DOSTUM bir Parkinson İngiltere'de araştırma bursu (grant F1002) tarafından finanse edildi. Bu eser bir MRC yeni araştırmacı araştırma hibe tarafından (Bay/L010933/1) desteklenen bir durumdu ve PAL için ve BBSRC öğrencilik BB/M017222/1-JET tarafından Bay/N026004/1 MRC programı tarafından verin. 2014-15 kohort MPharm Bölüm 1 öğrencilerin üniversite okuma geribildirim ve giriş için bu pratik ve sonraki tabur ilk yinelemesi katılan için teşekkür ediyoruz.

Not: Aşağıdaki protokol iki saat (Tamamlanma sınıfının çalışma sayfalarının dahil) boyunca yapılacak bir amaca öğretim laboratuvarda geliştirilmiştir. Kasıtlı olarak deneysel merdiven were yerine birlikte enzim kinetiği (model verileri kullanarak bu ders kapsamında yürütülen); daha ayrıntılı bir analiz dışlamak için Ancak — tartışmada belirtildiği gibi — protokol zaman, imkanları ve öğrenci ilerilik düzeye bağlı olarak daha gelişmiş analizler için bir şablonu sağlar.
Güvenlik: Bu pratik iyi kimyasal laboratuvar uygulama (GCLP) kurallarına göre yapılmalıdır — sıkıya laboratuvar ceket, tek kullanımlık eldiven ve koruyucu gözlük de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman aşınmış her zaman laboratuvarda .
1. enzim ayıklanıyor
<ol><li>Bir laktaz enziminin bir harç ve havaneli kullanarak bir hatta toz için 200 mg içeren tablet, ezmek.</li>
	<li>Elde edilen toz "askıya alma" etiketli bir 15 mL tüp içine yerleştirin ve 10 mL 100 mM fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspend.</li>
	<li>Enzim ayıklama en üst düzeye çıkarmak için 1 dakika için girdap.</li>
	<li>1 mL süspansiyon tortu katı parçacıklar bir 1,5 mL santrifüj tüpü ve 10.000 x g , 1 dk santrifüj içine aktarın.</li>
	<li>500 µL süpernatant, "Laktaz özü" etiketli bir temiz 1.5 mL tüp aktarın.</li>
</ol>2. gözlem kolorimetrik reaksiyon
<ol><li>Yer 390 µL 100 mm PBS 1,5 mL tüp içine "A tepki" etiketli.</li>
	<li>5 mM ONPG çözüm ve mix 100 µL de vortexing tarafından ekleyin. Dikkat: Bu pratik ortho kullanır-Nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) laktoz için bir yedek olarak. Bu yana ONPG fenolik bileşiktir, dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. ONPG ile cilde temas durumunda maruz kalan deri hemen yıkanmalıdır. Herhangi bir sıvı sıçraması hemen uygun atık akımına bertaraf edilecek kağıt havlu ile sildi.</li>
	<li>Tepki A tüp ve karışımı içine ekstresinin 10 µL de vortexing tarafından ekleyin.</li>
	<li>Reaksiyon karışımı 5 dakika boyunca gözlemlemek ve çözüme Renkölçer değişiklikleri not edin.</li>
</ol>3. ölçme enzim aktivitesi
<ol><li>İki 1,5 mL tüpler ayarla: bir "Tepki B", bir etiketli "Denetim" etiketli.</li>
	<li>100 mm PBS 390 µL tepki B tüp, 100 mm PBS denetim tüp için 400 µL ekleyin ve 5 mm ONPG 100 µL her tüp için ekleyin.</li>
	<li>İçeriği tarafından vortexing karıştırın.</li>
	<li>Laktaz ekstresinin 10 µL tepki B tüp eklemek, vortexing tarafından mix ve oda sıcaklığında 1 dk. için devam etmek tepki sağlar.</li>
	<li>1 dk. geçtikten sonra 1 M sodyum karbonat 500 µL böylece tepki sonlandırma pH artırarak Laktaz enzim inhibe her iki tüpler ekleyin.</li>
	<li>500 µL her tüpünden temiz spektrofotometre cuvettes aktarmak ve 420 absorbans ölçmek spektrofotometre kullanarak nm.</li>
	<li>Absorbans tepki B ve kontrol örnekleri için Not ve denetim değeri ONPG hidroliz etkin enzim huzurunda nedeniyle absorbans değişimi türetmek için tepki değerinden çıkarın.</li>
</ol>4. sıcaklık üzerindeki etkisi enzim aktivitesi
<ol><li>Üç kontrol tüpleri ve üç tepki tüpler madde 3 te açıklandığı gibi ayarlayın ve bunlar etiket "4 ° C", "Oda sıcaklığında" ve "37 ° C".</li>
	<li>Enzim ilavesi ayıklamak, buz, oda sıcaklığında, diğeri (önceden ısıtılmış su banyosunda) 37 ° C'de bir tüp kuluçkaya.</li>
	<li>Reaksiyonlar için 1 dk sürdürmek ve her tüp için 500 µL 1 M sodyum karbonat ekleyerek reaksiyon sona erdirmek izin.</li>
