German Research Foundation (FOR2240 "(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye" to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 "Joining Forces to Corneal Regeneration" (to CC).

insan dokularının kullanılması gözden geçirilmiş ve bir kurumsal inceleme kurulu veya eşdeğeri tarafından onaylanmalıdır. Burada anlatılan çalışma yerel etik komitesi tarafından onaylanmış ve bilimsel inceleme için onay aldı. Bu çalışma Helsinki Bildirgesi göre yapıldı. İnsan skleral örnekleri Göz Hastalıkları Anabilim Dalı Göz Bankası, Köln Üniversitesi, Almanya&#39;da (maksimum postmortem süresi 24 saat) küre vericilerden gözlerinden elde edilmiştir. 1. Deneysel hazırlanması <ol><li> % 96 etanol hazırlayın ve farklı tüplerde tamponlu tuz (PBS) fosfat. PBS,% 2 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden Tavsiye edilen seyreltme birincil antikorların hazırlanması ve buz üzerinde tüm çözümler tutun. örnek başına 100 ul hazırlayın. </li><li> bütün aletleri temizleyin ve keskin neşter kullanın. Aynı neşter ile kesim tekrarlanır sonra neşteri değiştirin. </li><li> 1-2 colibri forseps, düz mikro kesme makasları, bir 10. neşter eldeOftalmik neşter mikro tüy ve dört 26 G iğne veya. </li><li> Bir polistiren plaka etrafında alüminyum folyo sarın veya doku sabitlemek için bir mantar plaka kullanın. binoküler stereo mikroskop altında çalışın. Gerekirse bir laminer hava akımı altında steril çalışın. </li></ol> 2. sklera hazırlayın <ol><li> Yavaşça ampul tutun ve korneoskleral parçası üzerinde delme öldüğünü keşfetmek gerçekleştirmek, sonra Trepan döndürün. eşit yuvarlak kesim gerçekleştirmek için yüzeye dikkatlice ve eşit Trepan döndürün. 15,5 mm büyüklüğünde Trepan kullanın. kavisli makas ile kalan ekleri kesin. korneoskleral öldüğünü keşfetmek çıkarın. Bu öne açılan ampul neden olacaktır. <ol><li> yukarı açık bölümü ile bir bez üzerinde sklerasına koyun. sklera her iki katmanları (retina ve uvea) koparmak için colibri forseps kullanarak, retinaya ve uvea çıkarın. İç sklera pigmente uvea bırakmayın. papilladan retina ve uvea kaldırmak için kavisli makas kullanın. rem kaldırTahliye konjonktiva, göz dışı kaslar ve yüzeysel skleradan Tenon kapsülü. </li></ol></li><li> düz tip makas ve colibri forseps kullanarak gerekli boyutta skleral örnek çıkarın. Yaklaşık 2 cm farklı yerlerden 2 boyutlu skleral örnekler alabilir. Çünkü küçük boyutu, nazikçe sklera tutun ve düz tip makas kullanarak kareler olarak gerekli boyut kesip. korneoskleral trepanasyon skleral numune ön kenar tanımlar. <ol><li> tekrarlanan yakaladı doku konfokal mikroskopi analiz için uygun değildir alanı olarak forseps ile kapma kaçının. Ve kullanılan antikorların miktarı (Şekil 1 karşılaştırmak, örneğin anterior vs posterior) deney türüne bağlı olarak numunelerin gerekli sayıda hazırlayın. </li></ol></li><li> daha sonra kullanmak için 1.5 ml tüpler örnekleri koyun. 15 dakika boyunca 1.5 ml% 96 ​​etanol içerisinde örnekleri saptamak, ve daha sonra 5 dakika boyunca her üç kez yıkayınçalkalayıcı üzerinde 1.5 ml PBS içerisinde. Dondurulmuş doku ile çalışıyorsanız, ek donma önce bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Taze doku kullanın. Bu mümkün değil ise, ancak, ek sıvı azot içinde sklera dondurmak ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklayın. dondurulmuş doku kullanımdan önce çözülme ile çalışma durumunda. Tekrarlanan çözülme ve donma döngüleri kaçının. </li><li> 2 saat boyunca oda sıcaklığında 1.5 ml 5% BSA ihtiva eden PBS içinde, her bir örnek tutun. Bu adım Lamine için yararlıdır örnek bir şişmesine neden ve aynı zamanda belirsiz bağlama engeller. </li><li> Numuneler kabarmış sonra, laminasyon skleral kareler hazırlamak. Örneğin bir binoküler stereo mikroskop mikroskop altında çalışın. alüminyum folyo veya 26 G iğneler kullanılarak mantar plaka sarılı polistiren zarı arka skleral örnekleri yapıştırın. </li><li> onlar mikroskop altında görme alanı karışmaz, böylece iğne kenarlarını bükün. </li><li> tam kalınlıkta skleral samp Laminatles. <ol><li> İlk olarak, colibri forseps kullanılarak ön skleral kenarına tutun. Sonra dikkatlice 10. neşteri, oftalmik neşter mikro tüy veya spatula bıçak kullanarak yüzeysel sklera ince bir tabaka kesti. yatay neşter tutun ve alttaki katmanla itibaren ince mümkün olduğunca yüzeysel katmanı kesti. </li><li> skleral meydanına ince bir skleral tabaka teşrih. Standart cerrahi teknikler trabekülektomiye sırasında kanat hazırlamak ve 30-80 um kalınlığında tabakalar (Şekil 2 ile karşılaştırınız) ile sonuçlanmalıdır Bu yöntem karşılaştırılabilir. </li></ol></li><li> Örneğin, 50 ul PBS bir pipet kullanılarak doku PBS küçük miktarlarda eklenmesi ile sklera kurumasını önler. </li><li> Su geçirmez renk örn ve katman (yüzeysel ve derin) (extern ve stajyer doğru) 96 plaka PBS 100 ul halinde kesilmiş katmanları koyun ve yönünü hem de etiket. </li><li> Doku tamamen lamine kadar tekrarlayın 2.7-2.9 adımları tekrarlayın. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. İmünohistokimya gerçekleştirin <ol><li> Tavsiye edilen seyreltme halinde gerekli birincil antikor 100 ul ekle. Burada, örneğin kullanımı CD 31 (monoklonal, fare anti-insan) ve LYVE1 antikor (tavşan anti insan), 1 seyreltme hem de: (% 2 BSA içeren) PBS içinde 100 ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde orta değiştirmek üzere, iyi duvarına pipet tutun ve sıvıyı. </li><li> Sonraki gün, bir karıştırıcı üzerinde 200-300 ul PBS ile 5 dakika için numuneler üç kez yıkayın. karşılık gelen sekonder antikor, 100 ul ilave et; Burada keçi anti fare floresein izotiosiyanat (FITC) ve keçi anti tavşan siyanin boyası 3 (Cy3) kullanın ve 1-2 saat için oda sıcaklığında örnekleri inkübe edin. İkincil antikorlar 1 seyreltilir: 300 PBS,% 2 keçi serumu ihtiva eden. </li><li> çalkalayıcıda 200-300 ul PBS içinde 5 dakika boyunca tekrar üç kere, her numune durulayın. </li><li> Çekirdek boyama gerçekleştirin, örneğin </&gt; Em. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (seyreltme oranı: 1: 2.000, her biri 100 ul de ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir), daha sonra bir karıştırıcı üzerinde 200-300 ul PBS içinde tekrar 2 kez yıkayın. </li><li> , Mikroskop lamı üzerine örnekleri aktarın embed onları floresan montaj orta 1-2 damla, bir lamel eklemek, şeffaf vernik ile kenarları kaplayarak mühür ve mağaza 4 ° C&#39;de daha sonra kullanmak üzere veya doğrudan konfokal ile slaytlar incelemek mikroskop. </li><li> örnekleri analiz etmek için bir konfokal mikroskop (veya eşdeğeri) kullanın. İstenilen büyütme, örneğin 10-40X büyütme kullanın. </li><li> Örneklerin kalınlığı doğrulamak için, konfokal mikroskopi Z-Yığınlar kullanarak ölçün. kalınlık ekvatorial ve posterior (giriş karşılaştırın) farklıdır mümkün skleral bölümlerin miktarı, sklera konumuna bağlıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+(LYVE1)-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera.">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera.">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li><li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection.">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li><li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis:+what+can+we+learn+from+the+eye.">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li><li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments.">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li><li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact,+functional+spleen.">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li><li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+chamber-associated+immune+deviation,+ocular+immune+privilege,+and+orthotopic+corneal+allografts.">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li><li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera.">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li><li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit.">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li><li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+content+of+the+scleral+spur,+trabecular+mesh,+and+sclera.">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li><li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The sclera. , (2012).</li><li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Blutkreislauf+des+Auges.">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225 (1943).</li><li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li><li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm's+canal.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li><li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+Schlemm's+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins.">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li><li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti.">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li><li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study.">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li><li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment.">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li><li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+(author's+transl).">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no financial disclosures. The contents of this article are solely the responsibility of the authors.

İnsan sklera Laminasyon Bu doku üzerinde eş odaklı mikroskopi gerçekleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu süreçte kritik bir adım doku yapıştırılması için etanol kullanımı yerine formalin olduğunu. sabitleme için etanol yerine formalin kullanırken bizim deneyim, daha iyi sonuçlar elde edilmektedir. Blunt neşter prosedürü ağırlaştırmak ve kaçınılmalıdır. Benzer şekilde, sklera kuruması o prosedürü komplike ve görüntülerin kalitesini azaltır, kaçınılmalıdır. <p cl...

sklera yoğun bağ dokusu yapılmış göz kapakları, sert dış tabakasıdır. Göz içi yapıları korumak için ve göz içi basıncı korumaya yardımcı olur. Böylece, sklera net görüş için gereklidir. Bu lenf damarlarının 1,2 yoksun ve böylece o ve lenfatik serbest gözün iç 3-7 arasında bir dış lenfatik serbest sınırını oluşturur. Aynı zamanda bu sayede tendonların anatomik benzerlik paylaşarak, göz dışı kaslarının için bağlanma siteleri sağlar. Sklera esas tip I kollajenin yoğun demetleri oluşur ve kolajen tip III, IV, V, VI, VIII, 8,9 ve elastin 10,11 daha az sayıda sahip olduğu için, bu doku immünohistokimya için kullanımı kolay değildir. (1) yüzeysel vaskülarize episkleraya, konjonktiva ve tenon kapsülünün altında bulundu ve iki tarafın ve inci doğru: Anatomik olarak, sklera üç ana katmandan ayrılabiliryörüngeye bakan gözün e geri; (2) sklera stroma, sklera ana parçası; ve (3) ile doğrudan uvea üzerinde bulunan ince, pigmentli tabaka, tabakanın fusca. Sklera ile ilgili bizim anatomik bilgi 20. yüzyılın ilk yarısında kaynaklanmaktadır. O zaman, araştırmacılar başta Hindistan mürekkep enjeksiyonları 12 kullanılarak ve damar 13-15 döküm damarsal anatomisi okudu. Daha sonra, bu anjiografik çalışmalar 16-19 yılında araştırılmıştır. O zamandan bu yana, eski teknikler geliştirildi ve yenileri bize önceki anatomik bilgiyi tamamlamak için izin olduğunu geliştirilmiştir. Bu lenfatik damar endotel spesifik hiyalüronan alıcısı-1 (LYVE1) 20 veya podoplanin 21 gibi, güvenilir lenf belirteçleri beri Örneğin, sadece on yıl olmuştur. Mikroskopisi farklı ti anatomik özelliklerini incelemek için yeni imkanlar sunuyorgöz ssues. Birden lekeler hücrelerin işaretleri ayırt etmek için ya da kan damarları ve diğer anatomik yapılara göre hücre lokalizasyonu için kullanılmak üzere bu sağlar. Numune daha büyük bir boyutta olduğunu ve ne zaman belirli bir hücre tipi arama bize örnek üzerinden tarama sağlar zaman bir bakış sağlar. Z yığın tekniği ile, konfokal mikroskopi 100-200 um kadar örnekler için kullanılabilir. Sklera kas eklemeleri arkasında 0.3 mm ve arka kutupta 11 1 mm arasındaki kalınlıklarda farklıdır. kalınlığı ve opaklık hem nedeniyle, sklera geleneksel yöntemlerle konfokal mikroskopi için uygun değildir. Bu durumu düzeltmek için, skleral dokular konfokal mikroskobu ile analiz için izin lamine edilmiştir. Bu teknoloji, insan sklera hem de fizyolojik ve patolojik durumların daha iyi anlamaya için yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>96% ethanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>binocular stereo microscope&amp;nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G needles&amp;nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgium</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 scalpel&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic scalpel micro feather&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 antibody&amp;nbsp; (polyclonal rabbit anti human)</td><td>Zytomed, Germany</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>goat anti mouse FITC antibody</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rabbit Cy3 antibody</td><td>Dianova, Germany</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum normal</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&amp;uuml;nde, Germany</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluorescent mounting medium&amp;nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 confocal microscopy&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

using a laminating technique to perform confocal microscopy of the human sclera

sklera kapakları ve göz koruyan yoğun bağ dokusu olduğunu. Özellikle yoğun kolajen demetleri (tip I, III, IV, V, VI ve VII) oluşur. Nedeniyle otofloresansı, opaklık, ve kalınlık için, konfokal mikroskopi için uygun bulunmamıştır. Antijen alımı için doku ön ısıtma, özellikle, immünhistokimya için parafine gömüldü formalin ile fikse sklerasına kullanan teknik zorlukları vardır Burada sunulan birine alternatif bir yaklaşım. sklera hücreleri ve damarlar hem de göreceli olarak zayıf olduğu için, daha büyük doku örneklerinin kullanılması bakan hücreleri önlemek ve gemi ve diğer anatomik sitelere ilişkin kendi yerleşimini anlamada yardımcı olmak için araştırılmıştır. konfokal mikroskop altında daha büyük bir doku örneklerinin analizi için izin vermek için, bir laminasyon tekniği sklera ince tabakaları oluşturmak için gerçekleştirilmiştir. CD31 kan damarları ve lenfatik damar endotel hyalu sonuçlarının analizini takibenronan reseptör 1 (LYVE1) Bilimsel inceleme için onay elde edildiği için pozitif hücrelerin, bu yöntemin avantajları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.

Burada gerçekleştirilen temsili denemelerde, bu özel laminasyon tekniği kullanılarak elde edilen gösterilebilir faydaları vardır. İlk deneme üç temsilci resim (Şekil 3) episkleral damar pleksusun farklı ağını göstermektedir. gemiler CD31 pozitiftir. İkinci deneme episkleraya ve CD31 pozitif kan damarları olan ilişkilerine özellikle LYVE1 + hücrelerde, bağışıklık hücrelerini gösteri...

Watch this Scientific Journal Video about Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera at JoVE.com

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

İnsan sklera Konfokal Mikroskobu gerçekleştirmek için bir Laminasyon Tekniği


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

7.5K Görüntüleme.  University of Cologne. Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used. 

Video: Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Gelişim Biyolojisi

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Biyomühendislik

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

Tavşan sklera bir araç olarak ikinci harmonik üretimi sinyalleri tedavi doku (TXL) için miyopi Cross-linking değerlendirilmesi için

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Tıp

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Nörobilim

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Biyoloji

Tek Çekirdekli Dizileme veya İmmün Boyama için Stria Vascularis Mikrodiseksiyonu

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

Yazar Spot Işığı: Tek Çekirdekli Dizileme veya İmmün Boyama için Yetişkin Fare Stria Vascularis'in Diseksiyonu  

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

İnsan sklera Konfokal Mikroskobu gerçekleştirmek için bir Laminasyon Tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Tavşan sklera bir araç olarak ikinci harmonik üretimi sinyalleri tedavi doku (TXL) için miyopi Cross-linking değerlendirilmesi için

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu