Bu çalışma mali hibe K22AI099165 (AWB) tarafından, P41GM103390 (KWM) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri P01GM107012 (KWM) ve Iowa State Üniversitesi Biyokimya, Biyofizik ve Moleküler Biyoloji Roy J. Carver Bölümü fonları tarafından desteklenen . Bu çalışmanın içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Bu protokol, HEK293F ya HEK293S hücreleri kullanılarak ekspresyon için yeterlidir. 1. Hücre kurulması <ol><li> Kültür Aşılama Not: Tüm kültür işleme prosedürleri BSL-2 tesisinde yapılabilir ve her bir madde, su çözeltisi içerisinde% 70 etanol ile püskürtülerek sterilize edilmelidir biyo-güvenlik kabinine getirdi. <ol><li> 135 rpm, 80% nemde kuluçka çalkalayıcı çalıştırın ve% 8.0 CO2 ve 37 ° C&#39;de ilave edildi. Çalışma için en az 1 saat önce biyogüvenlik kabini UV lambası &quot;açık&quot; konuma getirin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de su banyosu içinde sızdırmaz Orta A ve B Orta şişe Prewarm. </li><li> Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile püskürtme ile havalandırılmış bir kap, pipetler, Pipetler, ve önceden ısıtılmış Ortam şişe ile 125 ml&#39;lik bir Erlenmeyer flasks büyüme sterilize edin. Biyogüvenlik kabini bu öğeleri yerleştirin. Not: 125 ml Erlenmeyer kültür şişesi kapsayan sadece dış plastik sterilize ve ne zaman ben o zaman sadece kaldırmakbiyogüvenlik kabini içinde s. </li><li> Çalkalanarak karıştırılır (bundan sonra taze kültür ortamı olarak da adlandırılır) yavaşça 30 ml kültür için 26 Orta A ml ve orta B 3 ml (final kültürü% 10) geri çekilmesi ve 125 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içine aktarın kültürü ve. </li><li> Buz üzerine kültür odasına taşımak -80 ° C&#39;de donduruldu HEK293F hücreleri içeren hücre aktarılarak, bir şişe. Not: HEK293F hücreleri 1 x 10 7 hücre / ml bir yoğunlukta temin edilmektedir. </li><li> (Yaklaşık bir dakika sürer ve hücreler tamamen çözülmüş edilmemelidir) kısmen hücreleri Çözülme 37 ° C&#39;de su banyosunda hafifçe ısıtın flakon. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile flakon dışında sterilize ve biyogüvenlik kabini içine taşıyın. </li><li> 1 ml bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonu (yaklaşık olarak 0.7 mi) geri çekilmesi ve taze kültür ortamı 29 ml içeren 125 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içine aktarın. Kültür şişesi kapağını kapatın ve kuluçkaya çalkalayıcı içine taşıyın. </li></ol&gt; </li><li> Hücre Bakım: Hücre Yoğunluğu, Canlılık ve Hücre Passages Kontrol <ol><li> Aşağıdaki protokolü takip ederek kültür çözülme 24 saat sonra hücrelerin yoğunluğu kontrol ediniz. Not: Hücreler,&gt;% 80 temel hücre büyümesini ve canlılığını sağlamak için çözündürüldükten sonra 24 saat için büyütülmüştür. </li><li> Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile kültür şişesi sterilize ve biyogüvenlik kabini içine taşıyın. </li><li> 1 ml pipet ve pipet kullanarak yavaşça steril bir 0.5 mi Eppendorf tüpüne süspansiyon kültürünün ve transfer 100 ul çıkarın. Kapatın ve mümkün olduğunca çabuk çalkalayıcı geri kültür şişesi aktarın. </li><li> Hücrelerin 7.5 ul bir Tripan Mavisi Çözüm 7.5 ul karıştırın. Hücre / Trypan mavi karışımı 7.5 ul şiddetle karıştırın ve sayma slayt aktarın. </li><li> Otomatik hücre sayacı açın ve yükleme odasına sayma slayt yerleştirin. Otomatik okuyucu devreye girer ve hücreler birimlerinde otomatik sayılırml yüzde canlılığı başına hücre sayısı </li><li> 0.3 x 10 6 canlı hücre / ml hücre yoğunluğunda taze kültür