We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

Tüm hayvan prosedürleri deneysel amaçlar için kullanılan hayvanların korunması (Direktif 86/609 / EEC) ve önerileri Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu (FELASA) tarafından ileri sürülen yerel ve Avrupa Birliği mevzuatı ile uyum içinde idi. C57BL / 6 fareleri ve Fpr-RS3-i Venus farenin Hem yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde, oda sıcaklığında, her iki cinsiyet grupları barındırıldı. deneyler için cinsiyet ya genç yetişkinler (6-20 hafta) kullanıldı. Hiçbir belirgin cinsiyet bağımlı farklılıklar gözlenmiştir. 1. Solüsyon Hazırlama <ol><li> Hücre-dışı solüsyon S 1 hazırlanması: 4- (2-Hidroksi-etil) -piperazin-1-etansülfonik asit 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, (mM olarak) ihtiva eden hücre-dışı çözelti tamponlu (HEPES); pH = 7.3 (NaOH ile ayarlanır); (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm. </li><li> ekstraselüler hazırlayınlar Çözelti 2: karbojen oksijenli (% 95 O2,% 5 CO2) CaCl2, 1 MgSO 4 125 NaCl, 25 (mM olarak) NaHCO 3, 5 KCl, 1 ihtiva eden hücre-dışı çözelti 5 BES; pH = 7.3; (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm. </li><li> Doku yerleştirilmesi için% 4 düşük jelleşme sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisi (S3) hazırlayın:% 4 düşük jelleşme sıcaklığı agaroz. 2 g bir manyetik karıştırıcı ile birlikte 100 ml&#39;lik bir cam şişe içinde laboratuar S 1 50 ml agaroz düşük jelleştirme eritin. agaroz eriyik için, yaklaşık 20 dakika boyunca ya da çözelti karıştırılırken saydam hale gelinceye kadar 70 ° C&#39;de (kapağın sıkı bir şekilde kapatılmamış olan) bir su banyosu içinde bir şişe yerleştirin. soğutun ve sonraki kullanıma kadar 42 ° C &#39;de, ikinci bir su banyosu içinde eritilmiş agaroz tutun. </li><li> Hücre-içi solüsyon s, 4 hazırlayın: Pipet çözelti 2 (serbest Ca2 + = 110 nM) 1 EGTA 143 KCI, 2 KOH, 0.3 CaCl, 10 HEPES, 2 MgATP (mM olarak), 1 NaGTP;pH = 7.1 (KOH ile ayarlanmıştır); osmolarite = 290 mOsm. </li><li> / Değiştir S 1 kompozisyonunun ayarlanması, bireysel deneysel tasarım (örneğin, farmakolojik blokerler gerilim aktive akımları belirli türleri izole etmek) göre S 2 ve S 4. </li></ol> 2. Çalışma Alanı Hazırlığı <ol><li> Sıcaklık ve pH ayarlaması ve sürekli oxygenate çözüm için buz üzerinde S 2, en az 30 dakika önce diseksiyon, yer dilim depolama odasını oksijenlendirdikten doldurun. </li><li> S 2 ile kayıt ayarları da dilim süperfüzyomu için doldurun ve sürekli oksijen. </li><li> Diseksiyon önce S 2 ile vibratome bölmeyi doldurun ve odanın etrafında ezilmiş buz düzenlemek. Alternatif olarak, vibratome odasına odasını oksijene yedek buz oksijenli çözümü transferi ve sürekli oksijenlendirdikten tutun. </li><li> cerrahi aletleri ve sarf düzenleyin. </li><li> diseksiyon altında buz jel paketi yerleştirinmikroskop, çanak alt donmaya karşı VNO doku önlemek için bir kağıt havlu ile kaplayın. </li><li> Kısaca,% 70 etanol ve distile su ile durulama ve vibratome monte temizleyin traş makinesi bıçak. Her dilimleme oturumu için değiştirin. </li></ol> 3. VNO Diseksiyon ve katıştırma <ol><li> CO 2 ve keskin cerrahi makas kullanarak başını