenmiş (örneğin, RFP, DsRed, mCherry) kolayca geliştirme, izole ve analiz boyunca izlenebilir. Önemli olarak, onların davranışları doğrudan bitişik vahşi tip dokuya karşılaştırılabilir. Böylece, sorular genetik lezyonların özerk ve özerk olmayan etkiler rahatlıkla ele alınabilir hücreye formüller verilmiştir. Memelilere benzer şekilde, sadece klonları olan çoklu onkojenik lezyonlar Drosophila malign olmak ve memeli kanser kilit işaretlerinden özetlemek kombine edilir. Onlar, apoptoz kaçmasına enflamasyon neden, ölümsüz ve InvAn haline overproliferatesive, sonuçta ev sahibi 10-17 öldürme. Burada, bir protokol MARCM tekniği kullanılarak Drosophila larvalarının göz / anten ve beyin dokusunda genetik olarak tanımlanmış klonal tümörler oluşturmak için tarif etmektedir. Yöntem, eyeless arttırıcı (eyFLP) 18,19 kontrolü altında maya FLP yeniden bağlayıcı ifade eden bir MARCM test hisse senetleri dayanır. Bu şekilde, GFP etiketli klonlar peripodial ve kolumnar EAD epiteli ve embriyonik ve larva aşamaları (Şekil 1A, B ve referans 20) boyunca beynin neuroepithelium hem de oluşturulur. neuroepithelium farklılaştırılmış optik lob nöronlar üreten neuroblasts doğurmaktadır EAD yetişkin göz, anten ve baş kapsül içine geliştikçe klonlar kolayca yetişkinliğe kadar takip edilebilir. Biz de mozaik doku geniş, moleküler fonksiyonel ve fenotipik karakterizasyonu kolaylaştırmak içinçubuk üçüncü instar larvaları EAD ve beyin diseksiyon için bir protokol ve üç farklı uygulamalar için işleme nasıl özetlemektedir: (i) transgenik flüoresan muhabir ve immün saptanması, tümör yayılımı ve (iii) analizi, (ii) ölçümü gen ekspresyon kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) veya yüksek verimli bir mRNA sıralaması (mRNA DİZİ) (Şekil 1C) ile değiştirir. immün protokolü spesifik bir antikor ile çıkar proteini görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Transgenik floresan transkripsiyonel gazetecilere belirli bir sinyal yolunun aktivitesi üzerine uygun ve kesin uzaysal bilgi sağlar. Hücre soyu, belirli muhabir, diğer taraftan, mozaik doku içinde ve farklı genotipler tümörleri arasında hücre popülasyonlarının niteliksel ve niceliksel değişiklikler göstermektedir. invaziv davranış miktarının belirlenmesi genotipi arasındaki tümör malignite karşılaştırılmasını kolaylaştırırs. Son olarak, RNA izolasyonu için mozaik EAD toplanması ve işlenmesi tarif protokolü, sırasıyla QRT-PCR ve genom mRNA SEQ, ardından ters transkripsiyon hem küçük hem de büyük ölçekli alt uygulama için uygundur. Bu analizler sonucu elde edilen nitel ve nicel veriler klonal tümörlerin sosyal davranış içine yeni bakış açıları sağlayacaktır. Ayrıca, bireysel genler, genetik ağları ve farklı aşamalarında tümör mikro ve tümörogenez yönleriyle rolü üzerine fonksiyonel çalışmalar için sağlam bir temel oluşturur.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Gew&amp;uuml;rzm&amp;uuml;hle Brecht, Eggenstein, Germany</td><td>00262-0500</td><td>Fly food recipe: Prepare 20 L fly food with 160 g agar, 360 g yeast, 200 g soy flour, 1.6 kg yellow cornmeal, 1.2 L malt extract, 300 ml light corn syrup, 130 ml propionic acid and 200 ml 15% nipagin. Fly food should be cooked for 1 hour at 85&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Corn syrup</td><td>Grafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>Cornmeal</td><td>ReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany</td><td>4010155063948</td><td></td></tr><tr><td>Malt extract</td><td>CSM Deutschland GmbH, Bremen, Germany</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>Soy flour</td><td>Stockmeier Food GmbH, Herford, Germany</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Werner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-4-benzoate/ Nipagin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>H5501</td><td>Prepare a 15% stock solution with 70% EtOH</td></tr><tr><td>Drosophila fly food vials</td><td>Kisker Biotech, Steinfurt, Germany</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>Vial plugs</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila fly food bottles</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>Bottle plugs</td><td>K-TK e.K., Retzstadt, Germany</td><td>1002 S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CHOH-]&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>81381</td><td>Mounting medium recipe: Dissolve 6 g Poly(vinyl alcohol) 4-88 in 39&amp;nbsp;ml Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 6 ml 1 M Tris (pH 8.5) and 12.5 ml glycerol. Stir overnight at 50&amp;nbsp;&amp;deg;C and centrifuge 20&amp;nbsp;min at 5,000 rpm. Add DABCO to the supernatant to get a final concentration of 2.5%. Store aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane/ DABCO&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline/ PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4 in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde/ PFA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>158127</td><td>4% PFA fixative recipe: Dissolve 4&amp;nbsp;g PFA in 80 ml Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O on a magnetic stirrer plate heated to 55&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add 1 M NaOH dropwise until all PFA particles are dissolved. Add 10 ml 10x PBS and adjust the pH to 7.4 with 1 M HCl. Mix in 100 &amp;micro;l Triton X-100 and fill up with Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml. Store aliquots at -20 &amp;deg;C. Avoid repeated thawing. (CAUTION: PFA is highly toxic. Prepare the PFA fixative in a fume hood. Wear a self-contained breathing apparatus, gloves and clothing. Avoid contact with skin, eyes or mucous membranes.)