ortamına transfer için gerekli olan donör kültür hacminin belirlenmesi. Not: Yardımcı Malzemeler örnek bir hesaplama bakın. </li><li> Adımları tekrarlayın 1.1.2 ve üstü &quot;1,1 Kültür Aşılama&quot; protokol 1.1.3 taze kültür ortamı için gerekli malzemeleri hazırlamak. </li><li> Taze 125 ml kültür şişesine Orta A (23 mi) ve orta B (3 mi) aktarın. Biyogüvenlik kabini gelen Orta A ve B Orta stok şişeleri çıkarın. Not: Ortam şişelerin Stoklar HEK 293F hücreleri ile aynı anda biyo-güvenlik kabini tutulmamalıdır. Bu stok ortam şişeleri kirletici olasılığını sınırlamaktadır. </li><li> Inkübatör HEK293 hücre kültürü çıkarın ve su çözeltisi içinde% 70 etanol ile püskürtülür. (4 ml hücre kısım çekilme, yeni bir pipet kullanarak, bu hacim göre t belirlendio kültürden adım 1.2.6) ve taze kültür ortamı içeren şişeye aktarın. </li><li> 1.1.1 göre ayarlanır inkübatör çalkalayıcı ile biyogüvenlik kabini kültürleri hem aktarın. 2-3 x 10 6 canlı hücre / ml&#39;lik bir yoğunluğa, yaklaşık hücreleri büyütün. Not: Hücrelerin yaklaşık iki katına süresi 32 saattir. Bu yoğunluğa ulaşması 3-4 gün sürer. İlk transfeksiyon öncesinde hücrelerin istikrarlı büyüme modeline sahip 3-4 geçişleri için inkübe hücreleri. </li></ol></li></ol> 2. Transfeksiyonu için malzemeler hazırlayın <ol><li> HEK293 Hücreler hazırlanması (Gün 1) <ol><li> Transfeksiyondan önce taze Ortam Maddesi B 24 hr 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunluğa Alt kültür hücreleri, 1.2 Adım göre yöntem. Not: transfeksiyon kültür hacmi hücre sayısına bağlı olacaktır. Büyük transfeksiyon hacimleri (&gt; 20 ml) bu aşamada kültürün daha büyük bir hacim gerektirir. </li></ol></li><li> St HazırlamaMalzemelerin ocks <ol><li> 25 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) ve 150 mM NaCI (pH 7.5) ihtiva eden bir tampon maddesi içinde 1 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, doğrusal polietilenimin (PEI) bir stok çözelti hazırlayın. Tamamen PEI çözülür; Bu oda sıcaklığında 30-60 dakika sürebilir. Uzun süreli kullanım için -20 ° C&#39;de 0.22 mcM şırınga filtresi ve mağaza üzerinden sterilize edin. </li><li> (2.2.2.1-2.2.2.4 adımlara göre) steril plazmid DNA hazırlayın. Plazmid inşaat prosedürü başka 42 tarif edilmiştir. DNA hazırlığı için kısa bir prosedür burada açıklanmıştır: <ol><li> LB ortamı (Tryptone- 10 g / L, çekilmifl, 5 g / L ve sodyum, klorid 10 g / L maya) ile takviye edilmiş 100 ug / 1 L pGEn2 vektörü ile transforme edilmiş, kimyasal olarak-kompetan Escherichia coli hücrelerinin bir kültürü büyütün ml ampisilin. E. E. coli olmayan bir nemlendirilmiş, çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de yetiştirilir. </li><li> Boya üretimi uygun pGEn2 kodlayan vektörün hedef plazmid DNA saflaştınlırfacturer DNA&#39;sı arıtma protokolü. </li><li> Plazmid DNA sonra tam steriliteden emin olmak için biyo-güvenlik kabini içinde DNA ekstraksiyon prosedürleri nihai izopropanol çökelme ve yeniden süspansiyon haline getirme adımlarını gerçekleştirmek. </li><li> 10.000 x elüt DNA ve santrifüj (plazmit hazırlama teçhizatı belirtilen) izopropanol hacmi ekleme 10 dakika boyunca örn. Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile, DNA kabın dışında sterilize ve biyo-güvenlik kabini içine aktarın. Bir pipet kullanarak izopropanol süpernatant atın DNA pelet hava-kurulayın. Kuruduktan sonra, steril bir 10 mM Tris tamponu, pH 8.0 içinde pelletini. </li></ol></li><li> Su içinde 220 mM valproik (VPA) asidin bir stok çözelti hazırlayın ve steril bir 0.22 mikron filtre içinden geçirilerek sterilize edilir. Sonraki kullanıma kadar -20 ° C&#39;de çözelti saklayın. </li></ol></li></ol> 3. Bir geçici transfeksiyon oluşturulması <ol><li> Transfeksiyon (Gün 0) <ol><li> Yukarıdaki &quot;1.2. Hücre Bakım&quot; 1.2.5 arasındaki adımları 1.2.2 izleyerek hücre yoğunluğunu kontrol edin. Transfeksiyon (canlılık&gt;% 95 2.5-3.0 x 10 6 canlı hücre / ml), hücrelerin miktarının belirlenmesi. Yardımcı Malzeme örnek bir hesaplama bakın. </li><li> Steril bir serolojik bir pipet kullanarak 250 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne önceki basamakta (burada 67 mi) içinde hesaplanan süspansiyon kültür hücreleri, hacim aktarın. 100 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ile hücreler toplanır. </li><li> Bu arada, taze transfeksiyon kültür ortamı yukarıdaki &quot;1.1. Kültür Aşılama&quot; na göre adım 1.1.3 Aşağıdaki hazırlar. Bir örnek hesaplaması için Ek Malzemeleri bakın. Ayrıca, steril bir 15 ml tüp taze kültür ortamı transfer 5 mi kenara ayırın. </li><li> Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile tüplerin dışında sterilizasyon ve th dekante için steril bir pipet kullanın sonra biyo-güvenlik kabinine pelet hücreleri ihtiva eden ve transfer tüplerikültür aracı kapsayan e yüzer. </li><li> Kuvvetlice yukarı pipetleme ve taze kültür ortamına ve taze transfeksiyon kültür ortamı ile şişeye transfer 10 ml kullanarak aşağı pelet hücreleri tekrar süspansiyon (yukarıdaki adım 3.1.3 hazırlanmış). Bacalı hücre kültürü şişesi kapağını kapatın ve sallama ile 15 dk-1 saat (1.1.1 ayarlandığı gibi) inkübatör şişeyi taşıyın. </li><li> Bu süre boyunca, plazmid DNA ve 0.5 ug / ul nihai konsantrasyona kadar (yukarıdaki adım 3.1.3 çekilen 5 mi hacmi kullanılarak) taze kültür ortamı kullanılarak PEI stokları seyreltin. Yardımcı Malzeme örnek hesaplamalar DNA ve PEI miktarını belirlemek için bkz. Biyogüvenlik kabini içine dağılmış hücreleri ile kültür şişesi aktarın. </li><li> Mikro-pipet kullanılarak kültür plazmid DNA (0.5 ug / ul 300 ul) ilave edilir ve yumuşak el çalkalanarak karıştırılır. PEI kültürüne (0.5 ug / ul 900 ul) ekleyin, hafifçe sallayarak karıştırın. Taze cul 3.8 ml ekleyin24 saat süre ile kuluçka çalkalayıcı yukarıdaki aşama 3.1.3, ve transfer şişeden Ture ortam. </li><li> Adım 1.1 göre biyogüvenlik kabini temizleyin. </li></ol></li><li> (50 ml transfeksiyon hacmi için) seyreltme (Gün 1) <ol><li> 24 saat süre ile transfekte kültürü inkübe edin. </li><li> 1 ml steril bir pipet kullanılarak serolojik ve steril bir 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer (2.2.3 aşamasına göre hazırlandı. VPA) önceden ısıtılmış 220 mM Valproik asit 1 ml çekin. </li><li> 5,0 önceden ısıtılmış Orta B ml önceden ısıtılmış ve orta A 44 ml çekin ve VPA 4,4 mM&#39;lik bir son konsantrasyona sahip taze kültür ortamı 50 ml hazırlamak için, steril bir serolojik bir pipet kullanarak VPA çözeltisine Bu ekleyin. </li><li> Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile balonun dış sterilize sonra biyogüvenlik kabini transfekte kültür taşı hazırlanan seyreltme orta ekleyebilir ve kuluçkaya karıştırıcısı geri şişeyi aktarın. </li></ol></li><li> İfade ve Hasat (Gün 2-6) <ol><li> (5-6 gün transfeksiyondan beri toplam) ilave 4-5 gün boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Adım 1.2.2 Aşağıdaki kültür ortamının hacimde çekin. 