kesmek için kısa maruz bırakılarak hayvan kurban. Not: kritik buz üzerinde VNO kapsülü koyarak hayvan ödün zaman olduğu gibi, en az 2 dk süreyi en aza indirmek. doku canlılığını muhafaza etmek için, en az 30 dakika içinde agaroz de tamamen Dissected VNOs yerleştirin. </li><li> Büyük cerrahi makas ile alt çene çıkarın. Ağız boşluğu ile girmek ve ayrı ayrı her tarafında mandibula kemik ve kas kesti. </li><li> başaşağı büyük Petri kabındaki başın kalan kısmını yerleştirin. </li><li> üst çene ve daha rahat erişmek için orta forseps ile burun ucu çevresindeki deri çekmeyekesici dişler. </li><li> Rostral yönde (Şekil 1A) bir ~ 45 ° &#39;lik açıyla kesici dişlerin en büyük kısmını kesip kemik makas kullanın. Bu burun boşluğundan VNO kapsülün çıkarılması kolaylaştıracaktır. Not: VNO kapsülün ucu zarar görmesini önlemek için dişin köküne kesmeyin. </li><li> Orta forseps ile rostral kısmında sert üst damak tut ve dikkatli bir düz açı (Şekil 1B) geri tek parça halinde soyun. Not: Tekrar tekrar buz gibi soğuk S 2 ile durulayın. </li><li> vomer kemik ve çene ucu arasındaki kemik füzyon kesmek için mikro yaylı makas kullanın. VNO kapsüle sol ve sağ taraf yanal hem de küçük adımlar halinde kemiğin kesilmesi dışarıya doğru VNO gelen ve dikkatli bir şekilde işaret ucunun eğri kısmı ile makas ipuçları yerleştirin. </li><li> VNO kapsülü çıkarmak için, kaudal kısmında vomer kemiği kesmek için mikro yaylı makas kullanın ve dikkatli n dışarı vomer kemiğini kaldırınorta forseps kullanarak asal boşluğu. Hemen diseksiyon kalan adımlar gerçekleştirilir bir buz jel paketini bir stereo mikroskop altında küçük bir petri tabağına VNO aktarın. </li><li> Kurumasını önlemek için doku buz soğukluğunda S 2. Alanın küçük bir miktarda VNO durulayın. </li><li> orta forseps ile vomer kemiğin arka kapma VNO yumuşak dokuları ihtiva kıkırdak kapsül ayırın. Her iki VNOs arasındaki bölünmüş (Şekil 1D i) görünür hale gelmesi için dorsal görünümü için kapsül yerleştirin. </li><li> Arka kısmında aşağı tuş vomer kemik tutarken merkez kemikten hem kıkırdak VNO kapsülleri ayırmak için ince forseps ucu kullanın. Not: Sadece kıkırdak kapsülün RIM forseps kullanın ve narin duyusal epitel kolayca zarar olarak kıkırdak delip için çok dikkatli olun. </li><li> İki VNOs ayrılır sonra, köknar encapsulating kıkırdağı kaldırarak başlamakt VNO. </li><li> bir ince forseps ile kapsülün üst çemberinin tut ve daha önce vomer kemik (medial tarafı) bağlı olduğu kıkırdak duvar uzak ayrıldı. </li><li> kıkırdak çanak alt kavisli yan tarafı ile VNO çevirmek ve güvenli forseps kullanarak bir tarafta kıkırdak aşağı pin kalan kaldırmak için. Dikkatle doku ve kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için kıkırdak ve VNO arasında bir çok düz açıyla arka tarafında ikinci ince forseps taşıyın. </li><li> Yavaş yavaş duyusal epitel zarar vermemek için, kendi kaudal ucunda tutarak uzak kıkırdaktan VNO soyma. </li><li> VNO kapsülden levered sonra, dilimleme işlemi sırasında agaroz çevredeki doku ayırmak olacaktır kıkırdak kalan parçaları olarak kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını kaldırmak için emin olun. </li><li> Doku hasarını önlemek için ilk Dissected