	<li>420 absorbans ölçmek için madde 3 te açıklandığı gibi her tüpün nm. Denetim değeri her durumda tepki değerinden çıkarılarak değerlerini kaydedin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, J. G., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Jittam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+seaweed+enzyme-catalyzed+bromination+of+bromophenol+red:+An+inquiry-based+kinetics+laboratory+experiment+for+undergraduates.">Red seaweed enzyme-catalyzed bromination of bromophenol red: An inquiry-based kinetics laboratory experiment for undergraduates.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 37, 99-105 (2009).</li><li>Troelsen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult-type+hypolactasia+and+regulation+of+lactase+expression.">Adult-type hypolactasia and regulation of lactase expression.</a> Biochimica et biophysica acta. 1723, 19-32 (2005).</li><li>Juers, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+view+of+the+action+of+Escherichia+coli+(lacZ)+beta-galactosidase.">A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase.</a> Biochemistry. 40, 14781-14794 (2001).</li><li>Plimmer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+lactase+in+the+intestines+of+animals+and+on+the+adaptation+of+the+intestine+to+lactose.">On the presence of lactase in the intestines of animals and on the adaptation of the intestine to lactose.</a> Journal of Physiology. 35, 20-31 (1906).</li><li>Krebs, H. A., Salvin, E., Johnson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+citric+and+alpha-ketoglutaric+acids+in+the+mammalian+body.">The formation of citric and alpha-ketoglutaric acids in the mammalian body.</a> The Biochemical journal. 32, 113-117 (1938).</li><li>Vesa, T. H., Marteau, P., Korpela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactose+intolerance.">Lactose intolerance.</a> Journal of the American College of Nutrition. 19, 165S-175S (2000).</li><li>Robayo-Torres, C. C., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+of+congenital+lactase+deficiency+from+adult-type+hypolactasia.">Molecular differentiation of congenital lactase deficiency from adult-type hypolactasia.</a> Nutrition Reviews. 65, 95-98 (2007).</li><li>Swallow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lactase+persistence+and+lactose+intolerance.">Genetics of lactase persistence and lactose intolerance.</a> Annual Review of Genetics. 37, 197-219 (2003).</li><li>Enattah, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+introduction+of+two+lactase-persistence+alleles+into+human+populations+reflects+different+history+of+adaptation+to+milk+culture.">Independent introduction of two lactase-persistence alleles into human populations reflects different history of adaptation to milk culture.</a> American Journal of Human Genetics. 82, 57-72 (2008).</li><li>Lowe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rapid+detection+of+lactose+fermentation+in+paracolon+organisms+by+the+demonstration+of+beta-D-galactosidase.">The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of beta-D-galactosidase.</a> Journal of Medical Laboratory Technology. 19, 21-25 (1962).</li><li>Russo, S. F., Moothart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+study+of+the+Enzyme+Lactase.">Kinetic study of the Enzyme Lactase.</a> Journal of Chemical Education. 63, 242 (1986).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Detaylı bilgi ve anlayış enzim, Enzimatik reaksiyonları ve enzim kinetiği biyoloji, biyomedikal ve farmakoloji kapsayan konular geniş bir yelpazesi için gerekli. Yukarıda açıklanan protokol Laktaz enzim insan sağlığı için ilgili bir örnek olarak daha gelişmiş laboratuar tabanlı deneylerde kullanılan anahtar becerileri sağlayarak enzimatik reaksiyonlar gösteren için kullanır.
