This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.

1. Hücre Kültürü Not: Tüm hücre kültürü protokolleri uygun hücre kültür teknikleri kullanılarak yapılmalıdır (: Bir Laboratuar El Kitabı, Cilt I 10 başvuru için Hücre Biyolojisi ilk 3 Bölümler bakınız). Hei-OC1 hücreleri uygun bir yapışma ve bir büyüme hücre kültür kaplarına ilave kaplama ya da işlem gerektirmez. Çok önemli: Hücre kültürü amaçlı cam yemekleri kullanmayın; fenotip ve farmakolojik ilaçların, hücrelerin biyolojik yanıt (yayınlanmamış G Kalinec &amp; F Kalinec) değişecektir; geleneksel plastik hücre kültürü yemekleri (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) tavsiye edilir. Bulaşmayı önlemek için aseptik teknikler özellikle dikkat edin, ancak HEI-OC1 hücreleri ile antibiyotik (örneğin, ampisilin veya streptomisin) asla kullanmayın. Gerekirse HeLa ve HEK-293 hücreleri Hei-OC1 8, başka bir hücre soyu olabilir önceki çalışmalarda bir kontrol olarak kullanılmış olsa da, amfoterisin B kullanımıBu amaç için kabul edilebilir. <ol><li> Dondurulmuş HEI-OC1 Hücrelerinin Resüsitasyon Not: stria 13,14 vaskularis gelen bu protokol, aynı transjenik Corti 11,12 organdan, örneğin OC-K3 olarak, laboratuarda geliştirilmiş fare ve SV-K1 diğer hücre çizgileri de kullanılabilir. <ol><li> Sıvı N 2 dondurulan Hei-OC1 hücrelerinin bir şişe çıkarın ve 37 ° C&#39;de bir su banyosu içine koyun. Şişenin sadece alt yarısı daldırın ve buz sadece küçük bir miktar şişede kalmaktadır kadar çözülme sağlar. % 70 alkol ile flakon dışını silin. </li><li> (Dulbecco değiştirilmiş Eagle aracı maddesi gibi önceden ısıtılmış büyüme ortamında 10 ml içeren 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine yavaşça bütün hacmi (-1.5 x 10 5 hücre / mi), damla damla, şişeden hücreler pipet ve teslim DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. </li><li> t atarak, 5 dakika boyunca 300-500 xg tüp santrifüjle DMSO kaldırO süpernatan ve yeniden süspansiyon, taze büyüme ortamına (DMEM +% 10 FBS) 9 ml hücreleri. orta ve tersi, tüpün alt dokunmadan pipet ucu ile üç dört kez pipetle dan, asma hücrelerinin akı ve reflü kümeleri veya hücre yaprak parçalara ayırma. </li><li> 100 mm çapında işlenmemiş plastik hücre kültürü tabakları büyüme ortamı içinde süspansiyon haline hücrelerin toplam hacmi yerleştirin. </li><li> % 10 CO2 (izin veren koşullar) ile 33 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> HEI-OC1 Hücrelerinin Altkültür Not: izdiham önce (~% 80) hücre boyama kültür önlemek için süspansiyon ve alt-kültür haline getirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, aynı zamanda stria gelen 13,14 vaskularis, çorti 11,12 ve SV-K1 organdan Bu OC-K3 aynı transgenik fare laboratuvarda geliştirilen diğer hücre çizgileri, kullanılabilir. <ol><li> 2 ml PBS ile hücreleri eski orta alın ve yıkama. &lt;/ Li&gt; <li> Yüzey alanı 25 cm2 başına 1 mi kullanılarak,% 0.25 tripsin solüsyonu ile hücre mono tabakasının örtün. hücrelerin% 40&#39;ından fazlası çıkartılması gerekmektedir sonraki adıma hareket ettirin. Gerekirse, ters bir mikroskop kullanılarak hücrelerin inceleyin ve &quot;tokat veya dokunun&quot; kalan bağlı hücreleri serbest bırakmak için hafifçe kültür yemekleri. Not: hücre ölümüne neden olabilir uzun süre trypsinization olarak özen gösterin; Yeterince ve transfer hücreleri olacak planlanan çalışmalar için yetersiz. değil </li><li> 1.1.3 tarif edilen prosedür izlenerek, hücrelerin tekrar ve 15 ml konik bir tüp aktarın. </li><li> 300-500 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje, orta atmak, taze büyüme ortamına hücreleri toplamak ve, en az dört, 100 mm çapında, hücre kültür kaplarına bunları tohum. çanak başına hücre sayısı, geri kazanılan hücre miktarına bağlıdır. % 10 CO2 (P-Hei-OC1) ile 33 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve için gerekli daha birçok kez bölmekPlanlanan deneyler ya da yeni bir stok oluşturmak için. </li><li> stok hazırlanması için, 250-550 ml hücre kültürü şişeleri ile 100 mm çaplı yemekler yerine; Deneyler için, daha küçük bir yemekler veya çok-kuyucuklu plak daha uygun olabilir. </li><li> Onlar gelinceye kadar farklılaşma, ~ hoşgörülü koşullarda% 80 izdiham HEI-OC1 hücreleri