VNO buz-soğuk 2 küçük bir damla koyun. lateral yan Wil ilgili büyük bir kan damarıl organı hala bozulmamış ve fena halde diseksiyon (Şekil 2A ii) sırasında zarar olmadığını belirten görünür hale gelir. kan damarı hasar var bu durumda, hala sürece genel morfolojisi açıkça düşüklüğüne uğramamış gibi VNO dilimleme ile devam etmek faydalı olacaktır. </li><li> Hemen ikinci VNO teşrih. </li><li> VNOs yerleştirmek için, erimiş S 3 ağız hem de kültür kaplarına dolgu (42 ° C&#39;de su banyosu içinde depolanmış, 1.3). </li><li> duyusal epitel zarar vermemek için ince forseps ile geniş kaudal ucunda VNO tutun. </li><li> agaroz VNO daldırın ve ekstrasellüler çözüm filmi yanı sıra yüzeyinden herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için ileri geri yatay birkaç kez hareket ettirin. </li><li> çanak alt bakan kaudal ucu ile dikey VNO yerleştirin. Bunun yerine, doğrudan forseps ile VNO kısma ait, yakın Proximi forseps ucu hareket ettirerek yönünü ayarlamakVNO için ty. Not: Deney sırasında duyusal nöronlar dilim uçağı ve erişilebilirlik belirler olarak gömme sırasında Oryantasyon önemlidir. </li><li> jel buz paketi üzerinde yemekleri yerleştirin ve Agaroz katılaşmış kadar bekleyin. Not: Agaroz bu çevredeki agaroz doku ayırmak gibi katılaşan başladıktan sonra VNO yönünü değiştirmeyin. </li></ol> 4. Koronal VNO Doku Dilimleme <ol><li> Büyük bir Petri kabı kapağının içine küçük çanak agaroz blok kaldırmak için küçük bir spatula kullanın, baş aşağı yukarı bakacak VNO kaudal ipucu bırakarak agaroz çevirin. </li><li> cerrahi neşter (ucunda 3-4 mm, altta 8-10 mm) kullanılarak bir piramit şekline blok kesin. Gömülü doku zarar vermemeye özen gösterin. </li><li> vibratome numune plakasının merkezine piramit şeklindeki blok düzeltmek ve yapıştırıcı tamamen kurumasını için ~ 1 dakika beklemek zorunda süper yapıştırıcı kullanın. </li><li> dilimleme c numune plaka aktarınhamber ve buna bağlı olarak ikinci bir VNO hazırlar. kullanılana kadar 4 ° C, ikinci örnekle plaka tutun. </li><li> kalınlığı: Aşağıdaki ayarlara sahip bir titreşimli bıçak mikrotom kullanın 150-200 mikron; Hız: 3.5 au = 0,15 mm / sn; Frekans: = 75 Hz 7,5 au. kısaca Diseksiyon mikroskobu altında dilim morfolojisi inceledikten sonra kullanıma kadar oxygenating odasına dilim aktarın. Dilimler birkaç saat boyunca muhafaza edilebilir. </li></ol> 5. Tek hücreli Elektrofizyolojik Kayıtlar <ol><li> kayıtlar için, suya daldırma amaçları, Dodt ya da kızıl ötesi ayırıcı müdahale kontrast (IR DIC) ve epi-floresan gibi soğutulmuş bir CCD kamera ile donatılmış bir dikine duran aşamalı mikroskop kullanımı. veri toplama için bir yama-kelepçe amplifikatör, kafa sahne, AD / DA arayüz kartı ve (kayıt yazılımı dahil) bir PC kullanın. </li><li> 10-20 yama pipetler (4-7 MQ) bir stok hazırlayın. borosilikat cam kılcal damarlardan çekme pipetler (1.50 mm OD / 0.86 mm ID) istimalBir Microforge ile ga mikropipet çektirmesi ve yangın lehçe. Not: oldukça küçük VSNs yama yaparken Yangın pipet uçları parlatma önemlidir. Bu durum, yüksek dirençli bir sızdırmazlık elde etmek için negatif basınç uygulanırken, hücre zarını önlemek için yararlı olacaktır. Pipet açılışı parlatma sonra