Bu iletişim kuralı kasıtlı olarak yorumlanabilir sonuçları kısa bir alanda üretmek için az veya hiç ıslak laboratuvar deneyimi mümkün, izin öğrenciler olarak sağlam olması için dizayn edilmiştir. Reading Üniversitesi School of eczane 2014/2015 öğretim yılında toplam 144 öğrenci 3, gruplar halinde düzenlenmiş, tüm grupları belli bir düzeyde laktaz tabletten enzimatik aktivite tespit etmek mümkün ile "laktaz ölçme" deneme yürüttü ayıklar.
Bu protokol önemli adımlar vardır. İlk olarak, ilk çıkarma verimli, daha sonraki analizler için yeterince etkin enzim solubilization izin önemlidir. Deneyim, ilk yıl lisans öğrencileri bu özetlenen iletişim kuralı takip ederek elde edebilirsiniz; Ancak bazı rehberlik laboratuvar göstericiler gelen bu noktada gerekli oldu. Bu çok aşikar bir nokta gibi görünüyor olsa da, bu protokol başarısında önemli bir faktör dikkatle birimleri ölçmek, doğru tüpler etiket ve yönergeleri izleyin yeteneğidir. Yeterlilik belirli bir düzeyde çok sayıda öğrenci, dikkatli izleme ve öğrencilerin onlar değilseniz durumunda yardım için sormak açık bir istek için kabul edilebilir ne yapacağımı sonraki en büyük başarılı bir tahlil olasılığını sağlar.
Öğrenci değerlendirme deneyler, yorum onların sonuçları ve arka plan bilgi/okuma bağlantı ders malzemesinden verilerden dikkat edilmesi gereken öğrenciler soran sınıfının çalışma sayfası (ek malzeme olarak kullanılabilir), veya daha fazla tarafından yürütülen olabilir ayrıntılı sınıf değerlendirmesi ile sağlanan modeli veri kinetik analizler için çalıştı ve değerlendirilmesi için izin dışarı.
Burada sunulan protokolü bir laktaz aktivitesi tahlil öğretim laboratuvar koşulları altında basit bir örneğidir ve bol bol fırsat daha gelişmiş analizler izin için deney karmaşıklığını artırmak için. Özellikle, sunulan Protokolü enzim kinetiği kavramı bir giriş sağlar ancak deneysel veriler kinetik analizi için izin vermez. Bu nedenle, biz açıklanan protokolü ile ilgilenen özel amaçları ve deneyler taahhüt öğrenci kohort yeteneklerini uygun şekilde adapte kesin detayları ile sınıflar için ilk bir şablon olarak tavsiye ederim. Genişletilmiş deneyler örnekler: tekrarlanan ölçümleri istatistiksel analizi, ile başlayan kinetik, veri çözümlemesi (Biyokimya öğrenciler/majors için uygun) izin vermek için farklı substrat konsantrasyonu kullanarak farklı sıcaklıklarda birkaç farklı tablet ve farklı her (kontrol tabletler, adli tıp öğrencileri/majors için uygun eklenmesiyle) enzim aktivitesinin değerlendirmek öğrenciler, ısı denatürasyon etki değerlendirme veya rekabeti taşıyan laktoz eklenmesi veya laktaz (Tablo 1) inhibitörleri deneyler. Detaylı bir protokol laktaz kinetik analizi için daha önce yayımlanmış12oldu.
Bu protokol önemli bir gücü bu Enzimologiya tıpta bir gerçek vaka çalışması ile Enzimologiya ve enzim kinetiği temel bir giriş birleştirir kaldı. Bu bu laboratuvar yapar deneme ilaç, eczane, biyomedikal Bilimler ve ilgili konuları öğrencilere belirli konu ile ilgili. Önemlisi, ciddi bir tıbbi durumun ve daha yaygın bir diyet sorunu laktoz katabolizma ile ilişkili olduğu gerçeğini çok çeşitli tıbbi ve etik sorunları ile öğrenciler yetiştirmek için fırsat sağlar. Bu gen terapisi ve genetik danışmanlık, hem de kullanımı ve Satılık tıbbi ilave için ilgili tartışmalar ilgili ve tıbbi durumlar için genetik test çevre sorunları içerebilir. Bir büyük protokolü çıkarma için kullanılan başlangıç malzeme nedeniyle enzim konsantrasyon kesin tahmini için izin değil kısıtlamadır. Bunun için hesap için bir değişiklik ancak, reaktif sınıf enzim tayini için kullanmak olacaktır. Önemlisi, bu da kinetik Laktaz enzim için daha kesin hesaplanması için sağlayacak.
Sonuç olarak, etkinliğin raporlaması laktaz bir öğretim laboratuvarda, ortamı bir sağlam, ilgi çekici ve ilginç giriş alanı enzim Biyoloji erken evre için üniversite öğrencileri niteliğindedir.

Özel bir tür yaşam vücudunda kimyasal reaksiyonlar için biyolojik katalizör görevi protein enzimlerdir organizmalar1. Enzimler, kaybı atılması ve organizmaların çalışması izin enerji sağlayan hayat için önemli bir eylemdir. Anlayış enzimler önemlidir, bu nedenle, hayat tam bir anlayış. Böyle bir bilgiye Tıp Bilimleri biyoloji Üniversitesi seviye derecesi programları, geniş bir yelpazesi için esastır. Kataliz ilkeleri enzim aktivitesinin teorik modeller arasında değişen ayrıntılı bir arka plan için öğrencilerin ders kullanarak ve malzeme okuma sağlanabilir iken, enzim reaksiyonları özelliklerini en iyi pratik deneyimi üzerinde eller tarafından anlaşılan enzimler eylem daha önce2gösterdi. Bu iletişim kuralı Laktaz enzim ile insan beslenme ve sağlık ile ilgili etkinlik örneği olarak kullanarak laboratuvar koşullarında enzim etkinliği ölçmek için deneysel paradigma izleyin kolay sağlar.
Glycosidic hidrolaz laktaz (AK 3.2.1.23/26) memeliler3için merkezi beslenme önemli bir enzimdir. Laktaz aktivitesi evrim son derece korunmuş ve enzimler beta galaktozidaz aileden gelen türetir — bir aile Homo sapiens (1 rakam, PDB 1JZ8)4' e Escherichia coli gelen mevcut. Daha sonra vücutta enerji üretmek için kullanılabilir kurucu yaşam bileşenlerinden içine laktoz dökümü izin rolüne laktaz bir insan beslenme ortamda kritik önemini kaynaklanmaktadır. Laktaz tromboksan hidroliz galaktoz ve glikoz (Şekil 2) serbest disaccharide laktoz glycosidic Bond5. Bu bol daha sonra öncelikle nesil adenozin trifosfat (ATP) üzerinden sitrik asit döngüsü ve Oksidatif fosforilasyon6için kullanılır. Yenidoğan ve bebek gelişimi sırasında laktaz son derece insan sindirim sistemi, anne sütü hangi laktoz birincil karbonhidrat bileşeni ve beslenme en önemli kaynaklarından biridir ilk yıllarında alınan laktoz aşağı kırma olarak ifade edilir 7. konjenital laktaz eksikliği (CID), nadir otozomal resesif koşulu laktaz gen (LCT) için Laktaz enzim8kodlama mutasyonlar neden laktaz tıbbi önemi vurgulanır. Yeni doğmuş bebekler suç araştırma departmanı ile çok az laktaz aktivitesi sergi, böylece onlar meme süt, süt ya da laktoz içeren formül başka tür beslenen olamaz.
Çocukluk çağında laktaz ifade normalde azalır; Ancak, bu azaltma sütten kesme takip coğrafi olarak, yaklaşık yetişkin enzim9ifade etmek dünya çapında devam eden % 35 ile değişir. Laktaz kalıcı bilinen laktaz, sürekli ifade bireyler süt ve süt ürünleri kaynakları bir dizi sindirmek devam etmek izin verir. Diğer taraftan, laktaz ifade kaybı laktoz intoleransı, olarak da bilinen yetişkin tipi hypolactasia (ATH), laktoz gut yıkmak için bir yetersizlik nedeniyle yol açabilir. ATH bir yapı tarafından yukarı laktoz laktoz gıda ürünleri içeren sindirim takip kolon ile karakterizedir. Kolon, bağırsak mikrobiyal fauna hidrojen, metan ve karbon dioksit gibi gazlar serbest tarafından birikmiş laktoz fermente. Laktaz enzim eksiklikleri ile bireylerde bu gazların üretimi teşvik abdominal şişkinlik, artan şişkinlik, ağrı, bulantı ve borborygmi (karın guruldama)7. Laktoz sindirim sistemi içinde daha yüksek düzeyde de gevşek dışkı neden olabilir.
LCT gen ekspresyonu kontrolünü yakındaki MCM6 gen intron içinde bulunan polimorfizmleri tarafından modüle. Laktaz sürekli ifade olan bireyler böylece normal sütten kesme sırasında LCT transkripsiyon aşağı karşılayan güçlü distal arttırıcılar LCT gen ifade olarak işlev polimorfizmleri taşımak ve sonuç olarak yetişkinlik3ifadede laktaz sürdürülmesi. Olumlu evcilleştirme, sığır ve deve Orta Doğu'daki aşağıdaki beş bin yıl önce seçilmiştir için önerilen artırıcı polimorfizmleri9,10.
ATH--dan kaynaklanan belirtiler laktoz alımı, örneğin diyet süt ürünleri kaldırarak azaltarak yönetilebilir. ATH için alternatif bir yaklaşım ve CID için tercih edilen yaklaşım laktaz takviyeleri, eczanelerden yaygın olarak kullanılan kullanmaktır. Bu takviyeleri laktaz kaynakları, mantar ve bakteri, ile çekilen veya gıda içeren laktoz eklenen bir sıvı veya hap tabanlı form dahil olmak üzere çeşitli izole sağlar. Ek laktoz mevcut gıda glikoz ve galaktoz ürünleri, böylece kendi emilimi erişimine izin verme ve sindirilmemiş laktoz substrat gut birikimi engelleyen bir kısmı hidrolize.
Laktaz takviyeleri diyet bir yardım olarak kullanmak dayanarak, biz ilk yıl Biyomedikal Bilim veya eczane öğrenciler için uygun bir basit Enzimologiya laboratuvar deneyi geliştirdik. Bu laboratuvar deneyi, piyasada bulunan laktaz takviyeleri ve kullanımları ortho yararlanır-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside (ONPG) ( laktaz tarafından bölünme glycosidic tahvil ölçmek için kolorimetrik bir bitiş noktası sağlamak için Şekil 3)11. ONPG davranır laktaz için yapay bir substrat olan bu enzim tarafından hidroliz tabi D-galaktoz ve Orto-nitrophenol üretir. İkinci ürün bir dalga boyu 420, ışık emici sarı bir renge sahiptir nm. 420 nm şu absorbans herhangi bir değişiklik miktarının tarafından ONPG maruz kalma laktaz, bu enzim aktivitesini tahmin etmek mümkündür. Bu laboratuvar deneyi enzimatik hidrolaz etkinlik gösterimini sağlar. Ek çoğaltır bina ve farklı koşullarda deneyleri yürüten, enzim kinetiği, değerli bir gerçek hayattan örnek eylem insan sağlığı için ilgili enzimlerin sağlayan daha gelişmiş analiz dahil etmek mümkündür.

<table><tbody><tr><td>Lactase tablet</td><td>Lamberts</td><td>8511-60</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (powdered)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM</td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Sigma</td><td>N1127</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate</td><td>Sigma</td><td>451614</td><td>Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M</td></tr><tr><td>De-ionized water</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pestle and mortar</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Jenway 6315</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer cuvettes</td><td>Jenway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex genie 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing scales</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring lactase enzymatic activity in the teaching lab

Enzimlerin çalışma şeklini anlamak ve bu gerçek hayattan örnekler için ilgili biyolojik ve Biyomedikal Bilimleri lisans dereceleri geniş bir yelpazesi için önemlidir. Bu takip edilmesi kolay iletişim kuralı ilk yıl lisans eczane öğrenciler için geliştirilmiş ve enzim analizi için enzim reaksiyonları ve analitik işlemleri giriş seviyesi bir giriş sağlar. Bu piyasada bulunan enzim insan hastalık/ilaç uygulama için ilgili bir örnek gösterir gibi seçim laktaz, enzimdir. Laktaz besin takviyesi tabletler ayıklanır ve laktaz için yapay bir substrat hidroliz dayanan kolorimetrik bir tahlil kullanarak değerlendirildi (ortho-nitrophenol -beta-D-galactopyranoside, ONPG). Orto-nitrophenol ONPG hydrolytic bölünme laktaz tarafından takip sürümü değişiklik 420 absorbans ile ölçülen nm ve sıcaklık etkisi enzimatik reaksiyon reaksiyon buz, oda sıcaklığında ve 37 gerçekleştirerek değerlendirilir ° C. Daha gelişmiş analiz enzim etkinliği farklı koşullar altında değerlendirilmesi ve farklı reaktifler kullanarak bu protokolü kullanarak uygulanabilir.

İletişim kuralı Bölüm 2 için temsilcisi sonuçları Şekil 4Aiçinde gösterilir. Serbest ONPG hidrolize olarak laktaz tablet özü içeren tepki çözüm sarı döner iken Laktaz enzim, yokluğunda denetim tepki açık kalır Orto- nitrophenol. Şekil 4B rasgele birimleri iletişim kuralı, aşağıdaki analiz spektrofotometre kullanarak örnekleri bölüm 4'ten kullanarak miktar gösterir. Reaksiyon 37 ° C'de yürütülürken Orto-nitrophenol reaksiyon buza inkübe zaman en düşük ve en yüksek yapımıdır
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig1.jpg"> Resim 1 : E. coli beta galaktozidaz. (A)beta-galaktozidaz aktif tetrameric yapısı karmaşık gösterilen Escherichia coli, gelen kristal yapısı. (B) Allolactose (kırmızı ile gösterilen) beta galaktozidaz aktif sitesine bağlanır. PDB 1JZ84oluşturulan görüntüler. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54377/54377fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig2.jpg"> Resim 2 : Laktaz enzim eylem. Laktoz laktaz beta-D-galaktoz ve beta-D-glukoz üretmek tarafından hidroliz. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54377/54377fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig3.jpg"> Şekil 3 : Hidroliz, Orto-nitrophenol - Beta -D-galactopyranoside. ONPG hidroliz beta-D-galaktoz ve Ortopedi-(sarı renkte olan) 420 absorbans ölçümü tarafından tahmin laktaz faaliyet izin nitrophenol, üretmeye laktaz tarafından nm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54377/54377fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54377/54377fig4.jpg"> Şekil 4 : ONPG hidroliz. Denetim ve tepki tüpler(a)ve Bölüm 4 Protokolü'nün temsilcisi verileri gösteren ONPG hidroliz temsilcisi sonuçlarını, kaydedilen ham absorbans 420 rasgele daxilində gösteren sınıfındaki sayfalarındaki nm, arka plan için düzeltilmiş ve üç farklı sıcaklıklarda (B). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54377/54377fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Deneysel durumu</td>
			<td>Deneysel değişkenleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sıcaklık</td>
			<td>0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Substrat konsantrasyonu</td>
			<td>0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rekabetçi inhibisyon</td>
			<td>5 mM ONPG artı 0 mM, 1 mM, 5 mM veya 10 mM laktoz</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zaman bağımlılığı</td>
			<td>0 s, 15 s, 30 s, 1 dk, 5 dk, 10 min, 20 dk</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isı denatürasyon</td>
			<td>Laktaz özü ile 100 ° C arasında 10 dk önceden tahlil için ısıtmalı</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: deneysel durumu genişletilmiş potansiyel. Laktaz biyoloji belirli yönlerini araştırıyor nüsha gerçekleştirilebilmesi için genişletilmiş deneyler önerdi.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab at JoVE.com

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Laktaz enzim aktivitesinin disaccharide laktoz katabolik işleme için gereklidir. Burada, diyet takviyeleri bulunan laktaz aktivitesi kolorimetrik bir tahlil kullanılarak denenecektir. Bu deneysel bir platformla laktaz ve enzim kinetiği etkinliğini anlamak için öğrencilere sağlar.

Laktaz enzim etkinliğin ölçülmesi öğretim laboratuarında

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

measuring-lactase-enzymatic-activity-in-the-teaching-lab

Universidad de Cartagena UDEC

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Biology

Analytical Chemistry

Anatomy and Physiology

Unit 1

Biochemistry of the Cell

Fundamentals of Chemistry

Energy and Catalysis

Chemical Applications of Statistical Analyses

SCIENTISTS IN ACTION

113.0K Görüntüleme.  University of Reading. Laktaz enzim aktivitesinin disaccharide laktoz katabolik işleme için gereklidir. Burada, diyet takviyeleri bulunan laktaz aktivitesi kolorimetrik bir tahlil kullanılarak denenecektir. Bu deneysel bir platformla laktaz ve enzim kinetiği etkinliğini anlamak için öğrencilere sağlar.

Video: Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ metabolic activity assays can provide information about the spatial distribution of metabolic activity within a tissue. We provide here a detailed protocol for monitoring the activity of the enzyme lactate dehydrogenase directly in tissue samples. Lactate dehydrogenase is an important determinant of whether consumed glucose will be converted to energy via aerobic or anaerobic glycolysis. A solution containing lactate and NAD is provided to a frozen tissue section. Cells with high lactate dehydrogenase activity will convert the provided lactate to pyruvate, while simultaneously converting provided nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to NADH and a proton, which can be detected based on the reduction of nitrotetrazolium blue to formazan, which is visualized as a blue precipitate. We describe a detailed protocol for monitoring lactate dehydrogenase activity in mouse skin. Applying this protocol, we found that lactate dehydrogenase activity is high in the quiescent hair follicle stem cells within the skin. Applying the protocol to cultured mouse embryonic stem cells revealed higher staining in cultured embryonic stem cells than mouse embryonic fibroblasts. Analysis of freshly isolated mouse aorta revealed staining in smooth muscle cells perpendicular to the aorta. The methodology provided can be used to spatially map the activity of enzymes that generate a proton in frozen or fresh tissue.

We describe a protocol for mapping the spatial distribution of enzymatic activity for enzymes that generate nicotinatmide adenine dinucleotide phosphate (NAD(P)H) + H+ directly in tissue samples.

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Biyokimya

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed after a single injection of the substrate solution into an enzyme solution is correlated with enzyme activity. Multiple injections of the substrate into the same enzyme solution over time show the loss of enzyme activity. The assay is autonomous, requiring very little personnel time, and is applicable to most media and enzymes.&#160; &#160;

The thermal stability of enzyme activity is readily measured by isothermal titration calorimetry (ITC). Most protein stability assays currently used measure protein unfolding, but do not provide information about enzymatic activity. ITC enables direct determination of the effect of enzyme modifications on the stability of enzyme activity.

İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Çevre

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biyoloji

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>Elastaz Modülasyonunun Ölçülmesi: Terapötik İçgörüler için Kolorimetrik Bir Test

Quantifying the Modulation of Elastase Enzyme Activity Through Colorimetric Analysis

Elastase, a serine protease, plays an essential role in elastin degradation. Elastin is an extracellular protein that helps maintain tissue elasticity in the lungs, skin, and blood vessels. Tight regulation of elastase activity is crucial for tissue homeostasis, as dysregulation can contribute to pathologies such as emphysema, wrinkles, and atherosclerosis. Some compounds, such as naturally occurring phytochemicals, have shown potential for therapeutic intervention and have attracted significant interest. Elucidating the modulatory effects of different compounds on elastase, whether inhibitory or stimulatory, is crucial for developing novel therapeutic and cosmetic strategies targeting elastase-associated disorders. A widely accepted method for measuring elastase activity is the colorimetric elastase assay. In this assay, a specific substrate is used to break down elastase, releasing a detectable yellow compound, p-nitroaniline (pNA). The amount of pNA produced reflects elastase activity in the sample and can be measured by colorimetry. This assay offers several benefits, including simplicity, high sensitivity, rapid results, and adaptability to various research needs. The colorimetric elastase assay remains a valuable tool for studying how compounds impact elastase activity. Due to its ease of use and effectiveness, this assay is a cornerstone of research in this field.

<meta charset="utf8"></head><body>Kolorimetrik Analiz ile Elastaz Enzim Aktivitesinin Modülasyonunun Ölçülmesi

This protocol describes the development of a colorimetric assay method for determining the ability of compounds to inhibit or activate elastase activity.

Kolorimetrik Analiz ile Elastaz Enzim Aktivitesinin Modülasyonunun Ölçülmesi

Elastase, a serine protease, plays an essential role in elastin degradation. Elastin is an extracellular protein that helps maintain tissue elasticity in ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Quantifying Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Source: Luhr, M. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57971">The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an assay for assessing bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells. It utilizes electroporation to release cytosolic proteins, including lactate dehydrogenase (LDH). The sequestered LDH and total cellular LDH fractions are determined to assess LDH sequestration, providing insights into the overall bulk sequestration activity.

Memeli Hücrelerinde Toplu Otofajik Sekestrasyon Aktivitesinin Ölçülmesi

1. Cell Seeding and Treatment

	Culture adherent cells in 75 cm2&#160;tissue culture flasks in a humidified incubator with 5% CO2&#160;at 37 &#176;C, ...

Laktaz enzim etkinliğin ölçülmesi öğretim laboratuarında

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Eşleme metabolizma: doğrudan dokusunda laktat dehidrogenaz etkinliğini izleme

İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

Kolorimetrik Analiz ile Elastaz Enzim Aktivitesinin Modülasyonunun Ölçülmesi

Kolorimetrik Analiz ile Elastaz Enzim Aktivitesinin Modülasyonunun Ölçülmesi

Kolorimetrik Analiz ile Elastaz Enzim Aktivitesinin Modülasyonunun Ölçülmesi

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Memeli Hücrelerinde Toplu Otofajik Sekestrasyon Aktivitesinin Ölçülmesi