inkübe; daha sonra 2 ila 3 hafta içinde,% 5 CO2 (NP-Hei-OC1) 39 ° C&#39;ye kadar yemekler hareket eder. Not: Hücreler giderek çoğalan ve ölen duracaktır. Ölü hücreleri çıkarmak için her gün orta değiştirin. daha fazla hücre deneyleri için uygun olacak, genellikle yaklaşık 4 hafta sonra, orijinal hücre sayısına bağlı olarak. Hücreler NP koşullarında yerleştirilir olarak farklılaşma en kısa sürede başlar, ancak her hücre aynı hızda ayırt. Önemlisi, nitel sağlayan (Şekil 4 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) farklılaşma sürecinde ifade ve membran yerelleştirme artar Prestinve farklılaşma düzeyi kantitatif bir gösterge. </li></ol></li></ol> 2. İlaç Sitotoksisite çalışmaları Not: izin veren koşullar (P-HEI-OC1) yetiştirilen HEI-OC1 hücreleri bu çalışmalarda (Şekil 1 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) için tavsiye edilir. <ol><li> Hücre Canlılık (MTT testi) <ol><li> 1.2 anlatılan prosedürü izleyerek P-HEI-OC1 hücreleri toplamak ve otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ya onları saymak. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> 96 oyuklu şeffaf yassı tabanlı plakalar (oyuk başına 100 ul) ile ilgili hücrelerin Tohum substrata eklenmesi için bir gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın! </li><li> ilaç tedavisinden sonra (genellikle 24 veya 48 saat 33 ° C&#39;de), imalatçının protokolü izlenerek MTT gerçekleştirin. Genel olarakBu deney için protokol, aşağıdaki adımları vardır: <ol><li> Her bir oyuğa, MTT ayıracı 10 ul ekle. </li><li> mor boya görünene kadar 2 ila 4 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası ve daha sonra her bir MTT Deterjan reaktifi 100 ul ilave edin. plaka sallamayın. </li><li> plaka Kapak ve 37 ° C&#39;de 2 saat 4 için karanlıkta bırakın. </li><li> boşlukları (tek başına büyüme ortamı) de dahil olmak üzere, her bir 570 nm&#39;de absorbansı ölçmek için bir mikro-plaka plaka okuyucusu kullanarak. canlılığı% 100 olarak kontrol hücreleri ortalama OD kullanarak veri normalize. </li></ol></li></ol></li><li> Kaspaz 3/7 aktivasyon deneyi Not: izin veren koşullar (P-Hei-OC1) yetiştirilen Hei-OC1 hücreleri bu çalışmalar için tavsiye edilir. <ol><li> 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek Hei-OC1 hücreleri toplamak ve bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ile ya say. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> wh üzerinde hücreleri Tohum(100 ul oyuk başına), 96 gözlü levhalar ite duvarlı, alt-tabakaya bağlanması için bir gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın! </li><li> ilaç tedavisinden sonra (genellikle 24 veya 48 saat 33 ° C&#39;de), ilgili üreticinin protokolü takip kaspaz deneyi yapar. Genel olarak, bu deneme için olan protokole şu adımları vardır: <ol><li> , Reaktifler hazırlayın iyice karıştırın ve onları oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. </li><li> inkübatör hücreleri çıkarın ve plakalar oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. </li><li> Aynı pipet uçları ile farklı örnekleri içeren kuyu dokunmadan değil tarafından çapraz bulaşmayı önlemek için dikkatli olmak, iyi her reaktif belirtilen miktarda ekleyin. </li><li> plaka Kapak ve 300-500 rpm&#39;de bir plaka çalkalayıcı kullanarak 30 saniye boyunca karıştırın. </li><li> en az 30 dakika, bir süre için, oda sıcaklığında inkübe plakası. determinampirik optimum kuluçka dönemi e. Oda sıcaklığı sıcaklık dalgalanmaları lüminesans okuma etkileyecektir, çünkü sabit sıcaklık kuluçka kullanın dalgalanmalar durumunda. </li><li> her bir lüminesans ölçümü ve kaspaz aktivasyonunun% 100 olarak kontrol hücreleri ortalama ışıldama kullanarak değerleri normalize. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre Bölünmesi (Proliferation) <ol><li> 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek Hei-OC1 hücreleri toplamak ve bir otomatik hücre sayacı veya hemasitometre ile ya say. 2.0 x 10 5 hücre / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> 96 oyuklu şeffaf yassı tabanlı plakalar (oyuk başına 100 ul) ile ilgili hücrelerin Tohum alt-tabaka bağlanma izin veren koşullar gece boyunca inkübe ve daha sonra söz konusu ilaç ile tedavi. boşlukları ve tedavi edilmeyen hücreleri (kontrol) eklemeyi unutmayın! </li><li> muameleden sonra bir saat, her çukuruna hazırlanan 100x BrdU 1 ul (5-Bromo-2&#39;-deoxyuri) Çözeltisi yemek ve 33 ° C&#39;de inkübatör plakaları döndürür. </li><li> 12, 24 ve 48 saat sonra, ilgili plakalar mevcut orta kaldırmak ve PBS ile de bir kez, her yıkama. </li><li> Üreticinin protokolü takip hücre proliferasyon tahlili gerçekleştirmek. Genel olarak, bu deneme için olan protokole şu adımları vardır: <ol><li> / Sabitleme de dahil olmak üzere, üreticinin protokolüne belirtildiği gibi denatüre edici çözelti, yıkama tamponu birincil antikor algılama çözeltisi, ikincil antikor algılama çözeltisi ve BrdU çözelti belirteçlerinin hazırlayın. </li><li> üreticinin protokolü gösterilen miktarlarda, her bir kuyucuğa sabitleme / denatüre solüsyonu ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında plaka tutun. </li><li> Kurma / denatürasyon çözeltisi çıkarın ve üreticinin protokolüne belirtilen konsantrasyonda primer antikor ilave edin. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında plaka tutun. </li><li> Primer ant ile çözüm çıkarıniBody, plaka, yıkama tamponuyla 3 kez yıkayın ve daha sonra imalatçının protokolüne belirtilen konsantrasyonda sekonder antikoru ilave edin. 30 dakika için oda sıcaklığında, ikincil antikor ile plaka tutun. </li><li> , Ikincil antikor ile çözüm çıkarın plaka, yıkama tamponuyla 3 kez yıkanır ve substrat ilave edin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyondan sonra, durdurma çözeltisi ilave edin. Dikkatli olun: renk değişimi kontrol; çözüm çok karanlık olursa, 10 dakika standart geliştirme zamanı öncesinde reaksiyonu durdurmak. </li><li> Durdurma çözeltisi ekleyerek 30 dakika içinde 450 nm&#39;de absorbansı okumak. </li></ol></li></ol></li><li> sitotoksisite Not: izin veren koşullar (P-Hei-OC1) yetiştirilen Hei-OC1 hücreleri bu çalışmalar için tavsiye edilir. <ol><li> tek başına hücre kültürü ortamı (kontrol) ya da orta artı faiz uyuşturucu, 24-48 saat süreyle genellikle hoşgörülü koşullarda HEI-OC1 inkübe hücreleri. </li><li> Tedavi sonundaHücreleri, PBS ile üç kez yıkanır, ve 3 dakika için bir enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi yüzey alanının 25 cm2 başına 1 ml ile çıkarınız. </li><li> çıkardıktan sonra toplamak ve 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri Süpernatantı ve sitotoksisite analizi dahil reaktif ile karanlıkta 15 dakika için hücrelerin lekelenmesi. </li><li> akış sitometresinin üreticisi tarafından belirtilen sitometri olarak akış canlı HEI-OC1 hücrelerinin sayısını belirler. </li></ol></li><li> yaşlılık <ol><li> tek başına hücre kültürü ortamı (kontrol) ya da orta artı faiz uyuşturucu, 24-48 saat süreyle genellikle hoşgörülü koşullarda HEI-OC1 inkübe hücreleri. </li><li> Güvenilir sonuçlar sağlamak için bilinen Debacq-Chainiaux ve ark., 15 ya da başka bir yöntemle tanımlanan protokol ile akış sitometrisi kullanılarak yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz pozitif hücrelerin sayısını belirler. flow sitometri için kısa bir protokol şudur: <ol> &lt;li&gt; deneysel tedavi sonunda, hücrelerin PBS ile üç kez yıkanır ve daha sonra izin veren koşullar da 1 saat süre ile hücre kültür ortamı içinde, 100 nM bafilomisin A1 ile inkübe edin. </li><li> ~ 33 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda C12FDG ekleyin ve 1-2 saat boyunca hücrelerin inkübe edilmesi devam edin. </li><li> 3 dakika için bir enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi yüzey alanının 25 cm2 başına 1 ml kullanarak hasat, PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile bunları pelet. </li><li> buz soğukluğunda PBS hücrelerin yeniden süspanse edin ve akış sitometresi üreticisi tarafından gösterildiği gibi akış sitometrisi ile pozitif Hei-OC1 hücrelerinin sayısını belirler. </li></ol></li></ol></li><li> otofaji <ol><li> Hei-OC1 hücreleri kontrol etmek ve aç 1.2 de tarif edilen prosedür takip edilerek (48 saat boyunca serumdan yoksun) ve standart protokoller izlenerek, batı lekesi üzere işlemden toplayın. Genel olarak, Western blot protokolleri, aşağıda st bilgisieps: <ol><li> 1.0 x 10 5 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, 6 oyuklu tabaklar Tohum Hei-OC1 hücreleri. 