1.2.5 için. SDS-PAGE ile her gün protein ifadesini analiz etmek için alikotları hücreleri canlılığını izlemek ve kaydetmek için, 1 ml steril bir serolojik pipet kullanarak yukarıdaki &quot;, 1.2. Hücre Bakım&quot; bölümünde anlatılan (aşağıda Bölüm 5). </li><li> 5 dakika boyunca 1000 g&#39;de pil, orta santrifüjle 5-6 gün sonra hasat hücreleri. Hücre canlılığı% 50&#39;nin altına (adımlara bakın 1.2.2-1.2.5) düşerse Ayrıca, süpernatant hasat. </li><li> Salgılanan protein içerecek Süpernatantı dökün. HEK hücre pelet% 10 çamaşır suyu 5 ml ekleyin ve biyolojik tehlike olarak atın. </li></ol></li></ol> 4. Protein Saflaştırma <ol><li> Protein-A sefaroz ve 5 ml olan bir kolon hazırlanmıştır. Tampon A (20 mM 3- (5 kolon hacmi ile sütun dengeye N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS) pH 7.4, 100 mM NACl). </li><li> Kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için yüksek hızda (10 dakika boyunca 14000 g) sonra ifade edilmiş protein toplanan süpernatant santrifüjleyin. Yeni bir tüpe içine dekante edilerek toplanır. Biyolojik tehlike olarak pelet atın. </li><li> Süpernatan 10 ul tablet toplamak ve buna ek olarak, SDS-PAGE ile analiz örnek için her bir protein saflaştırma adımında küçük numune toplamak (Kısım 5 tarif edilmiştir). Açıklık süpernatant yükleyin ve akışını toplamak. </li><li> Tampon A 3-kolon hacminde sütun yıkanır ve 100 mM glisin, pH 3.0, 5-kolon hacminde proteinini ayrıştırmak. Hızla pH&#39;ını nötrleştirmek üzere bir buçuk 1 M TRIS tampon hacmi, 8.0 pH içeren tüplerde eluat toplayın. </li><li> Ileride kullanmak üzere tampon A ve mağaza 10 kolon hacmi ile sütun yıkayın. </li><li> Tampon A ile 10 kDa molekül ağırlıklı bir kesim santrifüjlü filtre tampon, en az bir 10-kat fazla ile elüt protein değişimi. Not: yıkanarak örneği konsantre etmeyinçok düşük hacimli elüt tampon maddesi içinde (&lt;2 mi) eklendi. Tampon A ile tampon değişimi santrifüj filtreleri kullanın </li><li> Mağaza bir sonraki kullanıma kadar 4 ° C &#39;de bir protein saflaştırıldı. Not: süpematan içinde ifade edilen protein, proteinin özellikleri temelinde veya afinite etiketleri kullanılarak seçilen afinite sütunu ile saflaştırılabilir. Tipik bir saflaştırma işlemi için, Protein A kolonu, bir poli-histidin etiketi ile eksprese edilen proteinler için kullanılabilir IgG Fc fragmanları veya veya nikel kolonu kullanılabilir. Burada, bir protein A kolonu IgG1-Fc saflaştırma aşamalarının bir açıklamasıdır. </li></ol> SDS-PAGE ile Proteininin Analizi 5. <ol><li> 2x yükleme tamponu (0.125 M Tris, pH 8.0,% 4 SDS,% 10 β-merkaptoetanol,% 20 gliserol ve% 0.01 bromofenol mavisi) eşit hacmi ile her bir numunenin alikotları (7.5 ul) ile seyreltilir. </li><li> Bir ısıtma bloğu ya da su banyosu kullanılarak 5 dakika boyunca 90 ° C&#39;de karışım kaynatılır. 10.000 g fo numuneler santrifüjr, 1 dak. Işaretleyici protein 5 ul ve atılabilir bir ucu olan bir 20 ul pipet kullanarak analizler için numune 14 ul hazırlanan jel yükleyin. </li><li> 60 dakika boyunca 25 miliamperde bir jel çalıştırın. Elektroforez adımı tamamlandıktan sonra, 5 dakika süre ile, su ve mikrodalga 1 L bir kaba jel aktarın. </li><li> Su içinde boyama çözeltisi (% 40 etanol,% 10 asetik asit ve% 0.1 Coomassie parlak mavi) 2 saat süre ile ve destain ile jel leke. </li></ol> Kütle Spektrometresi 6. glukanlardır Analizi <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 44 glikanlar analiz edin. Kısaca, IgG1-Fc bölgesinin 75 ug daha sonra glıkanların 45 serbest bırakılması için PNGaseF tedavi, tripsinize edilmiştir. Çıkış glıkanlar permetilatlı ve matris-yardımlı lazer dezorpsiyon iyonizasyon time-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOFMS) kullanılarak analiz edildi. </li></ol> Özel Senaryolar 7. Protokol Düzeltmeler <ol><li> 15 N- Proteinler Etiketleme(50 ml transfeksiyon hacmi) Amino Asitler etiketli <ol><li> Tek bir steril cam şişe içine, her bir amino asidin 5 mg koyun. Su otoklavlanır 4 ml (tamamen Lys ve Phe&#39;den aksine, çözünür değildir Tyr unutmayın) ile süspanse edin. 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklavda tutarak çözelti sterilize edin. Çözelti 50-60 ° C&#39;ye, yaklaşık soğumaya bırakın. </li><li> 50 ml&#39;lik transfeksiyon hacmi için, &quot;3,1 geçici transfeksiyon Kurulması&quot; na göre adım 3.1.3 izleyin. Uygun hacimli bir örnek için ek malzemeler bölümüne bakın. </li><li> Transfeksiyon için, yukarıda hazırlanmış olarak etiketlenmiş amino asit kalıntısı ile sübstitüe edilmiş taze kültür ortamı kullanılarak &quot;3. geçici transfeksiyon Kurulması&quot;, aşağıdaki aşamaları takip edin. </li><li> Transfeksiyondan 24 saat sonra, kültür seyreltme gününde, önceden ısıtılmış Orta B 5.0 mi, önceden ısıtılmış Orta A 40 ml ve amino asit karışımı taze otoklavlanmış 4 ml lik bir geri (adım 7.1.1 gibi hazırlanmıştır. Yukarıda) ve 1 ekleyinmi VPA 4,4 mM&#39;lik bir son konsantrasyona sahip taze bir kültür ortamı sulandırma 50 ml hazırlamak için, VPA çözeltisi stok solüsyonu önceden ısıtılmış. Steril bir pipet kullanılarak transfeksiyon serolojik kültürü için bu orta ekleyin. </li><li> Su çözeltisi içinde% 70 etanol ile balonun dış sterilize sonra biyogüvenlik kabini transfekte kültürü aktarın hazırlanan seyreltme orta ekleyebilir ve kuluçkaya karıştırıcısı geri şişeyi aktarın. Not: Orta bir kimyasal olarak tanımlanmış, serumsuz bir ortamdır. Bu nedenle, farklı bir formülasyonu hazırlamak mümkündür. Belirli amino asitler yoksun özel bir Orta A hazırlık edinmek için satıcınızla görüşün. Ancak, biz tam bir ayrılma orta takviyesi sonrası ozmolaritenin ayarlanmasını gerektirir çünkü yalnızca birkaç seçme artıkları yoksun orta kullanmayı tercih tüm amino asitler dışarı sol olması mümkündür. Biz takviye edilebilir ve osmolarite ayarlaması gerektirmez Lys-Tyr-Phe bırakma orta seçti. Furthermore, Orta serbestçe orta bileşenlerin konsantrasyonları paylaşmak olmayan bir tedarikçisi; başarı ile Lys, Tyr ve Phe&#39;den için 100 mg / L, her kullanılır. Transfeksiyonu ve sentezleme ortamı hacimleri eklenmiş amino asitler için hesap ayarlanmalıdır. İşte izotop etiketleme için yukarıdaki protokole ayarlamalar vardır </li></ol></li><li> Küçük molekül ile Transfeksiyon Ek <ol><li> Otoklavlanmış su kullanılarak 2-deoksi-2-floro-l-fukoz 100 mM stok çözelti hazırlayın ve 0.22 uM filtre kullanılarak bu çözüm sterilize edin. </li><li> 50 ml&#39;lik bir kültür için transfeksiyonu ve seyreltme ortamı fukoz analog çözeltisi (250 uM) 125 ul ilave edin. Not: toplam kültür hacmi! Ashton sadece% 0.25 için bu konsantrasyon hesapları ornatığına ekleyerek glikan işleme küçük molekül inhibitörleri kullanarak ifadeyi değiştirmek mümkündür, çünkü başka ses ayarı yapmak için ihmal. Burada 2-deoksi-da dahil olmak üzere koşullarını tarif2-floro-l-fukoz, glıkan fukosilasyonu bir inhibitörü. Bu transfeksiyon seyreltme ortamı içinde 250 uM bir konsantrasyonda fukoz analog ekleyerek fukosilasyonu olarak&gt;% 90 azalma bulmuşlardır. </li></ol></li></ol>

All authors declare no competing financial interests in this manuscript.

Bu protokol, HEK293F veya S hücrelerinin kısa süreli transfection ile protein ifadesini gösterir. Barb ve Moremen laboratuarlarında kurulan optimum transfeksiyon koşulları yüksek verim elde etmek için transfeksiyon hücre yoğunluğu ve reaktif konsantrasyonları kritik bir kombinasyonunu kullanır. Bu protokolü uygulayan Kritik hususlar şunlardır: (tutarlı kültür süreleri katlama) ile transfeksiyon öncesinde istikrarlı bir kültür muhafaza etmek; % 95&#39;den daha büyük hücre yaşayabilirliği ile...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Yapı ve fonksiyonunun ayrıntılı analizi için uygun katlanmış ve translasyon sonrası değiştirilmiş insan proteinlerinin yüksek verim üreten önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Ekspresyon sistemleri çok sayıda yerel benzeri fonksiyonu ve davranışı ile yeniden birleştirici proteinlerin üretmek mevcuttur. Maya, bitki, böcek ve memeli sistemleri, aynı zamanda 1-4 tarif olsa Bakteriyel ekspresyon sistemleri, esas olarak, Escherichia coli suşu, bağlı, bu sentezleme sistemlerinden basitliği, araştırma alanında en kolay ve yaygın olarak kullanılan araçlar temsil etmektedir. Bununla birlikte, bu sistemler büyük çoğunluğu hedef proteinlerin uygun post-translasyonel modifikasyon, Ulus. Barb ve Moremen laboratuvarlarının temel bir ilgi uygun glikosilasyona ile ökaryotik proteinleri üretiyor. Birçok insan proteinleri (5 bakınız) düzgün işlev için uygun glikozilasyonu gerektirir. Ökaryotglikosilasyon makineleri yaygın ve her iki asparagin (N) de dahil olmak üzere, modifikasyon bir yelpazede yapma yeteneğine sahiptir - ve serin / treonin (O) kompleksi glikanları 6 -bağlı. İnsan proteinlerinin&gt;% 50 7, N-glikosile olduğu tahmin edilmektedir. Glıkanlar birkaç isim faktör IX gibi terapötik monoklonal antikorlar, eritropoietin ve kan pıhtılaşma faktörleri gibi birçok proteinin temel bileşenleri vardır. Birden çok yöntem uygun N-glikosile proteinlerin hazırlamak için var ve 8-10 tamamen sentetik aralığı olsa da, en sağlam olması şaşırtıcı insan ifade sistemleri bugüne kadar kanıtlanmış değil mühendislik rekombinant sistemlerinden 15-20, 11-14 den veya kurtarma chemoenzymatic için insan proteinlerini üretmek için yöntemler. Bir çok tedavi edici insan glikoproteinleri, memeli hücreleri kullanılarak yeniden birleştirici sistemlerde üretilmektedir. Not sistemleri Çin Hamster Yumurtalık (CHO), fare miyelom (ns0), bebek hamster Kidne olany (BHK), insan embriyonik böbrek (HEK-293), ve protein üretimi 4,21,22, yapıştırma veya süspansiyon kültürü içinde kullanıldığında insan retinal hücre çizgileri. Ancak, memeli protein ekspresyon sistemleri Kararlı hücre çizgileri, pahalı bir büyüme ortamı ve alt-tabaka destekli transfeksiyon prosedürleri 23 nesil gerektirmiştir. Memeli hücre transfeksiyonu, kalsiyum fosfat 24,25, katiyonik polimerler (DEAE-dekstran, polibren, polilisin, polyethylimine (PEI)) ya da pozitif yüklü katyonik lipozomlar 26-29 dahil olmak üzere sayısız maddelerin yardımı ile elde edilmektedir. PEI, bir polikatyonik yüklü, doğrusal ya da DNA ile kararlı bir kompleks oluşturur ve endositoz dallı bir polimer (25 kDa) 26 dır. Endozomun asitleştirme üzerine, PEI sitoplazma 26,30 içine endozomlarda DNA salım yırtılmasına yol şişmeye düşünülmektedir. Suspensi yakın zamana kadar, geçici transfeksiyonkültürü, hücre kültürü 29 ek olarak, ardından önceden DNA / PEI kompleks formasyon ile gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, Würm ve çalışma arkadaşları, in situ 31,32 bir DNA / PEI kompleks oluşturduğu HEK293 hücrelerinde rekombinant protein üretim için optimize edilmiş bir yüksek verimli bir protokol bildirilmiştir. Bu kültür ortamı içine hazırlanmasını, kompleks sterilizasyon ve tamponu değiştirmek kaçınılmalıdır. Önemli verim artışları 33 neden ifade arttırıcı plazmidler dahil ederek daha ileri optimizasyon. Burada, bu ilerlemelere üzerine inşa ve geniş çapta uygulanabilir bir yöntemdir. İfade koşulları da N-glikan bileşimin etkisi için değiştirilebilir. Bir ara aşamasında N-glikan işlem durur bir gen silme ile HEK293S hücre çizgisi, (GIcNAc 2 Adam 5) 34 2, N-asetilglukozamin bakiyelerine artı beş mannoz kalıntılarının oluşturduğu homojen N-glikanların proteinlerin ekspresyonuna yol açar 35. Bu hücreler,N-asetilglukosaminiltransferaz I transferaz (GntI) alt N-glikan işleme 36,37 için gerekli olan geni içermezler. Kifunensine, sialik asit analoglarının ve fukoz analog ve 2-deoksi-2-floro-fukoz içeren glıkosıltransferaz inhibitörlerinin kullanımı benzer etkiler ve N-glikan işlem 38-41 sınırları vardır. Protokol Burada bildirilen, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi 42,43 pGEn2 vektörü kullanır PEI yardımıyla geçici memeli hücreleri çizgileri (HEK293F ya HEK293S hücreleri) transfeksiyon, ve uygun bir şekilde glikosile protein, yüksek verimlerle geri kazanılması. Bu sistem, sağlamdır ve rekombinant proteinlerin büyük titrelerinin üretimi için izotop işaretleme ve glikan mühendisliği de dahil olmak üzere çeşitli faktörler barındırabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet&#160;</td>
			<td>NuAire, Inc.</td>
			<td>CellGard ES NU-S475-400</td>
			<td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation shaker</td>
			<td>INFORS HT</td>
			<td></td>
			<td>Multitron Cell&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium B: ExCell 293 Serum-Free Medium&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>14571C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeStyle HEK 293F Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml Disposable serological pipette</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (Pipet-Aid XP)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>161263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting slides&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>23966</td>
			<td>Prepare stock solution at a concentration of 1 mg/ml in a buffer containing 25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and 150 mM NaCl (pH 7.5). Dissolve PEI completely; sterilize through 0.22 &#956;M syringe filter and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>EMD Chemicals Inc.</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Syringe Filter, 0.22 &#956;M</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisaminomethane (Tris base)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XL1-Blue</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>222249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP1421-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Analytical&#160;</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH chemicals</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic (VPA)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4543</td>
			<td>Prepare stock solution of 220 mM&#160; in water, sterilize by passage through a sterile 0.22 mm filter and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#63720; 250 mL Centrifuge Tube&#160;</td>
			<td>Corning Incorporated/Life Sciences</td>
			<td>430776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EW-17707-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A-Sepharose column</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>BP381-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 kDa molecular weight cut-off Amicon&#174; Ultra centrifugal filters&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial&#160;</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coomassie brilliant blue&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>161-0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Tyrosine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>332151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N labeled L-Lysine</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>592900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlabeled L-Phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C6-Glucose</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-deoxy-2-fluoro-l-fucose&#160;</td>
			<td>SANTA CRUZ Biotechnology</td>
			<td>sc-283123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension

Karmaşık post-translasyonel modifikasyonlar ile rekombinant proteinlerin üretilmesi teknolojisi yapı ve fonksiyon çalışmaları için büyük bir sorun teşkil etmektedir. Geçici olarak transfekte memeli hücre dizilerinden hızla oluşturulması ve yüksek geri kazanım doğal ER ve Golgi dolayımlı salgılama yolundan kanalize proteinleri ifade için etkili bir vasıta, bu bariyer ele alan ve bir. Burada, insan HEK293F ve yüksek protein verimine için tasarlanmış bir memeli ifade vektörü ile transfekte edilmiş HEK293S hücre çizgileri kullanılarak protein ifadesi için tek bir protokoldür. Bu sistemin uygulanabilirliği kültürünün litresi başına geri kazanılan saflaştırılmış proteinin 95-120 mg arasında verimleri ile eksprese üç temsilci glikoproteinleri kullanılarak araştınlır. Bu proteinler, insan FcyRIIIA ve sıçan α2-6 sıyalıltransferaz, ST6GalI, hem bir N-terminal GFP füzyon ifade, hem de rekombinant insan immünoglobülin Fc G1 bulunmaktadır. Bu sağlam sistem utiizotopik olarak zenginleştirilmiş proteinler ve kütle spektrometrisi, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak yapı çalışmaları için de karbonhidrat ekspresyonu için uyarlanabilir bir serumsuz ortam lizes. Ayrıca, N-glıkan bileşimi verimi azaltır olmayan bir şekilde belirli bir glıkan değişiklikleri önlemek için küçük bir molekül eklenerek ayarlanabilir.

Üst düzey protein ekspresyonu ve saflık Bu optimize edilmiş ifade sistemi glikosile proteinlerin yüksek verimle üretilen. Tipik bir desen IgG1-Fc (Şekil 1) ifadesi gösterilir. Bu durumda, gün 0, ham bir ortam içinde çözülebilen sentezleme fraksiyonu kullanılarak analiz edilir 5. günde protein ekspresyonu kadar Gün 1 (seyreltme) eklenmiştir transfeksiyon gün ve daha sonra, kültür gündür. K...

Watch this Scientific Journal Video about High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension at JoVE.com

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

high-yield-expression-recombinant-human-proteins-with-transient

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K Görüntüleme.  Iowa State University. Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Video: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

Toz numuneler mutlak Kuantum Verimi Ölçümü

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Farelerde Hidrodinamik Gen Taşıyıcı Proteinlerin Geçici İfadesi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler