Name: one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

İnsan kanı Ulusal Tsing Hua Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu, Hsinchu, Tayvan önceden yazılı aydınlatılmış onam ve onayı ile sağlıklı gönüllülerden alındı. E. Rekombinant HP NAP 1. İfade E. coli <ol><li> H. HP NAP-DNA dizisini içeren plazmid pET42a NAP-hazırlama pylori 26695 suşu olarak daha önce 16 nitelendirdi. tarif edildiği gibi arzu edilen nokta mutasyonu olan HP NAP DNA dizisini ihtiva eden plasmidler hazırlama (Protokolü, adım 8). </li><li> E. yukarıdaki DNA plazmid, 10 ng Dönüşümü E. coli BL21 (DE3) 42 ° C&#39;de 45 saniye için ısı şok kompetan hücreler, çizgi 50 ug / ml kanamisin ve 16 saat 37 ° C&#39;de plakalar inkübe ihtiva eden agar plakaları lizojeni bulamacında hücreleri (LB). </li><li> 50 ug / ml kanamisin ile LB suyu 5 ml ihtiva eden tek tek tüpler içinde tek koloniler inoküle ve 3 ön kültür olarak büyür170 rpm&#39;de çalkalanarak 16 saat, 7 ° C. </li><li> 1 L&#39;lik bir şişede 50 ug / ml kanamisin içeren LB suyu 200 ml, yukarıda ön-kültür hücreleri 2 ml ile inoküle. Yaklaşık bir UV / VIS spektrofotometre ile tespit 0.4-0.5 ulaşır 600 nm&#39;de absorbans ve 170 rpm&#39;de çalkalanarak, 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de aşılandı kültür şişesi inkübe edin. </li><li> HP NAP ekspresyonunu indüklemek için 0.4 mM nihai bir konsantrasyona kadar yukarıdaki kültüre 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) 80 ul ekle. Yaklaşık 1.6-1.7 ulaştığı 600 nm&#39;de absorbans kadar 3 saat boyunca kültür inkübe. </li><li> Santrifüj 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 6,000 x g&#39;de hücre süpernatan. saflaştırılmadan kadar -70 ° C &#39;de hücre pelletini saklayın. </li></ol> HP NAP içeren çözünür protein fraksiyonu 2. Hazırlık Not: Aşağıdaki adımların hepsi 4 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir. <ol><li> Hücre p yeniden süspanse 50 miProtokol adım 1.6 hazırlanan ellet 20 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM NaCI ihtiva eden 0.13 mM fenilmetilsülfonil florid (PMSF), 0.03 mM N-alfa-tosil-L-lizinil-klorometilketon (TLCK) ve 0.03 mi 4 ° C&#39;de mM N-tosil-L-fenilalanin-klorometilketon (TPCK) daha önce olduğu gibi 16 tarif. </li><li> 4 ° C &#39;de 7 kez 15,000 psi ile 20,000 arasında bir dizi çalışan yüksek basınçlı homojenleştirici ile bakteriyel bir süspansiyon geçirilmesiyle bakteri hücreleri bozabilir. </li><li> Santrifüj 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de 30.000 x g&#39;da hücre lisatı, bir ultra santrifüj ile çözünen ve çözünmeyen protein fraksiyonları ayırmak için. Bir behere çözünür protein fraksiyonu olarak supernatant aktarın. </li><li> üreticinin talimatlarına göre standart olarak sığır serum albümini (BSA) ile ticari bir kit kullanılarak Bradford metodu ile çözünür protein fraksiyonu Protein konsantrasyonu ölçümü. </li><li> th 20 ml 1 N HCI 177.6 ul eklepH 8.0, pH 9.0 olan pH değerini ayarlamak için Protokol adım 2.3 elde edilen E çözünür protein fraksiyonu. </li><li> Nihai protein konsantrasyonu 0.5 mg / ml olması için yukarıda protein çözeltisine, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI ekleyin. </li></ol> E. itibaren Rekombinant HP NAP 3. saflaştırılması DEAE iyon-değişim reçineleri ile Negatif Mod Toplu Kromatografisi coli <ol><li> DEAE reçine 15 ml hazırlayın. <ol><li> DEAE reçine üzerinden 0,6 gr kuru toz tartılır ve en az 1 gün süre ile oda sıcaklığında, 20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 50 mM NaCI, 30 ml içinde askıya. </li><li> 10.000 x reçine santrifüj 1 dakika boyunca 4 ° C &#39;de örn. </li><li> Süpernatantı çıkarın ve atın. </li><li> 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI, 15 mL ekleyin. </li><li> Protokol 3.1.2 dört 3.1.4 kez daha adımları tekrarlayın. </li><li> 15 mi daha sonraki kullanım için 4 ° C&#39;de reçinesi (30 ml Tris tamponu içinde% 50 bulamaç) yerleşmiş saklayın. Not: Bir sonraki adımda tüms, 4 ° C&#39;de gerçekleştirilmektedir. </li></ol></li><li> reçine 15 ml protokolün adım 2.6 hazırlanan çözünür proteinlerin 45 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de manyetik bir karıştırıcı ile, protein / reçine cıvık çamuru ilave edin. </li><li> Bir durdurma musluğu takılmış plastik ya da cam sütuna protein / reçine cıvık çamuru dökün. Reçine yerçekimi altında yerleşmek için izin verin. </li><li> sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar protein çözeltisi yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla saflaştırılmış HP NAP içeren ilişkisiz fraksiyon olarak toplayın. </li><li> sütuna buz soğukluğunda 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCI, 15 mL ekleyin. </li><li> sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar yıkama tamponu yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla yıkama fraksiyonu olarak toplayın. </li><li> Protokol ek yıkama kesirler toplamak için 3,5 dört 3,6 kez daha adımları tekrarlayın. </li><li> bir kolona buzla soğutulmuş 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCI, 15 mL ekleyin. </li><li> sütununda sıvı seviyesi sadece reçine üzerine kadar elüsyon tamponu yerçekimi akışı ile sütun aracılığıyla çalışmasına izin vermek için musluğunu açın. akış yoluyla elüsyon fraksiyonu olarak toplayın. </li><li> Protokol ek elüsyon kesirler toplamak için 3,8 dört 3,9 kez daha adımları tekrarlayın. </li></ol> 4. Tampon Değişim ve DEAE Reçinelerle Negatif Mod Toplu Kromatografi ile saflaştırılmaktadır HP-NAP Endotoksin Kaldırma Not: Saflaştırılmış HP NAP-E&#39;de ifade E. coli değişimi ve nötrofilleri stimüle önce endotoksin kaldırma tampon maruz bırakılması gerekmektedir. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 24 14 kDa molekül ağırlığı kesme diyaliz tüpleri kullanılarak, 4 ° C de, Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS), pB 7.2, saflaştırılmış HP UEP tampon değiştirme diyaliz gerçekleştirin. </li><li> Bir Syring yoluyla diyaliz HP-NAP Filtreendotoksini çıkarmak için 4 ° C sıcaklıkta 2.5 ila 4 ml / dakika arasında değişen akış hızında, 20 ml&#39;lik atılabilir bir şırınga bağlı pozitif yüklü, hidrofilik membrandan e filtresi. </li></ol> Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), Western blotting, yerel-PAGE, jel filtrasyon kromatografisi ve Dairesel Dikroizm Spektroskopisi ile arıtılmış rekombinan HP UEP moleküler özellikler 5. karakterizasyonu <ol><li> Fare monoklonal antikoru Mab 16F4 25 ihtiva eden hibridom kültür süpernatanları ile SDS-PAGE ve Western blotting ile saflaştırılmış rekombinant HP NAP analiz, daha önce 24 tarif. </li><li> Daha önce 26 tarif edildiği gibi oligomerik durumunu incelemek için ana-PAGE ve jel filtrasyon kromatografisi ile arıtılmış, HP-NAP analiz edin. </li><li> Daha önce 26 açıklandığı gibi ikincil yapısını incelemek için dairesel dikroizm spektroskopi ile saflaştırılmış rekombinant HP-NAP analiz edin. </li></ol> Bir SDS-PAGE jeli gümüş rengine boyanması HP-UEP Saflık 6. Değerlendirme <ol><li> Bir gümüş boyama kiti üreticinin talimatlarına göre çözüm, gümüş çözüm, çözüm geliştirme hassaslaştırıcı, sabitleme çözeltisi hazırlayın çözüm durdurmak ve yıkama solüsyonu. </li><li> Bir gümüş boyama kiti üreticinin talimatlarına göre bir SDS-PAGE jel gümüş lekeleme gerçekleştirin. </li><li> Bir görüntüleme sistemiyle jel görüntü elde. </li></ol> HP-NAP Bağlı Nötrofiller itibaren ROS üretimi 7. ölçümü <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 24 yoğunluk gradyan santrifüjü takiben dekstran çökeltmesi ile insan heparinize kandan İnsan nötrofilleri izole edin. </li><li> nötrofillerden ROS üretiminin ölçümü luminol bağımlı kemikuminensans kullanarak HP-NAP ile uyarılır. <ol><li> Bir plaka okuyucusu üzerinde açma ve 37 ° C&#39;de sıcaklık ayarlanır. bir yerleştirinBu, 37 ° C ye ısınmasına izin plaka okuyucu bölmesi içi boş, düz tabanlı 96 oyuklu beyaz levha,. </li><li> Varlığında veya yokluğunda 0,9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, ve 13.3 uM 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) ihtiva eden, D-PBS, pH 7.2 içinde teşvik karışımlarını hazırlamak Protokol adım 4.2 hazırlanan 0.67 uM endotoksin kaldırıldı HP-NAP. </li><li> 5 mM glukoz ihtiva eden D-PBS, pH 7.2 içinde 7.1 6 10 ila 2 x hücre / mi, Protokol aşamasından hazırlanan insan nötrofil konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> 96 oyuklu ise plakanın her oyuğuna nötrofil süspansiyon 50 ul ekle. </li><li> oyuk başına 5 saniyelik bir zaman aralığı de ihtiva eden nötrofiller Protokol aşama 7.2.2 hazırlanabilir teşvik karışımlarından 150 ul ekle. </li><li> Bir plaka okuyucusu kullanılarak, üç saatlik bir süre boyunca göz başına 5 saniye için kemilüminesans emisyonunu ölçün. </li></ol></li></ol> 8.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile DNA Plazmidler Barınma HP-NAP Mutantlarının Şantiye doğrudan Mutagenezler tabanlı Not: &quot;sessiz&quot; restriksiyon bölgeleri bölge-yönlendirmeli mütajenez (SDM) -assist yazılımı 28 ile bir mutagenez primeri tanıtıldı hariç, daha önce tarif edildiği gibi 27, PCR tabanlı bir site doğrudan mutajenez temel oluşturulmuştur. <ol><li> PCR reaksiyonu gerçekleştirmek. <ol><li> Nihai verir plazmid pET42a NAP-10 ng, Tablo 1 &#39;de listelenen mutagenez primer çiftleri 1 uM, deoksinükleosid trifosfat (dNTP) ve iyonu giderilmiş su ihtiva eden bir PCR tüpüne yüksek güvenilirlikli PCR enzim karışımı 3 adet 200 uM ekleme 25 ul hacmi. </li><li> 95 PCR döngüleri başlatın 10 dakika boyunca ° C şablon DNA&#39;yı denatüre ve 1 dakika süre ile 95 ° C de 12 amplifikasyon döngüsü ile takip etmek, T 1 dakika süre ile -5 ° C Resim m, 6 dakika boyunca 72 o C. </li><li> PCR döngüleri bitirmek1 dakika için Tm s -5 O ° C&#39;de bir tavlama aşaması, ve 30 dakika süreyle 72 ° C&#39;de bir uzatma aşamasından oluşuyordu. </li></ol></li><li> 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de Dpn I sınırlama enzimi 0.4 ul PCR ürünü 15 ul tedavi ve daha sonra agaroz jel elektroforezi ile Dpn I ile tedavi edilen PCR ürünü 2 ul analiz eder. </li><li> Ekran mutantları. <ol><li> E. içine PCR ürünü 2 ul Transform 42 ° C&#39;de 45 saniye boyunca ısı şoku ile coli DH5α kompetan hücreler. </li><li> 50 ug / ml kanamisin içeren bir LB plakası üzerinde dönüştürülmüş hücrelerinin yayılmasını ve 16 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> imalatçının protokolüne göre, ticari bir alkalin liziz kiti kullanılarak bakteriyel kolonilerden plazmid DNA izole edin. </li><li> üreticinin protokolüne göre istenen sessiz mutasyonların varlığını doğrulamak için XhoI kısıtlama enzimi ile protokolün adım 8.3.3 izole plazmid DNA tedavi edin. </li><li> diziPlazmid DNA, üretici protokolüne göre HP NAP-mutantlarının kodlama dizilerinin düzeltme teyit etmek için T7 promoter primeri ile protokolün adım 8.3.4 tarafından doğrulanan. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Brunette, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Infectious+diseases+related+to+travel.">Chapter 3, Infectious diseases related to travel.</a> CDC Health Information for International Travel 2016. , (2015).</li><li>Bauer, B., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+gastric+pathogen+Helicobacter+pylori+its+association+with+gastric+cancer+and+ulcer+disease.">The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease.</a> Ulcers. 2011, 340157 (2011).</li><li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+Helicobacter+pylori+infection--the+Maastricht+IV/+Florence+Consensus+Report.+Gut.">Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut.</a> Gut. 61 (5), 646-664 (2012).</li><li>Evans, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).</li><li>Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein:+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+applications.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications.</a> World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).</li><li>de Bernard, M., D'Elios, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+modulating+activity+of+the+Helicobacter+pylori+HP-NAP:+Friend+or+foe?.">The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe?.</a> Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).</li><li>Malfertheiner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+an+intramuscular+Helicobacter+pylori+in+noninfected+volunteers:+a+phase+I+study.">Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study.</a> Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP-NAP+inhibits+the+growth+of+bladder+cancer+in+mice+by+activating+a+cytotoxic+Th1+response.">HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response.</a> Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).</li><li>Codolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+Th2+inflammation+in+ovalbumin-induced+allergic+asthma.">The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma.</a> Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).</li><li>Del Prete, ., G, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+of+TH2+responses+in+Trichinella+spiralis+by+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).</li><li>Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+Helicobacter+pylori+in+expression+of+antigens+and+induction+of+antibodies.">Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies.</a> World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).</li><li>Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+evaluation+of+antibodies+against+neutrophil-activating+protein+of+Helicobacter+pylori+in+patients+with+gastric+cancer.">Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer.</a> World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).</li><li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CagA-independent+cluster+of+antigens+related+to+the+risk+of+noncardia+gastric+cancer:+associations+between+Helicobacter+pylori+and+gastric+adenocarcinoma+explored+by+multiplex+serology.">A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology.</a> Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).</li><li>Kottakis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+activates+neutrophils+by+its+C-terminal+region+even+without+dodecamer+formation,+which+is+a+prerequisite+for+DNA+protection--novel+approaches+against+Helicobacter+pylori+inflammation.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation.</a> FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).</li><li>Thoreson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+surface-exposed+antigen+expression+between+Helicobacter+pylori+isolated+from+duodenal+ulcer+patients+and+from+asymptomatic+subjects.">Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects.</a> J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).</li><li>Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+promotes+myeloperoxidase+release+from+human+neutrophils.">Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).</li><li>Iyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+surface+area+chromatography+for+flow-through+purification+of+viruses+and+virus+like+particles.">Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).</li><li>Wongchuphan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+rabbit+polyclonal+immunoglobulin+G+using+anion+exchangers.">Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers.</a> Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).</li><li>Lu, X., Zhao, D., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hemoglobin+by+ion+exchange+chromatography+in+flow-through+mode+with+PEG+as+an+escort.">Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort.</a> Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).</li><li>Brooks, S. P., Storey, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+protein+phosphatase+that+dephosphorylates+pyruvate+kinase+in+an+anoxia+tolerant+animal.">Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).</li><li>Gewirtz, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+translocates+flagellin+across+intestinal+epithelia,+inducing+a+proinflammatory+response.">Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response.</a> J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).</li><li>Levison, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+ion-exchange+column+chromatography+of+proteins:+Comparison+of+different+formats.">Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).</li><li>Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+chromatography:+Progress,+applications+and+future+perspectives.">Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives.</a> Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).</li><li>Yang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+purification+of+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein+overexpressed+in+Escherichia+coli.">High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli.</a> BMC biotechnol. 15 (23), (2015).</li><li>Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+attenuated+measles+virus+engineered+to+express+Helicobacter+pylori+neutrophil-activating+protein.">Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein.</a> Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).</li><li>Shih, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+chromatographic+purification+of+Helicobacter+pylori+protein+expressed+in+Bacillus+subtilis.">One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis.</a> PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+'silent'+restriction+sites.">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li></ol>

HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

Burada sunulan DEAE anyon-değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi E coli içinde aşırı eksprese rekombinant HP NAP saflaştırılması için uygundur. Hücre lizizi ve saflaştırma aşamasında kullanılan tamponların pH değerleri E. HP-NAP çözünürlüğünü sağlamak için çok önemlidir E. coli lizatları ve sırasıyla konak hücre yabancı maddelerden rekombinant HP NAP verimli ayrılması. Bakteri hücreleri, pH 9.0 lize olmalıdır ve negatif saflaştırma y...

Helikobakter pilori (H. pilori) gastrit ve peptik ülser bir ana sebebidir. Bu bakteri, aynı zamanda Kanser, Dünya Sağlık Örgütü adına Araştırmaları Uluslararası Ajansı tarafından insanlarda karsinojen olarak sınıflandırılmıştır, 1994 yılında tahmin edildiğini H. prevalansı pylori enfeksiyonu gelişmekte olan ülkelerde% 70 ve sanayileşmiş ülkelerde 1 30-40% &#39;dir. Olsa H. enfeksiyon oranı pylori, sanayileşmiş ülkelerde H. enfeksiyon oranını azaltmak olduğunu Gelişmekte olan ülkelerde pylori halen 2 yüksektir. Standart tedavi H. ortadan kaldırmak için pylori enfeksiyonu, bir proton pompası inhibitörü, PPI ve iki antibiyotik, klaritromisin artı amoksisilin veya metronidazol 3 uygulanmasından oluşur. H. antibiyotik direnci Ancak, yükselişi pylori ülser tedavisi o önlemek için yeni stratejilerin geliştirilmesini çağrısı lır enfeksiyonu tedavi. H. karşı önleyici ve / veya terapötik bir aşı geliştirilmesi H. pylori kontrol etmek için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir pylori enfeksiyonunun. Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP), H. pylori önemli bir virülans faktörü, birinci bir H. su ekstreleri tespit edilmiştir endotel hücrelerine ve reaktif oksijen türlerini (ROS) 4 üretmek için uygun nötrofillerin aktive etme kabiliyetine sahip pylori. H. bulunan mide mukozasının nötrofil infiltrasyonu pylori- aktif gastrit ile enfekte olan hastalarda mide enflamasyon ve doku hasarına yol açabilir. Bu nedenle, HP-NAP fazla ülser veya H. neden gastrik enflamasyon, indükleme nötrofillerin aktive ederek patolojik bir rol oynayabilir pylori mide hastalıkları -associated. Bununla birlikte, HP-NAP klinik uygulamalara 5,6 için potansiyel bir adaydır. Nedeniyle bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici proHP UEP perties, bu proteinin aşılar, terapötik ajanlar ve diyagnostik araçlar geliştirmek için kullanılabilir. Bir klinik çalışma H. karşı bir protein aşı bileşenleri olarak yeniden birleştirici HP NAP kullanılarak gerçekleştirilmiştir pylori. Bu aşının, alüminyum hidroksit ile birlikte formüle rekombinant HP NAP, sitotoksin ilişkili gen A (CagA) ve vakuolasyon sitotoksin A (VacA) proteinlerden oluşur ve daha fazla güvenli ve insanlarda 7 imünojenik olduğu gösterilmiştir. Ayrıca HP NAP-kanser terapisi 8 immün yanıtları -polarized aşağı alerjik reaksiyonlar ve parazit enfeksiyonları 9,10 ile ortaya çıkarılan Th2 immün yanıtları düzenleyen (Th1) T yardımcı tip 1 tetiklemek için güçlü bir bağışıklık düzenleyici olarak işlev görür. Diagnostik olarak, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için uygulanmıştır pylori hasta 11 ile enfekte. Bir çalışma göstermiştir ki H. serumunda HP NAP-özgü antikorların seviyesi pylori mide kanserli hastaların kronik gastrit 12 olan hastalardan alınan göre anlamlı derecede yüksek olduğu ile enfekte. Bir başka çalışma, HP-NAP karşı serum antikorları olmayan kardiya gastrik adenokarsinoma 13 varlığı ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, yeniden birleştirici HP NAP-tabanlı ELISA H. mide kanseri prognoz için HP-NAP karşı serum antikorları tespit etmek için tatbik edilebilir pylori hastaları ile enfekte. Birlikte ele alındığında, arıtılmış, HP-NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated. Rekombinant HP NAP saflaştırılması için kullanılan çeşitli yöntemler arasında doğal biçiminde Escherichia coli (E. Coli) &#39;de ifade edilen ikinci bir saflaştırma aşaması ile ilgili jel filtrasyon kromatografisi yüksek ölçüde saf, HP-NAP 14-16 elde etmek için gerekli olan şu ana kadar rapor . Burada, negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bir yöntemdietilaminoetil (DEAE) iyon-değiştirme reçineleri E. aşırı eksprese HP NAP saflaştırılması için açıklanan yüksek verim ve yüksek saflıkta coli. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanıyordu. pH 8.0, HP-NAP dışında neredeyse başka hiçbir proteinler bağlanmamış fraksiyonu geri kazanılır. negatif modda DEAE iyon değişimi kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yaklaşımı basit ve zaman bağlı olmayan fraksiyon toplama yoluyla tek adımlı kromatografisi ile yeniden birleştirici HP NAP saflaştırılmasını sağlayarak kazandıran. 17, immünoglobülin G (IgG) 18 hemoglobin 19, protein fosfataz 20 ve hastalık oluşturma faktörü flagellin 21 virüsleri gibi, aynı zamanda negatif iyon değişim kromatografisi ile saflaştırılabilir bildirilmiştir HP-NAP, birçok biyomoleküllerin ek olarak, modu. yabancı maddeler küçük ise negatif mod iyon değişimli kromatografi için tercih edilirtabi numunede mevcut olan bileşenlerin 22 arıtılacak. Doğal ya da yeniden birleştirici biyomoleküllerin saflaştırma negatif kromatografi uygulanması en son 23 gözden geçirilmiştir. Bu rapor E. rekombinant HP NAP ifadesi için adım protokolü tarafından bir adım sağlar E. coli, DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak HP-UEP hücrelerin parçalanması ve saflaştırılması. arıtma için arzu edilen bir protein negatif modda iyon değiştirme kromatografisi için uygun ise, açıklanan protokol, aynı zamanda bir saflaştırma işleminin geliştirilmesi için bir başlangıç ​​noktası olarak adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 (DE3)</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>MD Biomedical Inc</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&amp;amp;supplier=search&amp;amp;name&lt;br/&gt;=IPTG%20</td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td>protease inhibitor&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Protein standard (bovine serum albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&amp;nbsp;</td><td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&amp;ndash;Sephadex &amp;nbsp;A-25 chloride form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Spectrum/Por dialysis tubing</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td><td>with molecular weight cutoff of 14 kDa&lt;br/&gt; http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Acrodisc&amp;reg; units with Mustang&amp;reg; E membrane</td><td>Pall</td><td>MSTG25E3</td><td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min&lt;br/&gt; http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&amp;nbsp; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA&lt;br/&gt; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28989335</td><td>for gel filtration chromatography&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>PlusOne silver staining kit, protein</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1440-02</td><td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure&lt;br/&gt;_16963/17144002</td></tr><tr><td>Flat bottom 96-well white plate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>protected from light&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Expand &amp;nbsp;long template PCR system</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>source of High Fidelity PCR enzyme mix&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Product Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td><td>Hitachi&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>out of market and upgraded to a new model&lt;br/&gt; http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td><td>Avestin Inc</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td><td>Hitachi Koki Co</td><td>90106401</td><td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; lysates&lt;br/&gt; http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1900-26</td><td>for gel filtration chromatography&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>LAS-3000 imaging system</td><td>Fujifilm</td><td>N/A</td><td>discontinued and replaced&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>1420-018</td><td>for chemiluminescence detection&lt;br/&gt; http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

Helikobakter pilori nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) Helicobacter pylori (H. pylori) önemli bir virülans faktörü olduğu. Bu H. kritik bir rol oynar pylori nötrofiller, monositler ve mast hücreleri dahil olmak üzere birçok doğuştan lökositlerin aktive ederek mide iltihabı indüklenen. HP-NAP bağışıklık ve bağışıklık düzenleyici özellikleri onu H. için potansiyel bir tanı ve aşı adayı yapmak pylori ve kanser tedavisi için yeni bir ilaç adayı. klinik uygulamalarda kullanılan arıtılmış, HP-NAP önemli miktarlarda elde etmek için, etkili bir yöntem, yüksek verim ve saflıkta bu proteinin oluşturulmasına ihtiyaç saflaştırmak için. Bu protokol, dietilaminoetil (DEAE), iyon değiştirme reçineleri kullanılarak, Escherichia coli (E. Coli) &#39;de rekombinant aşırı eksprese HP UEP tek adımlı negatif kromatografik arıtma için bir yöntem tanımlanmıştır (örn., Sephadex i)n toplu modunda. Rekombinant HP-NAP E. toplam proteinin yaklaşık% 70 oluşturmaktadır E. coli ve hemen hemen tam olarak pH 9.0 hücre lizizi sonrasında çözünebilir fraksiyondan elde edilir. PH 8.0&#39;da iyi şartlar altında, HP-NAP çoğunluğu bağlanmamış fraksiyon geri kazanılır ise E. endojen proteinler E. coli etkin reçinesi ile giderilirler. DEAE iyon değişim reçineleri ile negatif mod toplu kromatografisi kullanılarak bu saflaştırma yöntemi E fonksiyonel HP NAP verir yüksek verim ve saflıkta doğal biçiminde coli. Saflaştınldı HP NAP daha önleme, tedavi için kullanılan ve H. prognozu edilebilir pylori hastalıkları yanı sıra kanser tedavisi -associated.

Rekombinant HP-NAP negatif arınma deneysel işlemin şematik E. ifade Toplu modunda DEAE iyon değişim reçineleri kullanılarak E. coli, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bu saflaştırma tekniği konakçı hücre proteinleri ve / veya reçine HP-NAP dışındaki yabancı maddeler bağlanmasının dayanmaktadır. PH 8.0 &#39;de, kendi doğal formunda HP NAP dışında hemen hemen hiçbir proteinler, bağlanmamış fraksiyon (Şekil ...

Watch this Scientific Journal Video about One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode at JoVE.co

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Rekombinant Helicobacter tek-aşamalı negatif saflaştırılması için yüksek verimli bir yöntem tarif edilmektedir küme modunda dietilaminoetil reçineleri kullanılarak Escherichia coli içinde aşırı eksprese nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) pylori. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP H. aşı, ilaç veya teşhis maddelerinin geliştirilmesi için faydalıdır pylori hastalıkları -associated.

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Nötrofil-aktive protein aşın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Toplu Modunda

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

9.6K Görüntüleme.  National Tsing Hua University.  Rekombinant Helicobacter tek-aşamalı negatif saflaştırılması için yüksek verimli bir yöntem tarif edilmektedir küme modunda dietilaminoetil reçineleri kullanılarak Escherichia coli içinde aşırı eksprese nötrofil aktive edici protein (HP-NAP) pylori. Bu yöntem ile arıtılmış, HP-NAP H. aşı, ilaç veya teşhis maddelerinin geliştirilmesi için faydalıdır pylori hastalıkları -associated. 

Video: One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Biyokimya

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is also a key component in the development of new therapeutics. The evolving era of functional proteomics is fueling the demand for high-throughput protein purification and improved techniques to facilitate this. It was hypothesized that a multi column plate adaptor (MCPA) can interface multiple chromatography columns of different resins with multi-well plates for parallel purification. This method offers an economical and versatile method of protein purification that can be used under gravity or vacuum, rivaling the speed of an automated system. The MCPA can be used to recover milligram yields of protein by an affordable and time efficient method for subsequent characterization and analysis. The MCPA has been used for high-throughput affinity purification of SH3 domains. Ion exchange has also been demonstrated via the MCPA to purify protein post Ni-NTA affinity chromatography, indicating how this system can be adapted to other purification types. Due to its setup with multiple columns, individual customization of parameters can be made in the same purification, unachievable by the current plate-based methods.

A multi-column plate adapter allows chromatography columns to be interfaced with multi-well collection plates for parallel affinity or ion exchange purification providing an economical high throughput protein purification method. It can be used under gravity or vacuum yielding milligram quantities of protein via affordable instrumentation.

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Biyoloji

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many bacteria. There are a variety of methods for quantifying polyP in biological materials, many of which are either labor-intensive or insensitive, limiting their usefulness. We present here a streamlined method for polyP quantification in bacteria, using a silica membrane column extraction optimized for rapid processing of multiple samples, digestion of polyP with the polyP-specific exopolyphosphatase ScPPX, and detection of the resulting free phosphate with a sensitive ascorbic acid-based colorimetric assay. This procedure is straightforward, inexpensive, and allows reliable polyP quantification in diverse bacterial species. We present representative polyP quantification from the Gram-negative bacterium (Escherichia coli), the Gram-positive lactic acid bacterium (Lactobacillus reuteri), and the mycobacterial species (Mycobacterium smegmatis). We also include a simple protocol for nickel affinity purification of mg quantities of ScPPX, which is not currently commercially available.

We describe a simple method for rapid quantification of inorganic polyphosphate in diverse bacteria, including Gram-negative, Gram-positive, and mycobacterial species.

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Helicobacter pylori enfeksiyonunun qPCR tabanlı hızlı, noninvaziv tanısı ve antibiyotik direnci

Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-Based Rapid Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Antibiotic Resistance

Helicobacter pylori is a major human pathogen that&#160;infects approximately half of the global population and is becoming a serious health threat due to its increasing antibiotic resistance. It is the causative agent of chronic active gastritis, peptic ulcer disease, and gastric cancer and has been classified as a Group I Carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. Therefore, the rapid and accurate diagnosis of H. pylori and the determination of its antibiotic resistance are important for the efficient eradication of this bacterial pathogen. Currently, H. pylori diagnosis methods mainly include the urea breath test (UBT), the antigen test, the serum antibody test, gastroscopy, the rapid urease test (RUT), and bacterial culture. Among them, the first three detection methods are noninvasive, meaning they are easy tests to conduct. However, bacteria cannot be retrieved through these techniques; thus, drug resistance testing cannot be performed. The last three are invasive examinations, but they are costly, require high skills, and have the potential to cause damage to patients. Therefore, a noninvasive, rapid, and simultaneous method for H. pylori detection and drug resistance testing is very important for efficiently eradicating H. pylori in clinical practice. This protocol aims to present a specific procedure involving the string test in combination with quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for the rapid detection of H. pylori infection and antibiotic resistance. Unlike bacterial cultures, this method allows for easy, rapid, noninvasive diagnosis of H. pylori infection status and drug resistance. Specifically, we used qPCR to detect rea for H. pylori infection and mutations in the 23S rRNA and gyrA genes, which encode resistance against clarithromycin and levofloxacin, respectively. Compared to routinely used culturing techniques, this protocol provides a noninvasive, low-cost, and time-saving technique to detect H. pylori infection and determine its antibiotic resistance using qPCR.

Yazar Spotlight: Helicobacter pylori Enfeksiyonunun Tespiti ve Tedavisi 

The protocol presents a noninvasive method for the rapid diagnosis of Helicobacter pylori stomach infections through the string test and determines its antibiotic resistance to clarithromycin and levofloxacin using quantitative polymerase chain reaction (qPCR).

Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) Bazlı Helicobacter pylori Enfeksiyonu ve Antibiyotik Direncinin Hızlı Tanısı

Helicobacter pylori is a major human pathogen that&#160;infects approximately half of the global population and is becoming a serious health threat due to ...

Tek adımlı olumsuz Kromatografik arıtma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) Bazlı Helicobacter pylori Enfeksiyonu ve Antibiyotik Direncinin Hızlı Tanısı

Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) Bazlı Helicobacter pylori Enfeksiyonu ve Antibiyotik Direncinin Hızlı Tanısı

Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) Bazlı Helicobacter pylori Enfeksiyonu ve Antibiyotik Direncinin Hızlı Tanısı