24 ve / veya 48 saat sonra, buz gibi soğuk PBS ile yıkayın hücreleri. </li><li> Lyse ile TNESV tamponu (% 1 NP40, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4), buz üzerinde 5 dakika süre ile proteaz inhibitör kokteyli ile ve 1 mM PMSF 200 ul. </li><li> (Her bir alt kazıma) hücreler toplama 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 16,800 x g&#39;de mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj aktarın. </li><li> süpernatantlar toplamak ve BCA Testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek. </li><li> proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 5x yükleme tamponu ve her bir örnek için, 1 mM DTT ve kaynatılır. </li><li> % 4-12 jel üzerinde SDS-PAGE kullanılarak örnekleri çalıştırın ve PVDF zarlarına transfer. </li><li> Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca Tween 20% 0.1 TBS-T içinde% 5 yağsız kuru süt ile bloke membranlar. </li><li> Birincil ant ile 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe membranlaribodies. </li><li> Sonraki gün, TBS-T ile iyice membranları yıkamak ve yaban turpu peroksidazı (HRP) (1: 1500) konjüge edilmiş bir sekonder IgG ile inkübe 1 saat karıştırıldı. </li><li> bir chemiluminescence (ECL) algılama sistemi ile immünoreaktivite algılar. standart olarak (% 10 yağsız kuru süt ile TBS-T içinde 2.000 1) GAPDH kullanılarak protein ekspresyon seviyelerini normalize. </li></ol></li><li> Western blotlar olarak ekspresyonunu incelemek en azından bu Beclin-1 ve LC3B olarak Otofaji iki farklı işaretleri (genellikle 1 için:% 2.5 BSA ile TBS-T içinde 1000 seyrelti). GAPDH veya aktin gibi protein ifade bir denetim bakmak için unutma. </li><li> Böyle kamu malı NIH Image veya ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) gibi dijital Blot tarayıcı veya bilgisayar yazılımı kullanılarak dansitometrisi tarafından ilgilenilen proteinin ifadesini değerlendirir. </li></ol></li></ol> HEI-OC1 Hücreleri ile 3. Elektrofizyoloji Deneyler <ol><li>Hasat Hücreler Not: kullanımlar hücreleri 50% -80% birbirine karıştığında 100 mm çaplı kültür tabaklarında büyüyen. Tripsin, Accutase bir asetik asit (PBS-EDTA) etra meti! D iamine t uffered s aline + e B enzim içermeyen bir çözelti ya da p hosphate- gigaseals sayısı ve kalitesi üzerinde önemli bir etkisi olmaksızın hücreleri kaldırma için kullanılabilmektedir . Bazı durumlarda ise, tripsin tedavisi hücreleri daha kırılgan hale getirmektedir. Bu gibi durumlarda, hücreler, bir deney başlamadan önce, yaklaşık 30 dakika boyunca geri sağlar. <ol><li> 10 ml Ca olmadan PBS 2+ ve Mg 2+ ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 3 dakika boyunca yemekler gibi enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi gibi bir enzim içermeyen detacher çözeltisi 2 mi, ekleme ve inkübe edilir. </li><li> Hücrelerin dekolmanı kontrol etmek için ters bir mikroskop kullanın. Gerekirse, cel hareketl kültür çanak fazla hücreleri ayırmak için, ama nazikçe yapın. Not: çanak sallamayın. </li><li> DMEM +% 10 FBS, 10 ml ilave edilir ve yavaşça yukarı ve 10 ml bir pipet ile beş defa hücreleri pipetle. </li><li> Mikroskop altında hücrelerin bak. Hücrelerin&gt;% 80 zaten (tek) ayrılmış ise, başka pipet gereklidir. Hücreler kümeler hala varsa% 80&#39;den fazla hücreleri tek olana kadar yavaşça pipetleme tekrarlayın. </li><li> 100 x g&#39;de 2 dakika süre ile, 15 ml konik bir tüp içine santrifüj süspansiyon hücrelerinin ~ 10 mi yerleştirin ve süpernatant atılır. </li><li> hücreler tekrar süspansiyon - harici kayıt solüsyonu ~ 200 ul kullanarak (damıtılmış su ile 310 mOsm Leibovitz L-15 ortamı 305 ayarlanmıştır). hücrelerin optik kontrol pürüzsüz zar kenarlara sahip çok sayıda tek, yuvarlak hücreler göstermesi gerekir. </li></ol></li><li> Patch-kelepçe ve NLC Ölçümler <ol><li> yama-kelepçe ve bir kullanarak voltaj bağımlı doğrusal olmayan kapasitans ölçümü (NLC) gerçekleştirindequate yükselticiler ve yazılım, yanı sıra standart elektrofizyolojik teknikler. İç (intrapipette) çözeltisi kullanımı, 150 mM KCI, 1 mM MgCI2, 0.1 mM EGTA, 2 mM ATP, Mg gibi, 0.1 mM GTP-Na ve 10 mM HEPES; Tris ile pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. </li><li> Mikroskop altında, yuvarlak ve pürüzsüz zar kenarlara sahip tek, sağlıklı hücreyi seçin. hücre yüzeyine cam pipet ucu takın ve membran direnci kontrol edin. Bu ~ 2 um pipet ucu, iç çapı (ID) tekabül eden, yaklaşık 3-6 megohm olmalıdır. </li><li> Yavaşça hücre plazma zarı karşı mikropipet ucu basın ve sonra emme uygulanır. 