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin/ BSA</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>A3059</td><td>Blocking solution recipe: Dissolve 0.3% BSA in PBST</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled phalloidin</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Molecular Probes</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>Phalloidin stock solution: Dissolve powder (300 U) in 1.5 ml Methanol. Store at -20 &amp;deg;C. For staining, use in dilution 1:250 (A12379, A22283) and 1:100 (A22284) in PBST.</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindol Dihydrochlorid/ DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335</td><td>DAPI staining solution: Prepare a stock solution of 5 mg/ml in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and store aliquots at 4 &amp;deg;C. Used in dilution 1:1,000 in PBST.</td></tr><tr><td>Mouse anti-H2 antibody</td><td>Kurucz et al., 2003</td><td></td><td>Used in dilution 1:500 in blocking solution</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK</td><td>715-175-151</td><td>Used in dilution 1:500 in blocking solution</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass embryo dish (30&amp;nbsp;mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needles</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gl&amp;auml;ser)</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 50 mm (0.13-0.16&amp;nbsp;mm)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Precision Wipes</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereomicroscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>SZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>SZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD camera</td><td>Equipped with the narrow blue bandpass filter set for excitation of GFP other blue excitable fluorochromes (excitation filter BP460-480 nm, barrier filter BA495-540 nm) and narrow green excitation and longpass barrier filter for RFP and other green excitable fluorochromes (excitation filter BP530-550, barrier filter BA575IF). Software: Olympus cellSens Standard 1.11.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td>FV1000</td><td>Equipped with inverted IX81 microscope. Objectives: 20&amp;times; UPlan S-Apo (NA 0.85), 40&amp;times; UPlanFL (NA 1.30) and 60&amp;times; UPlanApo (NA 1.35). Lasers: UV laser Diode LD405 (50&amp;nbsp;mW), Argon laser, multi-line 457/(476)/ 488/515 (40&amp;nbsp;mW), Yellow/Green laser diode LD560 (15&amp;nbsp;mW) and Red Laser diode 635 (20&amp;nbsp;mW). Software: Fluoview 2.1c Software</td></tr><tr><td>Drosophila cooled incubator</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany</td><td>&amp;nbsp;Sanyo MIR553</td><td></td></tr><tr><td>Squirt bottle</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>215-8105</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams Nutator Mixer</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>ELMI Digital Rocking Shaker</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>DRS-12</td><td></td></tr><tr><td>5 PRIME Isol-RNA Lysis Reagent</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>2302700</td><td>The protocol is compatible with other TRIzol-based reagents, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, TRIreagent from Sigma (Cat. Nr.T9424), TRIzol reagent from Thermofisher (Cat. Nr. 15596).</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate/ DEPC</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>D5758</td><td>Dilute DEPC 1:1,000 in Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, stir overnight and autoclave.</td></tr><tr><td>UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U/&amp;micro;l)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Glycogen</td><td>ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany</td><td>10-814-010</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate trihydrate</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>27652.232</td><td>Prepare a 3 M Sodium acetate solution with DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust the pH to 5.2</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>100983</td><td>Prepare a 75% EtOH dilution with DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>UV/Vis-Spectrophotometre NanoDrop ND-8000</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Experion RNA StdSens Analysis Kit</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>7007103</td><td></td></tr><tr><td>Experion Automated Electrophoresis Station</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>7007010</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) Primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>Prepare 100 &amp;micro;M stock solutions in DEPC-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dNTP Mixture</td><td>Takara Bio Europe/Clonetech, Saint-Germain-en-Laye, France</td><td>4030</td><td>Store aliquots of 25 &amp;micro;l at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wall</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;B&#039; Film</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rp49&lt;/em&gt; Forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rp49&lt;/em&gt; Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mmp1&lt;/em&gt; Forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mmp1&lt;/em&gt; Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies, Leuven, Belgium</td><td></td><td>5&#039; ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3&#039;</td></tr></tbody></table>

