German Research Foundation (FOR2240 "(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye" to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 "Joining Forces to Corneal Regeneration" (to CC).

O uso de tecidos humanos devem ser revistos e aprovados por um conselho de revisão institucional ou equivalente. O trabalho aqui descrito foi aprovado pelo comitê de ética local e teve a aprovação para análise científica. Este trabalho foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinki. Os espécimes esclerais humanos foram obtidos a partir dos olhos de doadores globo (máximo de post-mortem de tempo de 24 horas), no Banco de Olhos do Departamento de Oftalmologia da Universidade de Colônia, Alemanha. 1. Preparação Experimental <ol><li> Preparar 96% de etanol e salino tamponado com fosfato (PBS) em diferentes tubos. Prepare os anticorpos primários na diluição recomendada de PBS contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) e manter todas as soluções em gelo. Preparação de 100 ul por amostra. </li><li> Limpe todos os instrumentos e usar bisturis afiados. Depois de repetido o mesmo corte com bisturi, alterar o bisturi. </li><li> Obter 1-2 forceps Colibri, micro tesouras de dissecação em linha reta, um bisturi # 10ou bisturi oftálmico micro pena, e quatro 26 agulhas G. </li><li> Enrole a folha de alumínio em torno de uma placa de poliestireno ou usar uma placa de cortiça para fixar o tecido. Trabalhar debaixo de um microscópio estéreo binocular. Trabalhar estéril debaixo de um fluxo de ar laminar, se necessário. </li></ol> 2. Prepare a esclera <ol><li> Pressione cuidadosamente a lâmpada e executar uma trepanação perfurante por parte córneo, e gire o trepan. Gire o trepan cuidadosamente e uniformemente sobre a superfície para realizar um corte igualmente rodada. Use um trepan tamanho 15,5 mm. Cortar os acessórios restantes com tesoura curva. Remova a trepanação córneo. Isto irá resultar em uma lâmpada anteriormente aberto. <ol><li> Coloque a esclera em um cotonete com a parte aberta para cima. Remova a retina e úvea, usando uma pinça colibri de retirar as duas camadas (retina e Uvea) da esclera. Não deixe a úvea pigmentada na esclera interior. Use tesoura curva para remover a retina e da úvea papila. Remover o REMaining conjuntiva, músculos extra-oculares, e da cápsula de Tenon da esclera superficial. </li></ol></li><li> Retirar a amostra escleral no tamanho necessário utilizando-tipo reto tesouras e fórceps Colibri. Tome cerca de 2 cm2 amostras esclerais porte de diferentes locais. Por causa do tamanho pequeno, segurar a esclera suavemente e cortar o tamanho exigido, quadrados usando os do tipo reta tesoura. A trepanação córneo define a margem anterior das amostras esclerais. <ol><li> Evitar repetido agarrando com a pinça como a área onde o tecido foi agarrado não é adequado para análise de microscopia confocal. Prepara-se o número necessário de amostras, dependendo do tipo de experiência (por exemplo, vs anteriormente posteriormente, comparar Figura 1) e a quantidade de anticorpos utilizada. </li></ol></li><li> Coloque as amostras em tubos de 1,5 ml para uso posterior. Fixar as amostras em 1,5 ml de etanol a 96% durante 15 minutos, e, em seguida, lavá-los três vezes cada durante 5 minem 1,5 ml de PBS no agitador. Se trabalhar com tecido congelado, execute essa etapa antes pressão congelamento. </li><li> Use tecido fresco. No entanto, se isso não for possível, pressão congelar a esclera em azoto líquido e mantê-lo a -20 ° C para uso posterior. Se trabalhar com tecido congelado, descongelar antes de usar. Evite o descongelamento repetido e ciclos de congelamento. </li><li> Manter cada amostra em PBS contendo 1,5 ml de BSA a 5% à temperatura ambiente durante 2 h. Este passo induz um aumento de volume da amostra, que é útil para a laminação e também previne a ligação inespecífica. </li><li> Depois que as amostras têm aumentado, preparar as praças esclerais para laminação. Trabalhar sob um microscópio, por exemplo, um microscópio estéreo binocular. Apor as amostras esclerais posteriores à membrana de poliestireno embrulhados em papel alumínio ou a placa de cortiça utilizando os 26 g de agulhas. </li><li> Dobrar as extremidades das agulhas, de forma que não interfiram com o campo visual sob o microscópio. </li><li> Laminar o SAMP escleral de espessura totalles. <ol><li> Primeiro, mantenha a borda escleral anterior usando uma pinça Colibri. Em seguida, cuidadosamente cortar uma fina camada superficial da esclera usando o bisturi # 10, o bisturi oftálmica micro pena, ou uma lâmina de uma espátula. Segurar o bisturi horizontalmente e cortar a camada superficial tão fina quanto possível, a partir da camada subjacente. </li><li> Dissecar uma camada fina escleral da praça escleral. Este método é semelhante às técnicas cirúrgicas convencionais para preparar uma aba durante trabeculectomia e deve resultar em camadas de espessura de 30-80 ^ m (comparar com a figura 2). </li></ol></li><li> Evitar a secagem da esclera pela adição de pequenas quantidades de PBS para o tecido, por exemplo, 50 ul de PBS utilizando uma pipeta. </li><li> Coloque as camadas cortadas em 100 ul de PBS na placa de 96 poços e rotular tanto a orientação (no sentido externo e interno) e a camada (superficial e profunda), por exemplo com uma cor à prova de água. </li><li> Repita os passos 2,7-2,9 até que o tecido está completamente laminado. &lt;/ Li&gt; </ol> 3. Execute Imunohistoquímica <ol><li> Adicionar 100 ul de anticorpos primários necessários para a diluição recomendada. Aqui, por exemplo, utilização de CD 31 LYVE1 anticorpo (anti-humano de coelho) (monoclonal de ratinho anti-humano) e, tanto em uma diluição de 1: 100 em PBS (contendo 2% de BSA) e incubar a 4 ° C durante a noite. Para alterar a forma da placa de 96 poços, segurar a pipeta para a parede do poço e remover o fluido. </li><li> No dia seguinte, as amostras de lavar três vezes cada durante 5 min com 200-300 ul de PBS no agitador. Adicionar 100 uL de anticorpos secundários correspondentes; aqui usar de cabra anti-rato fluoresceína isotiocianato (FITC) anti-coelho de cabra e corantes de cianina 3 (Cy3), e incuba-se as amostras à temperatura ambiente durante 1-2 horas. Dilui-se a anticorpos secundários 1: 300 em PBS contendo soro de cabra a 2%. </li><li> Lavar as amostras novamente três vezes cada durante 5 minutos em 200-300 ul de PBS no agitador. </li><li> Realização da coloração núcleo, por exemplo, </em&gt;. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (diluição 1: 2.000, 100 ul em cada poço e incubar 10 min à temperatura ambiente), depois lavar novamente 2 vezes em 200-300 ul de PBS no agitador. </li><li> Transferir as amostras em lâminas de microscópio, incorporá-los em 1-2 gotas de meio de montagem fluorescente, adicionar uma lamela, selá-lo, cobrindo as bordas com verniz transparente, e armazenar a 4 ° C para uso posterior ou examinar diretamente os slides com a confocal microscópio. </li><li> Usar um microscópio confocal (ou equivalente) para analisar as amostras. Use a ampliação desejada, por exemplo 10-40X ampliação. </li><li> Para verificar a espessura das amostras, medida com microscopia confocal usando Z-pilhas. A quantidade de possíveis secções esclerais depende da localização da esclerótica, tal como a espessura difere equatorial e posterior (comparar introdução). </li></ol>

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	<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+(LYVE1)-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera.">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera.">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li><li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection.">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li><li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment.">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li><li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+(author's+transl).">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li><li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LYVE-1,+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein,+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan.">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li></ol>

The authors declare no financial disclosures. The contents of this article are solely the responsibility of the authors.

Laminar a esclerótica humana é um método para a realização de microscopia confocal sobre este tecido. Um passo essencial neste processo é a utilização de etanol em vez de formalina para a aposição do tecido. Em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos quando se utiliza etanol em vez de formol para fixação. bisturis Blunt agravar o processo e devem ser evitadas. Da mesma forma, a secagem da esclera deve ser evitado, uma vez que complica o processo e reduz a qualidade das imagens. <p class="...

A esclerótica é a camada externa rígida que cobre o olho, o que é feito de tecido conjuntivo denso. Isso ajuda a proteger as estruturas intra-oculares e para manter a pressão intra-ocular. Assim, a esclerótica é essencial para a visão clara. É desprovida de vasos linfáticos 1,2 e, assim, forma uma borda livre-linfática exterior entre ele e o olho interior livre de linfático 3-7. Ele também fornece locais de ligação para os músculos extra-oculares, partilhando assim semelhanças anatômicas com tendões. Porque a esclera consiste principalmente de feixes densos de colágeno tipo I e tem um número menor de colágeno tipo III, IV, V, VI, VIII 8,9 e elastina 10,11, este tecido não é fácil de usar para imuno-histoquímica. Anatomicamente, a esclerótica podem ser separadas em três camadas principais: (1) o episclera vascularizado superficial, localizado por debaixo da conjuntiva e da cápsula de Tenon e para os lados e the parte de trás do olho de frente para a órbita; (2) o estroma escleral, a parte principal da esclera; e (3) o fusca lâmina, que é uma camada fina, pigmentada localizada directamente acima da úvea. Nosso conhecimento anatômico sobre a esclera decorre, principalmente, da primeira metade do século 20. Naquela época, os investigadores estudaram a anatomia da vasculatura principalmente usando Índia injeções de tinta 12 e vascular lançando 13-15. Mais tarde, foi pesquisado em estudos angiográficos 16-19. Desde então, técnicas mais antigas foram melhoradas e novos foram desenvolvidos que nos permitiram completar conhecimento anatômico anterior. Por exemplo, tem sido apenas cerca de uma década desde que nós tivemos tais marcadores linfáticos confiáveis ​​como endotélio vascular linfática hyaluronan específica receptor-1 (LYVE1) 20 ou podoplanina 21. A microscopia confocal oferece novas possibilidades para o estudo das características anatômicas dos diferentes tissues do olho. Ele permite várias manchas a ser utilizada para diferenciar os marcadores de células ou para a localização das células em relação aos vasos sanguíneos e outras estruturas anatómicas. Ele fornece uma visão geral, quando a amostra é de um tamanho maior e permite-nos verificar através de uma amostra, quando em busca de um tipo de célula específico. Com a tecnologia Z-Pilha, microscopia confocal pode ser utilizado para as amostras até 100-200 um. A esclerótica difere de espessura entre 0,3 mm por trás das inserções musculares e 1 mm no pólo posterior 11. Devido tanto a sua espessura e opacidade, a esclera não é adequado para microscopia confocal utilizando métodos tradicionais. Para remediar esta situação, tecidos esclerais foram estratificados para permitir a sua análise com microscopia confocal. Esta tecnologia é útil para obter uma melhor compreensão de ambas as situações fisiológicas e patológicas na esclera humana.

<table><tbody><tr><td>96% ethanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>binocular stereo microscope&amp;nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, China</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G needles&amp;nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgium</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm trepan</td><td>Geuder, Heidelberg, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 scalpel&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic scalpel micro feather&amp;nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 antibody&amp;nbsp; (polyclonal rabbit anti human)</td><td>Zytomed, Germany</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>goat anti mouse FITC antibody</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rabbit Cy3 antibody</td><td>Dianova, Germany</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum normal</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides&amp;nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&amp;uuml;nde, Germany</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluorescent mounting medium&amp;nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 confocal microscopy&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Germany</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

using a laminating technique to perform confocal microscopy of the human sclera

A esclerótica é um tecido conjuntivo denso que cobre e protege o olho. Ela consiste principalmente de feixes de colágeno densas (tipos I, III, IV, V, VI e VII). Devido à sua autofluorescência, opacidade, e espessura, não foi considerado adequado para a microscopia confocal. Uma abordagem alternativa para o apresentado aqui, que utiliza esclera fixado com formalina embebido em parafina para imuno-histoquímica, tem desafios técnicos, especialmente quando o pré-aquecimento do tecido para a recuperação de antigénio. Desde a esclera é relativamente pobre em ambas as células e vasos, o uso de amostras de tecido maiores foi explorada para ajudar a evitar que as células com vista e para compreender a sua localização em relação aos navios e outros sítios anatômicos. Para permitir a análise de amostras de tecido maiores, sob o microscópio confocal, uma técnica de laminação foi efectuada para criar camadas finas da esclera. Após a análise dos resultados dos vasos sanguíneos CD31 e vasos linfáticos endotelial hyalureceptor Ronan 1 (LYVE1) células positivas, para o qual foi obtido uma autorização para exame científico, as vantagens e limitações deste método são discutidas.

Nas experiências representativas realizadas aqui, há benefícios demonstráveis ​​derivados da utilização desta técnica de laminação em particular. A primeira experiência ilustra a rede diversificada de plexo de vasos sanguíneos episcleral em três imagens representativas (Figura 3). Os vasos são positivas para CD31. O segundo experimento mostra células do sistema imunológico, em particular de ...

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Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

7.5K visualizações.  University of Cologne. Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used. 

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Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Biologia do Desenvolvimento

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

Microscopia de luz-folha para visualização tridimensional de células do sistema imunológico humanas

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Imunologia e Infecção

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Bioengenharia

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Medicina

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Neurociência

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Biologia

Microdissecção da Estria Vascular para Sequenciamento de Núcleo Único ou Imunomarcação

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

Autor em destaque: Dissecção de estria vascular de camundongo adulto para sequenciamento de núcleo único ou imunocoloração  

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

Usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Microscopia de luz-folha para visualização tridimensional de células do sistema imunológico humanas

Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas

Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação

Dissecção da estria vascular de camundongos adultos para sequenciamento de núcleo único ou imunomarcação