100 gigaOhms (gigaseal) - hücre zarının bir kısmı 10 için bir elektriksel direnç üreten pipet içine emilen olacaktır. </li><li> Emme darbeleri ile plazma zarı bozarak tüm hücre durumunu kurmak. </li><li> Kontrol 9 gibi, bu HEK-293 olarak Prestin eksprese etmeyen hücreler, kullanma. Not: Şu tepkiler 5 kHz filtre edilmelidir ve düzeltmeler artık seri direnç etkileri için yapılmış. Tüm veri toplama ve çoğu analizler genellikle kilitli amplifikatörler birlikte gelen yazılımı kullanılarak yapılabilir. Kapasitans fonksiyonu membran gerilimine 16 doğrusal olmayan ücret ile ilgili bir iki devlet Boltzmann fonksiyonunun birinci türevi takılabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li><li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening.">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li><li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells:+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways.">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li><li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line.">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li><li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress.">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li><li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells.">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li><li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity.">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li><li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function.">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li><li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (2006).</li><li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents.">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li><li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines.">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li><li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse.">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li><li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis:+in+vitro+and+in+vivo+evidence.">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li><li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance.">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+pyroptosis,+and+necrosis:+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells.">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li><li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+necrosis:+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways.">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li><li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+kind+of+cell+suicide:+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis.">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li><li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation.">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li><li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+signaling+of+the+Fas+receptor:+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways.">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li><li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+cellular+senescence,+and+cancer.">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li><li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin's+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events.">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse.">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li><li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat.">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li><li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+Oxygen+Tension:+Relation+to+Blood+Flow+and+Function.">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li></ol>