the drosophila imaginal disc tumor model: visualization and quantification of gene expression and tumor invasiveness using genetic mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

Drosophila EAD tanımlanan genotiplerin GFP işaretlenmiş yamalar oluşturmak için eyFLP-MARCM tekniğin potansiyel göstermek için, klon üç tip indüklenmiştir: Sadece (1) kontrol GFP ifade, (2) habis tümörler, küçük bir onkojenik biçimi eksprese bir tümör baskılayıcı geni Scribbles&#39;ın homozigot kaybı (Scrib 1) &#39;in bir arka G-proteini Ras (RAS V12), ve (3) büyümeye devam fakat non-invazif ras V12</sup...

Watch this Scientific Journal Video about The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics at JoVE.com

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

the-drosophila-imaginal-disc-tumor-model-visualization-quantification

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

11.0K Görüntüleme.  University of Cologne.  Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır. 

Video: The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Gelişim Biyolojisi

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue organization. Drosophila melanogaster has emerged as a popular experimental model system in cancer biology to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis. In particular, genetic tools for Drosophila imaginal discs (developing epithelia in larvae) enable the creation of transformed pro-tumor cells within a normal epithelial tissue, a situation similar to the initial stages of human cancer. A recent study of tumorigenesis in Drosophila wing imaginal discs, however, showed that tumor initiation depends on the tissue-intrinsic cytoarchitecture and the local microenvironment, suggesting that it is important to consider the region-specific susceptibility to tumorigenic stimuli in evaluating tumor phenotypes in imaginal discs. To facilitate phenotypic analysis of tumor progression in imaginal discs, here we describe a protocol for genetic experiments using the GAL4-UAS system to induce neoplastic tumors in wing imaginal discs. We further introduce a diagnosis method to classify the phenotypes of clonal lesions induced in imaginal epithelia, as a clear classification method to discriminate various stages of tumor progression (such as hyperplasia, dysplasia, or neoplasia) had not been described before. These methods might be broadly applicable to the clonal analysis of tumor phenotypes in various organs in Drosophila.

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Mosaic clone analysis in Drosophila imaginal disc epithelia is a powerful model system to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis. Here we describe a protocol to induce tumors in Drosophila wing imaginal discs using the GAL4-UAS system, and introduce a diagnosis method to classify the tumor phenotypes.

Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disk Epiteli

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

Kanser Araştırmaları

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Nörobilim

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an autoinjector apparatus, trained operators can achieve more efficient and consistent transplantation results compared to those obtained using a manual injector. Here, we cover topics in a chronological fashion: from the crossing of Drosophila lines, to the induction and dissection of the primary tumor, transplantation of the primary tumor into a new adult host and continued generational transplantation of the tumor for extended studies. As a demonstration, here we use Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary gland imaginal ring tumors for generational transplantation. These tumors can first be reliably induced in a transition-zone microenvironment within larval salivary gland imaginal rings, then allografted and cultured in vivo to study continued tumor growth, evolution, and metastasis. This allotransplantation method can be useful in potential drug screening programs, as well as for studying tumor-host interactions.

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol provides detailed guidance for the initial and continued generational allotransplantation of Drosophila tumors into the abdomen of adult hosts for studying various aspects of neoplasia. Using an autoinjector apparatus, researchers can achieve improved efficiency and tumor yields compared to those achieved by traditional, manual methods.

Programlanabilir Otomatik Nanolitre Enjektör ile Drosophila melanogaster'de Tümör Allotransplantasyonu

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

Arasında Cephalic Kompleksi Genetik İndüksiyon ve Benign ve İnvaziv vizüalizasyonun için Protokol<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Tıp

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Biyoloji

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Yara kaynaklı Poliploidizasyonu Incelemek için Bir Drosophila Modeli

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptör Hücreler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi

Morfolojik analiz Drosophila Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Programlanabilir Otomatik Nanolitre Enjektör ile Drosophila melanogaster'de Tümör Allotransplantasyonu

Arasında Cephalic Kompleksi Genetik İndüksiyon ve Benign ve İnvaziv vizüalizasyonun için Protokol

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Yara kaynaklı Poliploidizasyonu Incelemek için Bir Drosophila Modeli

Mozaik Yetişkin Canlı Görüntüleme Domates / GFP-FLP / FRT Yöntemi

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren