This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.

Bu çalışma Sağlık İsrail&#39;in Bakanlığı Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen tavsiyelere sıkı göre yapıldı. tüm hayvanların onaylı kurumsal hayvan bakım protokolü Teknoloji Technion İsrail Enstitüsü, IL-02302-2015 göre ele alınmıştır. 1. Deneysel hazırlanması <ol><li> şelatlı Fetal Sığır Serumu hazırlanması Not: kalsiyum, bu hücrelerin maruziyetini kontrol etmek çok önemlidir, böylece epitel hücreleri kalsiyum karşı çok hassastır. Hücreler izolasyon işlemi şelasyon sırasında kalsiyum maruz kalmamasını sağlamak için Fetal Sığır Serumu lekeleme tampon maddesi 29 hazırlanması için kullanılan herhangi bir artık kalsiyumun giderilmesi için kullanılır. Aşağıdaki protokol hazırlanması FACS tampon boyama için gerekli olan kalsiyum içermeyen Fetal Sığır Serumu, yaklaşık 1 L hazırlar. <ol><li> Kuru kenetleme malzemesi, örneğin 400 g ekle., Chelex, H2O 4 L&#39;lik bir beher içine ve damıtılmış Ekle toplam hacme 4 L kapak ve sürekli olarak bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın. </li><li> karıştırılırken, 10 N HCI çözeltisi kullanılarak pH 7.4 ayarlayın. 20 dakika boyunca karıştırmaya devam edin ve pH fazla 20 dakika süreyle kararlı kalana kadar gerektiğinde pH yeniden ayarlayın. </li><li> kenetleme malzemesi kompakt pelet oluşturmak için izin vermek için 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca beher kuluçkaya yatmaktadır. Dikkatlice aspire H2O ve ilave 2 O 4 L&#39;lik bir toplam hacme taze damıtılmış H </li><li> Adım 1.1.2 olarak pH ayarlamasını tekrarlayın. </li><li> kenetleme maddesi kompakt pelet oluşturulması için izin vermek için 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de beher yerleştirin. Dikkatlice aspire H 2 O </li><li> Yavaş yavaş kenetleme malzemeye fetal sığır serumu, 500 mL&#39;lik iki şişe ekleyin. Hız ayar kabarcığı meydana etmemesini sağlamak 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de yavaş yavaş ilave edin. </li><li> kenetleme malzeme kompozisyonu oluşturmak için izin vermek için 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de behere koyunPelet hareket ederler. </li><li> Dikkatle 1 L cam şişeye serum transferi ve steril koşullar altında, bir şişe ağzı filtre içinden filtre. -20 ° C&#39;de şelatlı serum Mağaza veya hemen kullanın. </li></ol></li><li> Lekeleme tampon maddesi hazırlanması <ol><li> 2+ Ca 2 + ve Mg olmadan PBS içinde FBS şelatlı% 3 100 ml hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. </li></ol></li></ol> Yetişkin Epidermis saç köklerinin 2. izolasyonu <ol><li> bir indüksiyon kutusunu kullanarak% 5 izofluran kullanarak fareler anestezi. Burada açıklanan protokol HF döngüsünün telojen aşamasında olan 50-80 günlük fare kullanılarak optimize edilmiştir. </li><li> standart laboratuar prosedürlerine göre fareler Euthanize. Burada, bir ötenazi odasında CO 2 doz aşımı kullanarak fareleri euthanize. </li><li> Elektrik kesme makineleri kullanılarak sırt derisine tüm saç tıraş. baş ve bacaklarda kaçının. cilde mümkün olduğunca yakın makası tutun. deri ve deri altı tabaka zarar vermemek. </li&gt; <li> Tüm saç kaldırıldığında, herhangi bir saç kalıntılarını temizlemek için ve dorsal cilt dezenfekte% 70 etanol kullanın. </li><li> diseksiyon pad üzerinde fare yerleştirin ve kullanan forseps kuyruk yakın cilt yukarı çekin ve makas kullanarak küçük bir nick yapmak. dikkatle cildi kesip atmak ve fasya ayrılarak posterior-anterior yönde tüm dorsal cilt kesin. derialtı tabakası zarar görmesini önlemek. </li><li> Saç yüzü aşağı bakacak şekilde bir diseksiyon mat cilt yerleştirin ve yerine sabitlemek için cildin iki komşu kenarları aşağı pin. Yavaşça dermiş net ve düzgün olana kadar künt neşter kullanılarak, yağ kazıyın. Not: yağ kapalı kazıma zaman cilt üzerinde hafif bir basınç uygulamak için kavisli bir forseps kullanın. forseps kavisli tarafı kullanarak cilt üzerinde basınç uygulayın. Bu yırtılma cildin önleyecektir. </li><li> , Dermis 100 mm steril kültür çanak aşağı yan cildi yerleştirin ve hiçbir kıvrımları olmadığından emin olmak için cilt düzelir. Ca olmadan PBS 10 ml ekleyin 2+ </kültür çanak ve gerekirse cilt düzeltmek - sup&gt; ve Mg 2+ (PBS). </li><li> PBS aspire ve% 0.25 tripsin 10 ml. cilt katlanmamış ve serbestçe yüzen olduğundan emin olun. % 0.25 tripsin, 10 ml başına cilt tek parça inkübe edin. </li><li> 30-120 dakika için ya da gece boyunca 4 ° C &#39;de 37 ° C&#39; de inkübe edin. </li></ol> Saç köklerinin gelen Tek Hücre Süspansiyon 3. hazırlanması <ol><li> posterior yönde bir anterior kavisli bir forseps ve bir neşter kullanılarak cilt kapalı tüm saç, kazıyın. forseps kavisli tarafı kullanılarak yerinde cilt tutun ve saç kazımak için neşter kullanabilirsiniz. Not: Adım 2.8 eklenen tripsin çözeltisi içine saç kazıyın. kuyruk başlayın ve saç büyüme yönünü takip edin. tüylerin çıkış yönünün tersine Kazıma hücre verimi önemli HFS kaybı ve azalmaya neden olacaktır. HFS birlikte her bir bağlı ve küçük topaklar oluşturmayacağı; th azaltmak içinHF kümeleri e büyüklüğü bir seferde küçük bir alanda kazımak için deneyin. </li><li> Yeni kültür çanak saçsız deriyi aktarın ve eklemek PBS 10 ml - kurumasını önlemek için. Cildi kontrol edin ve kalan saç kazımak. </li><li> Tek bir HF süspansiyon elde edilinceye kadar bir neşter ve forseps kullanarak HFS yıkmak. Şiddetle tüm saç kümeleri kırmak için bir kaç dakika için 10 ml pipet kullanarak HF süspansiyon çiğnemek. Not: Buz üzerinde aşağıdaki adımların tümünü gerçekleştirin. </li><li> Önceden etiketli 50 ml tüp HF süspansiyon aktarın. </li><li> ; Deriden ve HF süspansiyon içeren hücre kültürü çanak durulama için kullanabilirsiniz - PBS aspire 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer. </li><li> yıkama <ol><li> 50 ml&#39;lik bir tüp üzerine monte 70 mikron hücre süzgecinden geçerek süspansiyon Filtre. (-% 3 şelatlı FBS içeren PBS) ilk 50 mi boru ve lekeleme tampon maddesi 10 ml süzgeç yıkayın. </li><li> geçirerek süspansiyon filtre40 mikron hücre süzgecinden 50 ml&#39;lik bir tüp üzerine yerleştirilir. Tüm hücreler, yeni bir tüpe aktarılmıştır sağlamak için lekeleme tampon maddesi 5-10 ml tüp yıkayın. tüm hayvanlar işlendikten kadar buz üzerinde süspansiyon tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. boyama tampon 5 ml pelet ve tekrar süspansiyon pelet bozmadan özenle aspire süpernatant. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire ve boyama tamponu 800 ul hücre pelletini. Not: Yukarıda belirtilen miktarlar erişkin farelerden elde edilen hücrelerin boyanması için yeterlidir. </li></ol></li><li> Önceden etiketli FACS Tüpler içine aktarın Süspansiyon. <ol><li> kontrol borular için, hücre süspansiyonunun (veya hücre süspansiyonundan kalan sol) 25-50 ul alır ve lekeleme tampon maddesi ile 300 ul toplam hacim tamamlanır. Not: Kontrol tüpleri (toplam hacim 300 ul) boyanmamış için hazırlayın (hiç antikorve hiçbir DAPI); DAPI sadece; ß1 integrin; α6 integrin; Sca-1; CD34. </li></ol></li><li> Uygun tüpe istenilen konsantrasyonlarda primer antikor ve DAPI (uygun dilüsyonları için malzemeler tabloya bakınız) eklenir. Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırmak için tüpler hafifçe vurun. buz üzerinde dönmek ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın. </li><li> Hücreler süspansiyonda kalmasını sağlamak için tüpler her 10 dakikada bir fiske yavaşça buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin ve. </li><li> lekeleme tampon maddesi (tüp başına yaklaşık 4 mi) ile her bir FACS tüpü doldurarak hücreleri yıkanır; 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Süpernatantı dikkatlice aspire ve boyama tamponu 800 ul hücre pelletini. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücre süzgecinden kapaklarla FACS tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. </li></ol> 4. Akım Sitometri Analizi <ol><li> signa için uygun filtreler ile debi sitometresinde hemen sıralama hücre geçinl algılama. (DAPI ölçümleri için) 405 nm menekşe, (APC uyarılması için) ve 633 nm kırmızı lazerler (FSC, SSC, PE, PE-Cy7 ve FITC ölçümler için) 488 nm mavi kullanın Not: Cihaz her üç floresan kanallar için dedektörleri kayıt olduğundan emin olun. </li><li> Tek lekeli kontrollerini kullanarak spektral örtüşme için lekesiz örnekleri ve tazminat dayalı ayarlayın floresan kapıları. Not: floresan sinyalleri herhangi bir örtüşme ortadan kaldırmak için kanallar arasındaki tazminat ayarlamak için tek lekeli kontrolleri kullanın. Tazminat ayarı kullanılan FACS sıralayıcı bağlıdır. </li><li> DAPI dayalı kurmak birincil kapıları ölü hücreleri hariç. </li><li> tekli olayları seçmek için scatter plot (FSC-A vs SSC-A) ayarlayın. </li><li> çiftler için ortadan kaldırmak ve tekli olayları ayırımcılık FSC ve SSC yükseklik ve genişlik parametrelerini ayarlamak. </li><li> CD ile ya kapı hücreleri yüksek α6 ve β1 ekspresyonu ile ve bu nüfus kapı hücreleri34 yüksek ifadesi veya Sca1 yüksek ifadesi. </li><li> önceden etiketlenmiş FACS tüpü içinde kriteri hücreleri. Not: izole edilebilir hücrelerinin iki genel nüfus; α6 + / β1 + / CD34 + / Sca-1 - ve α6 + / β1 + / Sca-1 + / CD34 -. bu tür hücre kültürü veya RNA izolasyonu gibi akış aşağı kullanılan uygulamalara kadar kriteri hücreler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır </li></ol>

<ol>
	<li>Wagers, A. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+adult+stem+cells.">Plasticity of adult stem cells.</a> Cell. 116, 639-648 (2004).</li><li>Blanpain, C., Lowry, W. E., Geoghegan, A., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal,+multipotency,+and+the+existence+of+two+cell+populations+within+an+epithelial+stem+cell+niche.">Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche.</a> Cell. 118, 635-648 (2004).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li><li>Hsu, Y. C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+business:+stem+cell+progeny+join+the+niche+to+regulate+homeostasis.">A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 103-114 (2012).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis:+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin.">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 207-217 (2009).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hair+cycle.">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li><li>Muller-Rover, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+guide+for+the+accurate+classification+of+murine+hair+follicles+in+distinct+hair+cycle+stages.">A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages.</a> J Invest Dermatol. 117, 3-15 (2001).</li><li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells.">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 267-278 (2009).</li><li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge+contribute+to+wound+repair+but+not+to+homeostasis+of+the+epidermis.">Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis.</a> Nat Med. 11, 1351-1354 (2005).</li><li>Hsu, Y. C., Pasolli, H. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+between+stem+cells,+niche,+and+progeny+in+the+hair+follicle.">Dynamics between stem cells, niche, and progeny in the hair follicle.</a> Cell. 144, 92-105 (2011).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tortoise+and+the+hair:+slow-cycling+cells+in+the+stem+cell+race.">The tortoise and the hair: slow-cycling cells in the stem cell race.</a> Cell. 137, 811-819 (2009).</li><li>Plikus, M. V., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+hair+cycle+domain+patterns+and+regenerative+hair+waves+in+living+rodents.">Complex hair cycle domain patterns and regenerative hair waves in living rodents.</a> J Invest Dermatol. 128, 1071-1080 (2008).</li><li>Ito, M., Kizawa, K., Hamada, K., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+stem+cells+in+the+lower+bulge+form+the+secondary+germ,+a+biochemically+distinct+but+functionally+equivalent+progenitor+cell+population,+at+the+termination+of+catagen.">Hair follicle stem cells in the lower bulge form the secondary germ, a biochemically distinct but functionally equivalent progenitor cell population, at the termination of catagen.</a> Differentiation. 72, 548-557 (2004).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+cells+reside+in+the+bulge+area+of+pilosebaceous+unit:+implications+for+follicular+stem+cells,+hair+cycle,+and+skin+carcinogenesis.">Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis.</a> Cell. 61, 1329-1337 (1990).</li><li>Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells:+a+folliculocentric+view.">Epithelial stem cells: a folliculocentric view.</a> J Invest Dermatol. 126, 1459-1468 (2006).</li><li>Trempus, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+for+living+murine+keratinocytes+from+the+hair+follicle+bulge+with+the+cell+surface+marker+CD34.">Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34.</a> J Invest Dermatol. 120, 501-511 (2003).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li><li>Lyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C8/144B+monoclonal+antibody+recognizes+cytokeratin+15+and+defines+the+location+of+human+hair+follicle+stem+cells.">The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 21), 3179-3188 (1998).</li><li>Liu, Y., Lyle, S., Yang, Z., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin+15+promoter+targets+putative+epithelial+stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge.">Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge.</a> J Invest Dermatol. 121, 963-968 (2003).</li><li>Vidal, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+is+essential+for+outer+root+sheath+differentiation+and+the+formation+of+the+hair+stem+cell+compartment.">Sox9 is essential for outer root sheath differentiation and the formation of the hair stem cell compartment.</a> Curr Biol. 15, 1340-1351 (2005).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr6+marks+stem+cells+in+the+hair+follicle+that+generate+all+cell+lineages+of+the+skin.">Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.</a> Science. 327, 1385-1389 (2010).</li><li>Nijhof, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-surface+marker+MTS24+identifies+a+novel+population+of+follicular+keratinocytes+with+characteristics+of+progenitor+cells.">The cell-surface marker MTS24 identifies a novel population of follicular keratinocytes with characteristics of progenitor cells.</a> Development. 133, 3027-3037 (2006).</li><li>Jensen, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+population+of+clonogenic+and+multipotent+murine+follicular+keratinocytes+residing+in+the+upper+isthmus.">A distinct population of clonogenic and multipotent murine follicular keratinocytes residing in the upper isthmus.</a> J Cell Sci. 121, 609-617 (2008).</li><li>Jensen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrig1+expression+defines+a+distinct+multipotent+stem+cell+population+in+mammalian+epidermis.">Lrig1 expression defines a distinct multipotent stem cell population in mammalian epidermis.</a> Cell Stem Cell. 4, 427-439 (2009).</li><li>Jaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+marks+cycling,+yet+long-lived,+hair+follicle+stem+cells.">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li><li>Horsley, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blimp1+defines+a+progenitor+population+that+governs+cellular+input+to+the+sebaceous+gland.">Blimp1 defines a progenitor population that governs cellular input to the sebaceous gland.</a> Cell. 126, 597-609 (2006).</li><li>Goldstein, J., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Home+sweet+home:+skin+stem+cell+niches.">Home sweet home: skin stem cell niches.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2573-2582 (2012).</li><li>Fuchs, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sept4/ARTS+regulates+stem+cell+apoptosis+and+skin+regeneration.">Sept4/ARTS regulates stem cell apoptosis and skin regeneration.</a> Science. 341, 286-289 (2013).</li><li>Nowak, J. A., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+epithelial+stem+cells.">Isolation and culture of epithelial stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to declare

Burada açıklanan protokol de yetişkin farelerin dorsal deri HFSCs izole etmek için kurulan, ancak aynı belirteç 2,16,23,28,29 seçimine göre, HF yapısı içindeki bir başka popülasyonlarının izole edilmesi için uygulanabilir. Bu yöntem, örneğin, doku ayrışma hücre izolasyonu için diğer yöntemler, içinde özellikle avantajlıdır, bu belirli bir hücre tipi seçilebilir ve heterojen hücre popülasyonu, bir karışımından toplanır. Bundan başka, burada tarif edilen yöntem, hızlı v...

Yetişkin kök hücreleri (SC&#39;ler) ölen hücrelerin yerine doku vücut dengesinin sürdürülmesinde ve yaralanma üzerine hasarlı dokuların onarımı için gereklidir. Bu SC&#39;ler sürekli kendini yenileme geçmesi ve çeşitli hücre soyları 1-3 ayırt etme yetenekleri ile tanımlanmıştır. Kendi ikmal için yetişkin SC&#39;ler bağlıdır iyi çalışılan sistemler, hematopoetik sistem, bağırsak ve cilt 1,2,4 bulunmaktadır. embriyojenez sırasında cilt epidermal hücrelerin tek bir tabaka olarak başlar. Mezenkimal hücreler cilt doldurmak ve altta yatan kollajen dermis 5 oluşturduklarında saç folikülü (HF) morfonogenezi başlar. Aşağıya doğru 6 büyümeye başlar saç placodes oluşturmak için daha sonra, dermal papilla (DP) oluşturan epidermal tabakasının altında doğrudan organize etmek ve epitel teşvik mezenkimal hücreler, uzman. Son derece HF alt kısmında yer alan matris hücreleri, çoğalan,iç katman saç şaft (HS) ve çevresindeki iç kök kılıfı (IRS) 2,3 oluşturmak için konsantrik silindir içine ayırt etmeye başlar ise, bu mezenkimal hücreler zarf ve saç ampul oluştururlar. interfolliküler epidermis (IFE), yağ bezi (SG) ve HF: doğum sonrası hayatta deri epidermis üç bölmeden oluşmaktadır. Homeostasis sürekli bir durumdadır IFE ve SG aksine, HF sürekli büyüme döngüleri (anagen), yıkım (katagen) ve geri kalanı (telojen) 4,7 uğrar dinamik bir mini organdır. Kıl folikülü kök hücreleri (HFSCs) yakıt bu daimi döngüsü, şişkinlik 4 olarak bilinen HF içinde özel bir niş bulunur. DP etkinleştirme sinyalleri HFSCs şişkinliği çıkış anajen takip sırasında proliferasyon başlar ve aşağı doğru ve böylece dış kök kılıf olarak bilinen hücrelerin uzun lineer iz oluşturma alçalma (ORS) 8-10. Matris hücreleri, yaniHF, hızla döngüsünün üssünde DP&#39;yi çevreleyen ve böylece HS ve IRS 10 (Şekil 1) üreten terminal farklılaşma geçiren yukarı göç. Anagen süresi saç uzunluğunu belirler ve matriks hücrelerinin 6 çoğalma ve farklılaşma kapasitesine bağlıdır. HF katagen girer zaman, ampul ateşkes transit yalıtım matris hücreler çoğalmaya apoptoz geçmesi ve HF 8,11 olmayan bisiklet parçası ulaşıncaya kadar yukarı DP çekerken tamamen gerileme. Bu geri çekme sırasında HF katagen karakteristik epitel iplikçik olarak bilinen geçici bir yapı oluşturur, ve çok sayıda apoptotik hücre içerir. Farelerde, katagen 3-4 arasındaki gün sürer ve son derece ilk saç döngüsünde eşitlenir. HF telojen ulaştığında tüm HFSCs pasif hale gelir. HF döngüsünün farklı aşamaları da m bağlı fare deri rengine değişiklikler ile karakterize edilirelanin üretimi. Katagen sırasında koyu gri anagen sırasında siyah deri değişiklikleri telojen 6,7,12,13 sırasında pembe. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> Şekil 1: Saç Folikül Döngüsü. HF kalıcı üst kısmının oluşan ve hızlı büyüme (anagen), yıkım (katagen) ve göreli bir sessizlik fazı veya geri kalanı (telojen) sürekli döngülerine maruz düşük sürekli yeniden yapılanma, bisiklet bölümü. Olan <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.</a> HF muhafaza SC&#39;ler başlangıçta sadece SG 14 altında HF daimi bölgesinde ikamet yavaş bisiklet etiket istinat hücreler (LRC) nüfusu ortaya öğütülmüş ümidin ile kovalamaca deneyleri, kullanılarak belirlendi. HFSC gelişmelerKarakterizasyon HF niş 15 belirli SC&#39;ler belirlemek ve izole etmek için kullanılabilir belirteçlerin az sayıda tespit edildi. Belki HFSCs zenginleştirilmesi için iyi markör CD34, aynı zamanda, insanlarda 16 bir hematopoietik SC markör olarak tanımlanan bir hücre yüzey markörüdür. Bu CD34 + nüfus içinde iki ayrı nüfus da izole α6 integrin ekspresyonu 2 dayalı olmuştur. Başka bir belirteç CD34 ekspresyonu ile birlikte lokalize ve K-15 promoteri hedefleme ve transgenik hayvanlarda 15,17-19 içinde HFSCs izole edilmesi için kullanılan, keratin yüksek şişiklik bölgesinde ifade edilir 15 (K15) &#39;dir. Geçtiğimiz on yıl içinde HFSCs ve projenitör hücrelerin birçok farklı popülasyonlar da HF 17,20-27 içinde yer bildirilmiştir. HFSCs ek heyecan verici özelliği cilt onarım katkıları olduğunu. Normal şartlar altında HFSCs HF doldurmak ve IFE homeostazındaki yer almazlar. However yaralama yanıt olarak, bu hücreler IFE 9 repopulating kendi SC niş ve yardım çıkar. Son zamanlarda fareler pro-apoptotik Sept4 / sanat geni gösterim için apoptoza bir direnç gösterir CD34, 15 K ve SOX9 + HFSCs, artmış sayıda silinmiş göstermiştir. HFSCs Sept4 / sanat izole edilmiştir - / - dorsal derileri Kontrol THP (FACS) kullanılarak CD34 + ve K15 + HFSCs sayısının fazla iki kat daha yüksek olmuştur. Bunlar Sept4 / SANAT - / - HFSCs in vitro genişletilmiş ve değil sadece daha koloniler doğurdu ama kontrollere 28 ile karşılaştırıldığında aynı zamanda sert koşullarına dayanacak şekilde başardık. HFSCs artan sayısına sahip bir sonucu olarak, Sept4 / sanat - / - farelerinin, deri eksizyon yaralanmaları yanıt olarak önemli ölçüde daha hızlı iyileşti. Çarpıcı, Sept4 / SANAT - / - fareler displayeyara yatağından rejenere HFS ve önemli ölçüde daha küçük izleri da çok sayıda. Ayrıca, XIAP (apoptoz X&#39;e bağlı inhibitörü), SANAT biyokimyasal hedefi için silinen fareler bozulmuş iyileşme 28 gösterdi. Bizim sonuçları ve diğer laboratuarlarda yapılan çalışma HFSCs yetişkin SC&#39;ler biyolojisi ve fonksiyonu eğitim için ideal bir model olarak hizmet olduğunu göstermiştir. Burada, zenginleştirme ve HFSCs dört markerlerin ekspresyonu göre epidermal keratinositler izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır: integrin α6; integrin β1; Sca-1 (epidermal keratinositler için bir belirteç) ve CD34. K15 + HFSCs Benzer bir ayrılma K15-GFP raportör fare 19 kullanılarak da gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Primal Critical Care</td><td>&amp;nbsp;66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Carbon dioxide</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Electro Shaver</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>Golden A5</td><td>Shaver from any other company could be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Gadot Lab</td><td>830000051</td><td>96% ehtanol diluted with distilled water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissection mat</td><td></td><td></td><td>Dissection tools from any provider can be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td>Foreceps from any other company could be used</td></tr><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Dumont</td><td>14094-11</td><td>Scissors from any other company could be used</td></tr><tr><td>Needles/Pins</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Albion</td><td>10</td><td>Ensure that the scalpel has a blunt end</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td></td><td>In house PBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-050-1A</td><td>Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Pipettes 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4488</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterile centrifuge tubes</td><td>Minplast Ein-shemer</td><td>35050-43</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362548</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362549</td><td></td></tr><tr><td>Staining buffer</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf 5804 R</td><td>5805 000.017</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes with Cell strainer caps&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Integrin &amp;beta;1</td><td>eBioscience</td><td>25-0291</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>eBioscience</td><td>15-0495</td><td>1:600</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>eBioscience</td><td>11-5981</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>eBioscience</td><td>9011-0349</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Dry Chelex</td><td>BioRad</td><td>142-2842</td><td></td></tr><tr><td>Beaker&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NHCl</td><td>BioLab</td><td>1903059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Beit Haemek Biological Industries</td><td>400718</td><td>FBS obtained from a different company can be used</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>Ilmabor</td><td>Boro 3.3</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Autofil</td><td>1102-RLS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

Bu protokol ayrıntılı olarak zenginleştirme ve nüfusun iki tip izolasyonunu anlatmaktadır. Şişkinlik AVM ve epidermal keratinositler 2 protokolünün önemli adımlar göstermektedir Şekil. geri 8 haftalık farelerin dorsal kaldırıldı cilt kullanarak, biz sadece HFSCs ifade edilir CD34 işaretleyici kullanarak tümsek SC&#39;ler zenginleştirilmiş; ve Sca-1, epidermal keratinositler etiketler. 3 cilt epitel hücrelerinin α6...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin at JoVE.com

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

isolating-hair-follicle-stem-cells-epidermal-keratinocytes-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

21.0K Görüntüleme.  Technion Israel Institute of Technology. An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

Video: Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Gelişim Biyolojisi

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Biyoloji

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...