Biz yararlı tartışmalar için Mohammad Saleem, Jing Wu ve Krishnan Raghunathan teşekkür etmek istiyorum. Biz de çekimler sırasında yardım için Priya Begani teşekkür ederiz. Bu eser (AO) R01 AI071727 ve (SLV için) R01 GM110052 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmektedir.

1. Gün: buğday tohumu Lizat tabanlı In Vitro Transkripsiyon-çeviri Sisteminin Kullanılması Gag Proteinlerin İfadesi HIV-1 Gag hazırlanması 1. <ol><li> (-20 ºC diğer reaktifler buğday tohumu lizatları -80 ºC &#39;de saklanır) dondurucular ticari buğday tohumu CECF kiti tüm reaktifleri çıkarın. Buz üzerine çözülme ve Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi, bileşenler karışımı. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (Besleme mix) </td><td></td></tr><tr><td> besleme çözümü </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> Amino asitler </td><td> 80 ul </td></tr><tr><td> metionin </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Genel Toplam </td><td> 1000 ul </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Karışım-2 (Lizat mix) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> wheatgerm lizatları </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNaz ücretsiz su </td><td> 7 ul </td></tr><tr><td> Amino asitler </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> metionin </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> TE tamponunda Plasmid DNA (1 ug / ul) ** </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Reaksiyon tampon Maddesi </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Genel Toplam </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 1: buğday tohumu reaksiyonları için gerekli olan karışımların bileşimler. Not: Deney bağlayıcı Gag zar üzerinde RNaz RNA çıkarılması etkisini incelemek üzere tasarlanmış ise, RNaz içermeyen su ile ribonükleaz inhibitörleri değiştirin. Plazmid DNA, üretici talimatlarına uygun olarak yabancı maddelerden arındırılmış olmalıdır. Bununla birlikte, slasmids alışılmış kullanılarak hazırlandı, ancak endotoksin içermeyen plazmit izolasyonu teçhizatı başarılı bir şekilde kullanılmıştır değildir. Üreticinin talimat da nükleaz içermeyen suda çözünmüş DNA kullanılmasını önerir. TE [10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA ihtiva eden (pH 7.4)] içinde süspanse edilmiş DNA kullanılarak durumunda, TE içinde EDTA verim etkileyebilir, çünkü DNA daha düşük konsantrasyonlarını kullanmayın. 0.8-1 mg / ml bir konsantrasyon aralığında TE tamponu içinde çözülmüştür plazmid başarıyla kullanılmıştır. <ol start="2"><li> İlk reaksiyon kaset (saydam odacık) içine Besleme karışımı (Mix-1) ekleyin. Sonra diğer odasının (kırmızı) için lizat karışımı (mix-2) ekleyin. kendi odalarına karışımları eklerken bu çözüm bileşenlerinin verimsiz alışverişi yol ve bu nedenle reaksiyon etkinliğini azaltabilecek herhangi bir kabarcıkları tanıtmak etmeyin. </li><li> kiti ile sağlanan yapışkan film ile odaları kaplayın. </li><li> Kaset tutucu ve doğmuş iyileşmesini içine reaksiyon kaset takınte bir Eppendorf Termomikserin R. 900 rpm sabit sallayarak hızında 24 ° C&#39;de 24 saat süreyle montaj </li></ol> 2. Gün: Electroformation ve Hasat buğday tohumu Lisatlardan hazırlayın GUVs GUVs 2. hazırlanması <ol><li> Böyle teflon gömlekleri ile kaplı ve Parafilm ile sarılmış, vidalı kapakları cam şişelere kloroform veya kloroform karışımları ve metanol gibi inorganik çözücüler içinde çözünmüş Kısım lipidler. Hamilton-tipi cam şırınga ile lipidler Kulp, ya da varsa, kloroform dayanıklı plastik ipuçları. -20 ºC dondurucu GUV hazırlanması için kullanılacak lipit içeren cam şişeleri dışarı atın. <ol><li> Şişeler oda sıcaklığına dengelenir sonra, lipid süspansiyonlar açık görsel inceleme ile emin olun. Bu palmitoil-oleoil fosfatidilserin (POP) ve PI (4,5) P2 gibi lipitler, özellikle asidik lipidler, kalitesi, başarılı bir şekilde deneyler için önemlidir. olan lipidler kullanmayındaha uzun bir süre, 2 ay boyunca parçalar halinde. </li></ol></li><li> istenen sıcaklığa ısı bloğu önceden ısıtmak. Bu sıcaklık en Tm lipid (ler) in erime sıcaklığı (Tm) en az 5 ° C daha yüksek olmalıdır. </li><li> İstenilen molar lipit oranlarına göre ihtiyaç duyulan lipid hacimleri hesaplayın. Tablo 2&#39;de gösterildiği gibi, burada bağlama HIV-1 Gag eğitim için aşağıdaki molar oranları kullanın. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> lipid karışımı </td><td> Molar oran </td><td> Hacim (ul içinde) </td><td> stok konsantrasyonu </td></tr><tr><td> POPC + kol POPS </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19,74 + 10,18 + 6,57 </td><td> POPC, POPS, Kol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Beyin-PI (4,5) P2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, Kol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Beyin-PI (4,5) P2: 1 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Farklı lipit Birimleri GUVs elde etmek için kullanılır. <ol start="4"><li> Temiz vidalı kapaklı bir cam viyal içine lipidlerin, istenen miktarlar ekleyin. </li><li> Kullanım (katalogda tarif edildiği gibi) boyutlarında 25 x 50 x 1,1 mm 3 ve direnç 70-100 omega slaytlarını ITO kaplı. Temiz bir bankta iki ITO kaplı slaytlar yerleştirin. Her electroformation bölmesi iki indiyum-kalay-oksit (İTO) kaplı cam slaytlar gerektirir. cam slayt iletken yan bir multimetre kullanarak direnç kontrol ederek yukarı baktığından emin olun. Yaklaşık 200 Ω değeri göstermesi gerekir. slaytlar yüzeyi hafifçe havsız mendil kullanarak% 70 etanol ile silerek temiz olduğundan emin olun. </li><li> ri ile şırınganın iğne dış yüzeyi temizlemekloroform ile nsing ve ısı bloğu üzerine şırınga yerleştirin. </li><li> yukarı bakacak şekilde iletken tarafı ısı bloğu üzerinde yeni bir ITO-kaplı cam slayt yerleştirin ve genellikle istenilen sıcaklığa yaklaşık 2-3 dk gelmesini sağlayınız. cam slaytlar İTO kaplama prosedürleri temizlik esnasında hasar görmüş olabilir o potansiyel bir risk için ITO-kaplı cam slaytlar tekrar kullanmayın. </li><li> üniforma ve cam slayt lipitlerin yayılması henüz hızlı için her slayt için lipit karışımı 40-50 ul hacmi kullanın. kloroform gibi uygun bir organik çözücü ile toplam hacmi ayarlayın. <ol><li> Cam slayt lipid karışımın toplam hacminin yarısına yerleştirin ve hemen (slaytta iğne 2-3 kez hareketli) muntazam bir lipid filmi terk etmek için temizlenir şırınga (aşama 2.6) kullanarak lipid yayıldı. İnce İTO kaplama zarar görmemesi için yavaşça (ama hızlı bir şekilde) lipit sürün. Düzgün olmayan yayma ya da sub-optimal yol açabilir yayılan kabaverimleri veya GUVs hesaplama heterojen. </li><li> Bu nedenle, sonraki adıma geçmeden önce yayılmış lipit filmi inceleyerek üniforma yayılmasını sağlamak. Filmin donukluk aşırı olmayan üniforma belirirse, yeni bir slayt kullanarak işlemini tekrarlamanız. </li></ol></li><li> kaplanmış yüzü yukarı bakacak şekilde bir Petri kabı içine kaplı slayt yerleştirin. </li><li> Tekrarlayın başka ITO kaplı slayt kullanarak karışımın geri kalanı için 2.6-2.9 adımları tekrarlayın. </li><li> Organik çözücülerin arındırıldı 60-90 dakika boyunca geleneksel bir vakumlu kurutma bölmesi içinde kayar her ikisini ihtiva eden bir petri tabağına yerleştirin. </li><li> Bu işlem sırasında, ısıtma bloğu (çoğu durumda 65 ° C) ve önceden sıcak 300 mM inkübatör sukroz çözeltisi ile aynı sıcaklığa inkübatör ayarlayın. </li><li> Kuruduktan sonra, tezgah petri getirmek ve temiz bir yüzeye cam slayt yerleştirin. </li><li> Yavaşça% 70 etanol ve kuru o Comple kullanarak bir PDMS conta (Şekil 1) temizlemektely. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterilen ve yavaşça ve sıkıca conta şekilleri bir su geçirmez sızdırmazlık böylece pres lipid kaplı cam slayt üzerine yerleştirin. PDMS conta ve slayt arasındaki boşlukların olmaması onaylayın. Bu sakroz çözeltisi sahip sığ bir bölme oluşumu ile sonuçlanır. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Şekil 1:. Electroformation için kullanılan ITO kaplı cam slayt düzeni <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="16"><li> herhangi kabarcığı olmadan önceden ısıtılmış sakaroz çözeltisi ile odasına doldurun. </li><li> sıkı bir mühür yapmak için üstüne başka kaplı slayt yerleştirin. hava kabarcığı olmadığından emin olun. Son montaj Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi. Görünür bölmesi usin sabitleyin olmalıdırg bağlayıcı klipleri. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Şekil 2:. Electroformation odasının (yandan görünüm) şematik gösterimi <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="18"><li> Aspirasyon ile aşırı sukroz çıkarın ve tüy bırakmayan bir mendil kullanarak slaytları temizleyin. iletken taraf bar üniforma temas böylece bakır bara slaytlar sabitleyin. cam slayt sadece bir iletken tarafı bir bakır çubuk ile temas halinde olduğundan emin olun. </li><li> timsah klipleri kullanarak fonksiyon jeneratörü çıkışına bakır çubuğu bağlayın. Montaj istenen sıcaklığa gelmesini sağlamak için inkübatör içinde grubunu yerleştirin. </li><li> 10 Hz, sinüs dalga frekansı ve 90 dakika için 1 V&#39;lik bir potansiyel farkı uygulanması. ensurŞekil 3 &#39;de gösterildiği gibi gerilim multimetre 1 V e. 90 dakika süreyle işleme devam edin. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Şekil 3:. Multimetre gelen elektrotlar sıklığını ve akımı ölçmek için yerleştirilir hangi pozisyonları <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="21"><li> 90 dakika sonra, yavaşça 2 Hz azaltılması ve başka bir 10 dakika daha electroformation devam edin. Bu süre boyunca, nitro için reaksiyonlarda hasat (3.1-3.2 adım). </li><li> fonksiyon jeneratörü kapatın ve montaj (inkübatör kapatarak ve biraz açılmış inkübatör kapı bırakarak) yavaş yavaş oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Soğuduktan sonra, jeneratör kabloları çıkarınslayt meclisleri. GUVs çok kırılgan olması ve bu nedenle de çok yavaşça ele alınması gerekir. Dikkatle tezgah derleme getirmek. </li><li> yavaşça forseps kullanarak üst slayt kaldırarak odasına sökün. temiz bir tüpe bir kesim 1,000 ul ucu ve transfer kullanarak sükroz süspansiyon içeren GUVs hasat. GUVs aksamaması için tüp hafifçe tutun. </li><li> Hemen GUVs kullanın. Oda sıcaklığında depolandığında GUVs hasattan sonra en az 90 dakika boyunca stabildir. </li></ol> 3. Hasat İn Vitro Çeviri Reaksiyonları <ol><li> Bir tüp içine mikropipet kullanarak kırmızı odasından istenilen proteinleri içeren in vitro çeviri reaksiyonlar hasat. </li><li> , Toplu proteinler kaldırmak bir masaüstü santrifüj üzerinde 15 dakika süreyle 16,200 xg&#39;de lizatları dönmeye ve dikkatli bir tüp içine süpernatant aktarmak için. </li></ol> 4. GUV Bağlanma Tahlili <ol><li> bir kesim ucu kullanarak, 5 mix1 &#39;dir; çevrilmiş proteinlerin bir tüp içinde GUVs 5 ul ihtiva eden in vitro çeviri reaksiyonlar, L ve 2-3 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Temiz bir kapak kayma küçük bir delik (3-4 mm çapında) bir PDMS levha takın ve hafifçe ve sıkıca lamel karşı basarak sıkı sızdırmazlık sağlamak. </li><li> küçük deliğe adım 4.1 10 ul karışımı yerleştirin. </li><li> Resim oda sıcaklığında ters epi veya konfokal floresan mikroskobu altında karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Not: buharlaşmasını önlemek için, görüntüleme odası, bir lamel ile kaplı olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+RNA-mediated+inhibition+of+phosphatidylserine-dependent+HIV-1+Gag+membrane+binding+in+cells.">Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells.</a> J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).</li><li>Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+mechanisms+involving+RNA+and+lipids+regulate+HIV-1+Gag+membrane+binding+through+the+highly+basic+region+of+the+matrix+domain.">Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).</li><li>Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+matrix+domain+and+phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate+is+essential+for+efficient+gag+membrane+binding.">Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding.</a> J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).</li><li>Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+membrane-binding+domain+within+the+amino-terminal+region+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Gag+protein+which+interacts+with+acidic+phospholipids.">Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids.</a> J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).</li><li>Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+(4,5)+bisphosphate+regulates+HIV-1+Gag+targeting+to+the+plasma+membrane.">Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).</li><li>Saad, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+targeting+HIV-1+Gag+proteins+to+the+plasma+membrane+for+virus+assembly.">Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).</li><li>Shkriabai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+HIV-1+Gag+with+assembly+cofactors.">Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors.</a> Biochemistry. 45 (13), 4077-4083 (2006).</li><li>Vlach, J., Saad, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trio+engagement+via+plasma+membrane+phospholipids+and+the+myristoyl+moiety+governs+HIV-1+matrix+binding+to+bilayers.">Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).</li><li>Anraku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+analysis+of+the+interaction+between+HIV-1+Gag+and+phosphoinositide+derivatives+based+on+surface+plasmon+resonance.">Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance.</a> Biochemistry. 49 (25), 5109-5116 (2010).</li><li>Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag+associates+with+specific+uropod-directed+microdomains+in+a+manner+dependent+on+its+MA+highly+basic+region.">HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region.</a> J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).</li><li>Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gag+localization+and+virus-like+particle+release+mediated+by+the+matrix+domain+of+human+T-lymphotropic+virus+type+1+Gag+are+less+dependent+on+phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate+than+those+mediated+by+the+matrix+domain+of+HIV-1+Gag.">Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag.</a> J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).</li><li>Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+binding+and+subcellular+localization+of+retroviral+Gag+proteins+are+differentially+regulated+by+MA+interactions+with+phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate+and+RNA.">Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA.</a> MBio. 5 (6), e02202 (2014).</li><li>Valentine, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+micelle+encapsulation+of+membrane-anchored+proteins+for+solution+NMR+studies.">Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies.</a> Structure. 18 (1), 9-16 (2010).</li><li>Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag+protein+can+sense+the+cholesterol+and+acyl+chain+environment+in+model+membranes.">HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).</li><li>Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+multimerization+on+membrane+association+of+Rous+sarcoma+virus+and+HIV-1+MA+proteins.">Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins.</a> J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).</li><li>Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+matrix+binding+to+membranes+and+nucleic+acids.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids.</a> J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).</li><li>Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles+formed+by+gentle+hydration+and+electroformation:+a+comparison+by+fluorescence+microscopy.">Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).</li><li>Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermomechanical+and+transition+properties+of+dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol+bilayers.">Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers.</a> Biochemistry. 27 (13), 4668-4673 (1988).</li><li>Darszon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassembly+of+protein-lipid+complexes+into+large+bilayer+vesicles:+perspectives+for+membrane+reconstitution.">Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).</li><li>Angelova, M. I., Sol&#233;au, S., M&#233;l&#233;ard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+giant+vesicles+by+external+AC+electric+fields.">Preparation of giant vesicles by external AC electric fields.</a> Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).</li><li>Yamauchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consensus+motif+for+N-myristoylation+of+plant+proteins+in+a+wheat+germ+cell-free+translation+system.">The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system.</a> FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).</li><li>Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate+Acyl+Chains+Differentiate+Membrane+Binding+of+HIV-1+Gag+from+That+of+the+Phospholipase+Cdelta1+Pleckstrin+Homology+Domain.">Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).</li><li>Morales-Penningston, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUV+preparation+and+imaging:+minimizing+artifacts.">GUV preparation and imaging: minimizing artifacts.</a> Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).</li><li>Veatch, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electro-formation+and+fluorescence+microscopy+of+giant+vesicles+with+coexisting+liquid+phases.">Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases.</a> Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).</li><li>Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+peroxides+promote+large+rafts:+effects+of+excitation+of+probes+in+fluorescence+microscopy+and+electrochemical+reactions+during+vesicle+formation.">Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation.</a> Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).</li><li>Montes, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions.">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li><li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding.">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li><li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes.">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li><li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters.">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li><li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding.">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li><li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules.">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529 (2015).</li></ol>

We declare that we have no conflicting interests.

Yukarıda açıklandığı gibi GUV bağlama deneyi diğer protein-lipid etkileşim deneyleri kendi sınırlamaları vardır senaryolarda iyi bir alternatif sunuyor. Bu tahlil bize çift katlı lipid bağlamında yerli uzunlukta açil zincirleri ile miristoillenmiş tam uzunlukta Gag ve asidik lipidler arasındaki etkileşimi incelemek ve Gag-lipit yüksek yoğunluklu sakaroz geçişlerini veya diğer post-bağlayıcı işleme yoluyla uzun yüzdürme santrifüj olmadan bunu sağlar kompleksleri. Bir başka avantaj Gag d...

İnsan bağışıklık yetersizliği virüsü tip 1 (HIV-1), çoğu hücre tiplerinde de toplanır ve plazma membranı (PM) ile ilgili tomurcukları zarflı bir virüstür. HİV-1 virüs parçacıklarının montajı Pr55 GAG (GAG) olarak adlandırılan 55 kDa viral çekirdek proteini ile tahrik edilir. Gag dört ana yapısal alana, yani, matris kapsid nükleokapsid ve P6, ve iki aralayıcı peptit SP1 ve SP2 arasında oluşan bir ön-madde poliprotein olarak sentezlenir. Montaj sırasında, matris (MA) etki montaj sitesine Gag hedeflenmesi sorumludur, kapsid (CA) etki Gag-Gag etkileşimlerini aracılık, nükleokapsid (NC) etki viral genomik RNA acemi ve p6 acemi ev sahibi faktörler yardım plazma membran virüs partikül kesme. Gag aynı zamanda, N-terminal ucunda bir 14-karbonlu yağlı asit ya da miristat parçasının ilave edilmesi ile bir ko-translasyonel modifikasyon maruz kalır. Gag bağlayıcı Membran m beri viral montaj için temel bir gerekliliktirbağlama zarda arızalı utants virüs parçacıkları üretmek için başarısız olur. çift ​​katlı lipid ve son derece temel bir bölge olarak adlandırılan MA etki alanı içinde temel kalıntıların bir küme (hidrofobik etkileşimler aracılık N-terminal miristat yarımı: Biz ve diğerleri MA etki alanı içinde ikili sinyaller aracılık Gag bağlanmasının o zarı göstermiştir PM 1-4 asidik lipidler ile etkileşime HBr). Polyphosphoinositide 5-fosfataz IV (5ptaseIV), AM-özel bir asidik fosfolipid phosphatidylinositol- hidrolizini katalize eden bir enzim, ektopik ekspresyonu ile Gag-membran etkileşim çalışmalar (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] fosfatidilinositol-4-fosfat, hücrelerde Gag-PM localisation PI (4,5) P2 3,5 aracılık ettiğini göstermiştir. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, gag-PI (4,5) P fazla mekanik detayları kavramaya yönelik 2 etkileşimlerinin bir takım nedenlerden için zor olduğu kanıtlanmıştır. İçinÖrnek biyokimyasal deneyler için tam boyda saflaştırılması miristoillenmiş HIV-1 Gag bağlı saflaştırma sırasında agregasyon GAG eğilimi en azından kısmen, teknik olarak zor olmuştur. Dolayısıyla, bu tür Myr-MA ya Myr-MS-CA, ya da olmayan miristoillenmiş form olarak, HIV-1 Gag kesilmiş biçimleri sık sık, Gag saflaştırmayı gerektirmektedir çalışmalarda kullanılmıştır (örneğin, nükleer manyetik rezonans, bir protein ayak izi ve yüzey plazmon rezonans 6-9). Seçenek olarak ise, in vitro transkripsiyon için reaksiyonlarda bağlanmış diğer biyokimyasal çalışmalar 1,2 tam uzunluktaki miristoillenmiş HIV-1 Gag üretilmesi için kullanılmıştır. Tipik haliyle, bu sistemde, bir GAG kodlayan plazmid transkripsiyonu ve herhangi bir hücresel membranlar ve haberci RNA yoksun transkripsiyon ve çeviri için makine içeren ökaryotik hücre lizatları (örneğin, tavşan retikülosit lizatları) ile çevrilmiştir. Tepkimeden sonra, Gag içeren hücre lizatları bana karıştırılırlipidler ile Gag etkileşimlerin analizine mbranes. Gag miristoillenmiş tam uzunluktaki hazırlama kolaylığı ile birlikte, in vitro transkripsiyon için sistemi kullanan yöntemler Gag sentezi ve takip eden membran bağlanma reaksiyonları daha fizyolojik koşulları temsil edebilir bir &quot;ökaryotik sitosol benzeri &#39;ortamda meydana gelen bir avantaja sahiptir. Bu özellik MA etki bağlı RNA molekülleri Gag rekabetçi bir şekilde 1,2,10-12 asidik lipidler bağlanmasını düzenleyen olduğunu gösterdi çalışmalara katkıda bulunmuştur. Bu hücre lizatları elde Gag proteinleri toplam miktarı, yüksek değildir Ancak, radyo-etiketli amino asitler protein metabolik etiketleme bunların saptanması için gereklidir. yöntemine bağlı olarak gag-lipit etkileşimi ölçmek için, membran preparatları çeşitli kullanılmıştır. Bu yöntemlerin her biri kendi güçlü ve sınırlamaları vardır. En NMR bazlı deneyler, kısa asil lipidlerin kullanımını gerektirirsuda çözünen (örneğin, C4 ve C8-PI (4,5) P2) 6,8 olan zincirler. NMR yöntemler geliştirilmektedir hücrelerde bulunan uzun bir asil zincirine sahip lipidler GAG bağlanma test ederken, şu ana kadar 8,13 yalnızca miristoillenmiş veya nonmyristoylated MA kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, yerel uzunlukta açil zincirlerine sahiptir lipidlerden hazırlanan lipozomlar, örneğin lipozom yüzdürme veya floresan lipozom boncuk bağlama analizleri 2,3,10,14-16 biyokimyasal yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu deneylerde kullanılan lipozomlar, küçük çaplı, ve böylece de bunların membranlar, dik ve pozitif eğriliğe sahiptir. Bunun aksine, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerde partikül tertibatının erken aşamasında, Gag yaklaşık GAG ölçekte düzlemsel PM, bağlanan ve daha sonra filizlenen sırasında negatif bir eğrilik indükler. Bu nedenle, dik ve pozitif eğrilik ile lipozom membranlar Gag-lipit etkileşimleri çalışmak için ideal bir lipit bilayers olmayabilir. Lipozom flot gelinceation deneyleri, başka potansiyel ihtar deneysel sonucunu etkileyebilecek santrifüj sırasında hipertonik sakaroz degrade Gag-lipit komplekslerinin olduğu maruz kalmasıdır. Bu sınırlamaları azaltmak ve tamamlayıcı bir deneysel sistem sağlamak için, Gag dev tek lamelli vesiküller (GUVs) bağlanma için deneyler, son yıllarda geliştirilmiştir. GUVs çapları onlarca mikrometre büyüklüğünde uzanır, tek iki tabakalı vesiküllerin husule bulunmaktadır. Böylece, bu membranların eğrilik Gag ölçeğinde PM benzer. Üstelik, optik mikroskoplar altında görsel denetim sağlayan büyük boyutu, membran kolayca Gag-lipit komplekslerinin sonraki işlem olmadan tespit edilebilir karıştırma üzerine bu veziküller floresan etiketli veya etiketli Gag bağlayıcı proteinlerin. Burada, bir electroformation yöntemiyle elde GUVs kullanarak bağlama, HIV-1 Gag membran incelemek için bir protokol açıklar. Böyle nazik hidrasyon, jel destekli hidrasyon, mikrofon olarak çeşitli yöntemlerrofluidic püskürtme ve electroformation 17-22 GUVs elde edilmesi için kullanılmıştır. Burada tarif edilen protokol için, electroformation yöntemi asidik lipidler ve pahalı düzeneklerinin gerek kalmadan kullanılması da göreli kolaylıkla GUVs oluşturulmasında öncelikle kendi verimliliği kullanılır. GAG görselleştirme bir flüoresan raportör zorunlu kıldığı için, sarı floresan proteini (YFP) genetik GAG (gag-YFP) C-terminaline ilave edilmiştir. Gag-YFP proteinleri sürekli değişimi sürekli akışı (CECF) teknolojisine dayalı buğday tohumu lizatlarında in vitro transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları ile elde edilir. Bu teknolojide, tepki ve reaksiyon, substrat ve enerji bileşenlerinin besleme önleyici yan her iki kaldırma, bir diyaliz tabanlı bir mekanizma elde edilir. Bu reaksiyonlar için, bir T7 promoterinin kontrolü altında gag-YFP kodlayan bir plazmid kullanılır. Daha önce gösterildiği gibi notun, buğday tohumu lizatları ek bileşenler 2 olmadan miristoillenmesi destek3,24. Bu yöntemi kullanarak, GUV zarları 24 Gag görselleştirilmesi için gag-YFP miristoillenmiş tam boy yeterli miktarlarda elde etmek mümkün olmuştur. Burada, HIV-1 Gag PI bağlanma hangi bir protokol açıklar (4,5) P2 GUV membranları ihtiva-eden bağlanma reaksiyonları, aşağıdaki ve bu yöntem, bağlanma tahlilleri, önceden var olan gag-membran tamamlar ve olabilir teklif uzun sonradan bir işleme tabi tutulmadan incelenebilir ek bağlanma HIV-1 Gag-membran anlamak için genişletilmiş.

<table><tbody><tr><td>Digital Multimeter</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.</td></tr><tr><td>ITO coated glass slides</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hoefer</td><td></td><td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td>Gauge 22S, Syringe number 702</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td><td>Sylgard, 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td><td>BiotechRabbit,&lt;br/&gt; Berlin, Germany</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA&amp;nbsp;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&amp;nbsp;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>Brain-PI(4,5)P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

HIV-1, yapısal bir protein, Pr55 Gag (veya Gag) virüs montaj sırasında hücrelerin plazma zarına bağlanmaktadır. Gag bağlayıcı Membran viral parçacık üretimi ciddi bozulmaya Gag membran bağlama sonuçlarında bir kusur beri virüs parçacık oluşumu için önemli bir adımdır. Gag-lipid membran etkileşimlerin mekanik ayrıntıları elde etmek için, in vitro yöntemler, NMR protein ayak izi, yüzey plazmon rezonansı, lipozom flotasyon santrifüj veya floresan lipit boncuk göre, şimdiye kadar geliştirilmiş bağlanma. Bununla birlikte, bu, in vitro yöntemler, her birinin kısıtlamaları vardır. Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek ve daha önce kurulmuş yöntemleri tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz HIV-1 Gag ve lipid membranların arasındaki etkileşimleri bir &quot;hücre benzeri&quot; bir ortamda gerçekleştiği in vitro testi geliştirdi. Bu testte, Gag lipid zarlar bağlanabilen görsel YFP tagge kullanılarak analiz edilird Gag buğday sentezlenen vitro çeviri sistemi ve bir electroformation tekniği ile hazırlanan GUVs içinde germ-merkezli. Burada arka plan açıklamak ve protokoller tahlil için gerekli miristoillenmiş tam uzunlukta Gag proteinleri ve GUV membranlar elde etmek ve mikroskopi ile bağlayıcı Gag-Şef algılamak için.

<html> Yukarıdaki protokolü kullanarak, POPC + POPS + Chol oluşan GUVs hazırlanan (: 4.66: 2.33: mol oranında 3). Bu bileşim, yaklaşık PM PS ve kolesterol konsantrasyonları yansıtacak şekilde seçildi. Beyin-PI (4,5) P2 POPC + POPS + Kol karışımın içine dahil edildiğinde Sağlam ve Gag bağlayıcı verimli yalnızca gözlendi (POPC + POPS + Chol + beyin-PI (4,5) P2 [molar oran 4: 2: 3: 1] örnekte) (Şekil 4, A ve C) panel B ve D kar...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes at JoVE.com

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K Görüntüleme.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

Video: Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Biyoloji

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma membrane and the numerous factors that influence protein behavior in live cells. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are a biomimetic and highly tunable in vitro model system for investigating protein-membrane interactions and probing protein behavior in a precise, stimulus-dependent manner. In this protocol, we present an inexpensive and effective method for fabricating GUVs with the human serotonin 1A receptor (5-HT1AR) stably integrated in the membrane. We fabricate GUVs using a modified hydrogel swelling method; by depositing a lipid film on top of a mixture of agarose and 5-HT1AR and then hydrating the entire system, vesicles can be formed with properly oriented and functional 5-HT1AR incorporated into the membrane. These GUVs can then be used to examine protein-membrane interactions and localization behavior via microscopy. Ultimately, this protocol can advance our understanding of the functionality of integral membrane proteins, providing profound physiological insight.

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

This protocol utilizes agarose swelling as a powerful and generalizable technique for incorporating integral membrane proteins (IMPs) into giant unilamellar lipid vesicles (GUVs), as described here for the reconstitution of the human 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), one of the classes of pharmacologically important G protein-coupled receptors.

G-protein Bağlantılı Reseptörleri (GPCR) içeren Model Lipid Membranlarının yapımı

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Biyomühendislik

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...