The authors declare no existing or potential conflict of interest.

Bu yazıda nasıl kültür HEI-OC1 hücrelerini açıklamak ve ilaca bağlı sitotoksisite mekanizmaları değerlendirmek için bunları kullanmak ve lüks mah, koklear OHCs moleküler motor fonksiyonel özelliklerini araştırmak için. teknik prosedürler, ancak kolayca farklı çalışmalara adapte edilebilecek kadar geneldir. Burada tarif edilen tüm protokoller, köklü hücre kültürü teknikleri 10 doğru kullanımını gerektirir. Sadece herhangi bir başka hücre hattı ...

Corti 1 Ev Kulak Enstitüsü Organ (HEI-OC1) hücreler transgenik fare 1,2 işitsel organdan türetilmiştir. 33 ° C /% 10 CO2 (permisif koşullar) bu transjenik fareden bir hücre inkübasyonu de-farklılaşma ve hızlandırılmış çoğalmasını tetikler bir immortalize genin ekspresyonuna neden olur; 39 ° C /% 5 CO2 en az Hei-OC1, hücre ölümü 2,3 halinde, çoğalma, farklılaşma azalma ve (non-permisif koşullar) talebi hücreleri ediyor. HEI-OC1 hücreleri klonlanmış ve on yıl önce laboratuvarımızda karakterize ve ilk çalışmalar spesifik gibi lüks mah, miyozin 7a, Atoh1, BDNF, calbindinden ve kalmodulin olarak koklear saç hücrelerinin, belirteçleri, aynı zamanda destekleyici işaretleri ifade belirtti edildi Connexin 26 ve fibroblast büyüme faktörü reseptörü (FGF-R) 2 gibi bir hücre. Bu nedenle, HEI-OC1 bir Commo temsil kanısına varıldıCorti 2 organı duyusal ve destekleyici hücreler n progenitör. Penisilin gibi, olmayan ototoksik kabul ilaçlar, 2,3 vermedi iken Paralel çalışmalar bu hücrelerde kaspaz-3 aktivasyonu kaynaklı sisplatin, gentamisin ve streptomisin gibi ototoksik ilaçlar arketipsel güçlü deliller sağladı. Bu nedenle, bu hücre çizgisi ototoksisitenin potansiyel ototoksiklikleri veya farmakolojik ilaçların otoprotective özellikleri taranması için dahil hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için in vitro bir sistem önerilmiştir. HEI-OC1 hücreleri son on yıl içinde yayınlanan birden fazla yüz elli çalışmalarında kullanılmıştır tahmin edilmektedir. Farklı ilaçların potansiyel pro-apoptotik etkisi bakarak bu hücre hattını kapsayan çalışmaların çoğunda temel amacı iken, otofaji ve yaşlanma gibi diğer önemli hücre işlemleri sadece HEI-OC1 hücrelerinde 4-7 araştırılması başlamıştır. benna Laboratuvarımızda 8&#39;den yeni bir çalışmada, sık sık klinikte kullanılan farklı farmakolojik ilaçların yol açtığı hücre ölümü, hayatta kalma, proliferasyon, yaşlanma ve otofaji ilgili verilerin kapsamlı bir dizi toplamak için HEI-OC1 hücreler kullanılmaktadır. Ayrıca aynı tedavi HEK-293 (insan embriyonik böbrek hücreleri) ve HeLa gelenler (insan epitel hücre) Hei-OC1 hücre yanıtları bazıları karşılaştırıldığında. Sonuçlarımız, Hei-OC1 hücreleri üzerinde çalışılan mekanizmaların en az birine farklı bir doza ve zamana bağımlı bir hassasiyetle, karakteristik bir şekilde, The her ilacın yanıt göstermiştir. Biz de deney sonuçlarını doğru bir yorumu birden fazla teknikle 8 ile paralel çalışmalar yapmak gerektirdiğini Bu çalışmada vurgulanmıştır. Farklı çalışmada lüks mah fonksiyonel yanıtı, koklear dış saç hücreleri motor protein (OHCs) 9 değerlendirmek için Hei-OC1 hücrelerin kullanımı araştırılmıştır </s&gt; Yukarı. Bu izin veren (P-Hei-OC1) ve non-kültüre Hei-OC1 hücrelerinde Prestin ifade deseni, hem de doğrusal olmayan kondansatör (NLC) bütün hücre yama kenetleme çalışmaları akış sitometrisi ve konfokal lazer tarama mikroskobu incelemeleri rapor keyfi (NP-HEI-OC1) koşullar. Bizim sonuçlar, NP-Hei-OC1 hücrelerinde zamana bağlı bir şekilde, toplam Prestin sentezleme ve plazma membran lokalizasyonuna artış hem. İlginç bir şekilde, daha da bulundu toplam hücre ekspresyonunda önemli bir değişiklik olmadan sitoplazma plazma membranından transloke Na + K + ATPaz bir azalma ile ilişkili NP-Hei-OC1 hücrelerin plazma membranında Prestin lokalizasyonu artış. Ayrıca, p-Hei-OC1 hücreleri sağlam olarak kendisine plazma membranında bulunan Prestin moleküllerin yoğunluğu arttıkça azalmıştır motor fonksiyonları, Prestin ilişkili olduğunu göstermiştir. Toplamda, bu sonuçlar şiddetle HEI-OC yararlılığını destek1 hücreleri işitsel proteinleri araştırmak. Bu video makalede, nasıl ilaca bağlı sitotoksisite ve nasıl mekanizması / sn değerlendirmek için nasıl sitotoksisite çalışmaları için (P-HEI-OC1) izin veren koşullar büyüyen hücreleri kullanmak daha uygun olur neden kültür HEI-OC1 hücrelerini, açıklamak elektrofizyolojik çalışmalar yapmak (örneğin, patch-kelepçe, doğrusal olmayan kapasitans (NLC)) lüks mah, koklear OHCs moleküler motor fonksiyonel özelliklerini araştırmak için.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1447">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:905px;">HEI-OC1 cells</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:260px;">ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II Biological Safety cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>Sterilgard III</td>
			<td>AND COMPANIES INDICATED IN THE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 25</td>
			<td>EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waterbath</td>
			<td>Stovall</td>
			<td>HWB115</td>
			<td>PRODUCT COULD BE USED.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two (2) Cell incubators, one at 33&#176;C/10% CO2 and other at 39&#176;C/5% CO2</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents</td>
			<td>Greinier Bio-One</td>
			<td>664-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture dishes , PS,&#160; 60 x 15 mm with vents&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellstar tissue culture flasks&#160; 250 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658-175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellstar tissue cultur&#160; flasks 550 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660-175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;6 well cell culture plate, with lid-Cellstar</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH 7.4 (1X)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH10073.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, 0.25%&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>4890-25-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caspase-Glo 3/7 Assay&#160; kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:139px;">&#160; G8091&#160;</td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BrdU Cell Proliferation Assay Kit&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>6813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-enzymatic cell dissociation solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:139px;">&#160; G8741&#160;</td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAriaIII instrument&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>&#160;FACSAriaIII</td>
			<td>With 488 nm excitation (blue laser)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Blot Scanner</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>C-DiGit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrophoresis and Blotting Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE300 miniVE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puller for preparing patch electrodes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

working with auditory hei-oc1 cells

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 &#176;C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 &#176;C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.

Son yayınlar bir çift biz birkaç sık kullanılan farmakolojik ilaçlara HEI-OC1 hücrelerinin tepkisini değerlendirirken yanı sıra Prestin fonksiyonunu 8,9 araştırılması amaçlanmıştır çalışmaların kapsamlı bir dizi bildirdi. Bu çalışmalarda önceki bölümlerde açıklanan tüm protokollerin kullanımını yaptı. Bu önceki çalışmaların sonuçlarından biri HEI-OC1 hücreleri non-permisif...

Watch this Scientific Journal Video about Working with Auditory HEI-OC1 Cells at JoVE.com

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

İşitsel HEI-OC1 Hücreleri ile Çalışma

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.

Video: Working with Auditory HEI-OC1 Cells

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Amaxa Nucleofector İnsan Sinir Kök Hücreler Transfecting

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Biyoloji

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Theta sonrası etkileri Haritalama Fonksiyonel Görüntüleme ile İnsan İşitsel korteks üzerine Stimülasyon Burst

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Miyokard Performans ve Oksijen Tüketimi İnceleme Kemirgen Çalışma Kalp Modeli

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...