yaklaşık 1 mikron olmalıdır. </li><li> kullanana kadar hasar ve toz birikmesini önlemek için bir pipet depolama kavanoz pipetler tutun. </li><li> çözüm rezervuarları doldurma ve deneysel tasarım göre tüp ile perfüzyon sistemi hazırlayın. Not: güçlü elektrofizyolojik kayıtlar engel olacak şekilde tamamen tüp içindeki hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> ~ 3 ml / dakika akış elde etmek için basınç ayarlayın. Not: Yüksek basınç elektrofizyolojik kayıtlar doku dilim hareketini yanı sıra fesih neden olacaktır. </li><li> görüntüleme odasına VNO dilim aktarın ve 0.1 mm kalınlığında synt ile kablolu paslanmaz çelik çapa kullanarak dilim pozisyonunu düzeltmekinfographie lifler (Şekil 2B - C). Not: sentetik elyaf ipliklerin biri değil dilim çevreleyen agaroz ile doku dilim örtmeyin. </li><li> Banyo uygulaması aracılığıyla oda sıcaklığında oksijenli S 2 ile kurulum ve sürekli Superfuse dilim kayıt Transfer görüntüleme odası. </li><li> Banyo çözeltisinin sürekli bir değişim için yavaş bir emme oluşturmak için çözeltinin yüzeyine emme kılcal ayarlayın. 8-in-1 çoklu varil &quot;perfüzyon kalem&quot; yukarıda ve kan damarı (Şekil 2C, 3A) 50 içeren VNO dilim olmayan duyusal kısmına yakın ayarlayın. Zıt yönlerde gelen dilim dönük olması perfüzyon kalem ve kayıt pipet düzenlemek için yararlı olacaktır. </li><li> Referans elektrodu ve (150 mM KCI ile dolu), L-şeklinde bir agar köprü kullanılarak banyo çözeltisi bağlayın. </li><li> Pipet çözüm S 4 ile yama pipet doldurun. </li><li> kaplama kapalı kazıma olmadan kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı yama elektrot üzerinde pipet montaj ve sıkıca takın. </li><li> hafif pozitif basınç uygulayın (yaklaşık 10 ml plastik şırınga 1 ml) banyo girmeden önce yama pipet. </li><li> (Şekil 2B) onu vurmadan hedefi batığın edebilmek için yeterince mikro manipülatörler kullanarak banyoya pipet indirin. </li><li> Baş aşamasına bağlı elektrofizyoloji yazılımı kullanarak (4-7 MQ arasında R pip) pipet direnci izleyin. Not: R pip ise &lt;4 MQ cam ucu kırıldı. R pip&gt; 10 M? Ise, uç büyük ihtimalle tıkalı ve pipet değiştirilmesi gerekir. </li><li> Kızılötesi optimize edilmiş diferansiyel girişim kontrast (DIC) kullanarak bir CCD kamera ile VNO dilim görselleştirmek ve floresan aydınlatma kullanılarak FPR-RS3-i Venüs (benzer etiketli nöronların veya) hücreleri ifade eden tanımlamakve uygun bir filtre küpü. </li><li> Odak ve hedef floresan veya floresan olmayan hücrelerin deneysel tasarım bağlı. </li><li> hücre gövdesi yaklaşmak için, maksimum duyarlılık el tekerlekleri kullanın. Pipet yakın olduğunu bir kez pozitif basınç nedeniyle, hücre soma zarında küçük bir göçük görünür hale gelir. </li><li> pozitif basınç bırakın ve yüksek direnç mühür (1-20 GΩ) elde etmek için, hücre zarındaki emmek için hafif negatif basınç uygulayın. hücre zarı bozar ve tam hücreli yapılandırmasını kurmak için kısa ve nazik vakum uygulayın. </li><li> deney sırasında sürekli erişim direnci izleyin. Not: Sadece küçük ve istikrarlı bir erişim direnci sergileyen nöronlar (R girişinin ≤3%; değişimi &lt;deney boyunca% 20) analiz içine. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

VNO Semiokimyasallar tespit eden bir kimyasal-duyusal bir yapıdır. Bugüne kadar, vomeronasal reseptörlerinin çoğunluğu sadece birkaç reseptör-ligand çifti tespit edilmiş olarak deorphanized gerekmektedir. Bunlar arasında, V1rb2 erkek idrar feromon 2-heptanon 30 spesifik olarak aktive edilmesi tanımlanmıştır, V2rp5 erkek belirli feromon ESP1 57 da SYFPEITHI V2r1b ve V2rf2 MHC peptid ile aktive edilecek şekilde aktif hale 48 ve SEIDLILGY 58, sırasıyla. resept?...

Çoğu hayvan çevreleriyle etkileşim kimyasal duyu temeline dayanmaktadır. koku duyusu uygun çiftleşme ortakları bulma ve gıda değerlendirilmesi, yırtıcı kaçınarak ve bulmak için önemli bir rol oynar. Ana koku epiteli 1,2, Grueneberg ganglion 3,4, Masera 5,6 septal organ ve vomeronasal organı: En memelilerde, koku alma sistemi en az dört anatomik ve fonksiyonel olarak farklı çevresel alt sistemden oluşur. VNO kimlik, cinsiyet, sosyal rütbe ve cinsel devlet 7-10 hakkında bilgi veren kimyasal ipuçlarını tespit önemli bir rol oynar aksesuar koku alma sistemi (AOS), periferal duyusal yapıyı içermektedir. VNO sağ damak üzerinde burun septum dibinde yer almaktadır. Farelerde, bir kıkırdak kapsül 11-13 içine bir ikili kör bitmeyen bir borudur. Organ, bir hilal şeklinde medial duyusal epithe hem oluşurVSNs limanlar ve yan tarafında olmayan bir duyu kısmının Lium. Her iki epitel arasındaki dar vomeronasal kanalı 14 yoluyla burun boşluğuna bağlı olan bir mukus doldurulmuş lümen yer almaktadır. Olmayan duyu dokuda büyük bir yan damar negatif basınç 15,16 aracılığıyla bu VNO lümenine peptitler veya küçük proteinler gibi göreli olarak büyük, daha çok uçucu olmayan moleküllerin girişini kolaylaştırmak için, bir vasküler pompalama mekanizması sağlar. VNO yapısal bileşenler doğumda mevcut ve organ kısa bir süre ergenlik 17 önce yetişkin boyutuna ulaşır. Ancak, kemirgen AOS zaten gençler fonksiyonel olup olmadığını 18-20 tartışmaya hala tabidir. VSNs kendi epitel konumu ve ifade reseptör tipine hem ile ayırt edilir. VSNs bir miyelinsiz akson ve lümen doğru çıkıntı ve bir microvillous dendritik topuzu ile biten bir tek apikal dendrit ile iki kutuplu bir morfoloji göstermektedir. VSN baltaons salkımlı, dorso-kaudal ucunda kıkırdaklı kapsül bırakır septum boyunca yükselir, aksesuar koku ampul (AOB) 21,22 ile kribriform plaka ve projeler geçer vomeronasal siniri oluşturur. vomeronasal duyusal epitel iki katmandan oluşur: apikal tabaka lümen yan ve limanlardan V1R- ve nöronlar FPR-R eksprese eden bir tür ise her iki yakın yer almaktadır. Bu nöronlar AOB 23-25 ​​ön kısmına G-proteini α alt birimi G αi2 projeyi birlikte ifade. G αo yanında daha bazal tabaka ekspres V2Rs veya FPR-Rs1 bulunan Duyu nöronları ve AOB 26-28 arka bölgeye kendi aksonları gönderin. Vomeronasal nöronlar olasılıkla idrar, tükürük gibi çeşitli vücut sıvılarının salgılanan ve sıvı gözyaşı vardır oldukça küçük yarı-kimyasallara 29-33 (V1Rs) veya proteinli bileşiklerin 34-38 (V2Rs) tarafından aktive edilir 37,39-41 </sup&gt;. Yerinde deneylerde VSNs da formilatlı peptidler ve çeşitli antimikrobik / enflamasyon bağlantılı bileşikler 25,42 ile aktive olduğunu göstermiştir. Ayrıca, heterolog FPR-rs proteinler (bkz 43 referans) conspecifics veya bozulmuş gıda kaynaklarından 25 hastalık için detektörleri gibi bir potansiyel rolü gösteren, bağışıklık sisteminde ifade FPRs ile agonist spektrumları paylaşmak dile getirdi. Belirli VSN toplumlarda reseptör-ligand ilişkileri ve aşağı doğru sinyal kaskadlar anlamak için temel bir yerli bir ortamda temel biyofizik özellikleri ayrıntılı bir değerlendirmedir. Geçmişte, hücresel sinyal analizi, büyük ölçüde floresan işaretleyici protein 30,44-49 coexpressing tarafından nöronların tanımlanmış bir nüfusa işaret genetiği değiştirilmiş hayvanlardan faydalandı. Bu protokol, bir fluoresan işaretleyici ile birlikte FPR-RS3 eksprese eden bir transgenik fare hattı (FPR-RS3-i Venüs) kullanılır.Bu yaklaşım, akut koronal VNO doku dilimler halinde tek nöron patch-kelepçe kayıtları kullanarak optik tanımlanabilir hücre popülasyonunun elektrofizyolojik analizi gerçekleştirmek için böyle bir genetiği değiştirilmiş fare zorlanma istihdam nasıl örnekliyor. Bir hava basınç tahrikli çoklu varil perfüzyon sistemi duyusal uyaranlar ve farmakolojik ajanların kayıtları sırasında, hızlı tersinir ve fokal nöronal stimülasyon ya da önlenmesini sağlar. slice preparatlarda Tüm hücre kayıtları hücrenin doğal ortamında bir içsel özellikler, gerilim-etkin iletkenlikleri ayrıntılı analizi, hem de hareket potansiyeli boşaltım kalıpları için izin verir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose (low-gelling temperature)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgical tools and consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large Petri dish, 90 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>decapitation, dissection of VNO capsule</td></tr><tr><td>Small Petri dish, 35 mm</td><td>VWR</td><td></td><td>lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose</td></tr><tr><td>Sharp large surgical scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>decapitation, removal of lower jaw</td></tr><tr><td>Strong bone scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>cutting incisors</td></tr><tr><td>Medium forceps, Dumont tweezers #2</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>removing skin and palate</td></tr><tr><td>Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>cutting out VNO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>dissecting VNO out of cartilaginous capsule</td></tr><tr><td>Small stainless steel spatula</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>handling agarose block and tissue slices</td></tr><tr><td>Surgical scalpel</td><td></td><td></td><td>cutting agarose block into pyramidal shape</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID)</td><td>Science Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence lamp</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate magnetic stirrer</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator Device&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller, vertical two-step</td><td>Narishige</td><td>PC-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer&amp;nbsp;</td><td>Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion system 8-in-1</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH Meter five easy</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette storage jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>e212</td><td></td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments)</td><td>custom-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Trigger interface&amp;nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Water bath&amp;nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

in-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Tanımlanmış hücre popülasyonlarının biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerine anlamak için, biz fare VNO (- 2 Şekil 1) akut koronal doku dilimleri gerçekleştirin. Diseksiyon sonra, dilimler bir kaç saat süre ile buz soğukluğunda oksijenli hücre dışı çözelti (S2) &#39;de muhafaza edilebilir. Kayıt kurulumda, taze oksijenli çözümü ile bir sabit döviz (Şekil 2B) deney boyunca doku canlılığını sağ...

Watch this Scientific Journal Video about In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ at JoVE.com

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

in-depth-physiological-analysis-defined-cell-populations-acute-tissue

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.6K Görüntüleme.  RWTH Aachen University. Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings. 

Video: In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Nörobilim

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures. The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, respiratory, and squamous epithelia which differ markedly in anatomical locations, morphology, and functions. In adult mice, the nose is covered with various skull bones, limiting experimental access to internal structures, especially those in the posterior such as the main olfactory epithelium (MOE). Here we describe an effective method for obtaining almost the entire and intact nasal tissues with preserved anatomical organization. Using surgical tools under a dissecting microscope, we sequentially remove the skull bones surrounding the nasal tissue. This procedure can be performed on both paraformaldehyde-fixed and freshly dissected, skinned mouse heads. The entire deboning procedure takes about 20-30 min, which is significantly shorter than the experimental time required for conventional chemical-based decalcification. In addition, we present an easy method to remove air bubbles trapped between turbinates, which is critical for obtaining intact thin horizontal or coronal or sagittal sections from the nasal tissue preparation. Nasal tissue prepared using our method can be used for whole mount observation of the entire epithelia, as well as morphological, immunocytochemical, RNA in situ hybridization, and physiological studies, especially in studies where region-specific examination and comparison are of interest.

Korunan Anatomik Örgütü ile bozulmamış Fare Burun Doku hazırlamak için etkili bir Manuel kemik sıyırma Yöntemi

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Biyoloji

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from Vomeronasal Sensory Neurons

Source: Ackels, T., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54517">In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The protocol video describes establishing a whole-cell patch clamp for electrophysiological recording from the sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO) in mice. A coronal VNO slice with fluorescently labeled sensory neurons is placed in a recording setup. A labeled neuron is patched with a recording pipette in a whole-cell configuration for electrophysiological recording in response to chemical stimuli.

Vomeronazal Duyusal Nöronlardan Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturulması

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Solution Preparation

	Prepare ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Preparation of Mouse Vomeronasal Organ for Vibratome Sectioning

Source: Ackels, T., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54517">In-depth physiological analysis of defined cell populations in acute tissue slices of the mouse vomeronasal organ.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video outlines the isolation of a mouse vomeronasal organ (VNO) and tissue preparation for vibratome sectioning. Sections are used to characterize the biophysical and physiological attributes of a specific group of sensory neurons.

Vibratom kesiti için fare vomeronazal organının hazırlanması

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
Both ...

Nöronal Kültür Teknikleri

Birincil Nöronal Kültür

Perforated Patch-Clamp Recording of Olfactory Sensory Neurons in Mice

For this protocol, have mice available between 2 and 4 weeks old. In this presentation, mice expressing OR/IRES/tauGFP are used.
By using OR/IRES/tauGFP mice, all neurons expressing the OR of interest will be labeled with GFP. This method can be used for OR expressed in all zones. However, dissections and recordings will be easier for OR expressed in the dorsal zone.
Begin by anesthetizing and then decapitating a mouse.
The outcome of this protocol depends on the quality of the dissection. These dissection steps must be as short as possible and be precise.
To begin the surgery, use dissecting scissors to make a longitudinal cut along the dorsum. Pull skin apart to remove it. Then, cut along the lower jaw and make a coronal cut parallel to the teeth. Thus, remove the upper incisor teeth. Now, make a coronal cut around the head, behind the eyes. Discard the posterior head, and transfer the anterior portion to ice-cold Ringer&#39;s.
Now, under a dissection microscope, isolate the septum within 5 to 10 minutes. Start with a longitudinal cut along the ventral side. Then, cut the dorsal bones longitudinally along the dorsal lateral side of the nasal cavity.
Next, remove most of the bones and the palate. Transfer the isolated septum and attached epithelium to a container of oxygenated Ringer&#39;s at room temperature. Within five minutes, make the final preparations before recording.
The solution must not be too warm, or the preparation will look damaged. To access the neuroepithelium for recording, first, peel the epithelium from the underlying septum with forceps. Then, using micro-Vannas scissors, cut the anterior end of the septum to release the epithelium.
Now, carefully remove the vomeronasal organ. Cut it off where it is attached dorsally. The isolated epithelium can now be moved to the recording chamber, mucus side up. Once in place, use a harp to flatten the tissue. Then, transfer the chamber to an upright microscope. Visualize the neuroepithelium under a 40x water immersion objective while perfusing it continually with fresh Ringer&#39;s at room temperature.
To begin, search for the cells of interest, which, in this case, express EGFP. So 480-nanometers light is used to scan for cells that emit light in the 530 to 550-nanometer range. The targeted dendritic knobs and OSNs, when reviewed at 80 to 160x under bright field, should be clearly distinguishable from the supporting cells.
Now, load the electrode with the nystatin solution. Tap out any bubbles that form, and attach the electrode to the holder. Now, apply some positive pressure. The expected resistance is between 15 and 20 megaohms. Then, bring the electrode to the cell while maintaining the positive pressure.
When the resistance increases to about 40 megaohms, release the pressure and apply a slight negative pressure. If a gigaseal is made, the membrane potential should be clamped at about negative 75 millivolts.
Now that the cell is open, proceed with the experiment. Apply stimulation protocols and perfuse with pharmacological treatments as needed. To test with a single odorant, record 200 to 500 milliseconds of spontaneous activity. Apply the odorant for 500 milliseconds, and then, measure responses for up to 10 seconds.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Korunan Anatomik Örgütü ile bozulmamış Fare Burun Doku hazırlamak için etkili bir Manuel kemik sıyırma Yöntemi

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Vomeronazal Duyusal Nöronlardan Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturulması

Vibratom kesiti için fare vomeronazal organının hazırlanması

Farelerde Koku Alma Duyu Nöronlarının Delikli Yama-Kelepçe Kaydı