We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

Bu deneyler için kullanılan tüm insan dokuları Chicago&#39;daki Illinois Üniversitesi&#39;nde Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylı protokol ve / veya muafiyet yoluyla elde edildi. 1. Bölüm Taze Donmuş Prostat PEN-slayt üzerine ve Ücretli Cam Slide üzerine <ol><li> Bir gün önce veya bir kaç saat numune kesit önce, temiz araçlar (yani, fırça, forseps, coplins, bıçaklar, PEN-çerçeveli slaytlar (değilse zaten RNaz ücretsiz), bir ETOH güvenli işaretleyici ve bir kalem) ve iç Bir sprey şişesi ve laboratuar mendil kullanarak çözüm-dekontaminasyon RNaz RT Kriyostat. <ol><li> RNaz dekontaminasyon çözüm silerek önce 5 dakika boyunca oturup çözüm ve (depcH 2 0 ile hazırlanan)% 70 EtOH ile son durulama RNaz-dekontaminasyon üzerinde sol kaldırmak için depcH 2 0 ile durulayın izin verin. Not: Bir RNaz ücretsiz çalışma alanı korumak için şarttır. Tüm coplins, araçlar, dondurulmuş montaj orta, bıçaklar ve kullanılan slaytlar RNaz ücretsiz iş için yalnızca kullanılmalıdırve standart bir olmayan RNaz ortamda hiç kullanmadım. Tüm enstrümanlar her deneyden önce bir Rnase dekontaminasyon solüsyonu ile tedavi edilmelidir. </li></ol></li><li> -24 ° C&#39;ye soğutun kriyostat. </li><li> Önce Kesit en az 30 dakika soğumasını kriyostat içinde aşağıdaki temizlenmiş RNaz ücretsiz araçlar yerleştirin: slayt coplin dolu% 100 etanol, araçlar, küçük dondurulmuş doku kaset ve montaj mandren ile. </li><li> Taşınması için bir kuru buz dolu bir köpük halinde dondurulup ve kova yere donmuş prostat dokusunu al. En az 30 dakika boyunca sıcaklık kriyostat denge sağlaması için kriyostat halinde doku yerleştirin. Not: lazer yakalama mikro diseksiyon İnsan prostat dokuları taze dondurulmuş veya da olabilir parafine gömülü (FFPE) formalin ile fikse. Zaman kısıtlamaları ve slayt hazırlama doku kaynakları arasında biraz farklıdır. Burada donmuş kesitler için adımları açıklar. </li><li> Bir seferde bir doku ile Çalışma ve botto içine donmuş montaj orta fışkırtmaKasetin m ve hızlı bir şekilde soğutulmuş forseps kullanılarak dondurulmuş montaj ortama donmuş prostat dokusunu monte edin. </li><li> Dondurulmuş montaj orta ayarlamak için 5 dakika süreyle kriyostat içinde soğutucu üzerine doku ile kaseti yerleştirin. </li><li> Chuck üzerine dondurulmuş montaj orta küçük bir miktar Squirt ve dikkatle dondurulmuş montaj ortamına kadar monte doku alt tarafı basın. 5 dk dondurulmuş montaj orta tamamen katılaşmaya izin vermek için kriyostat ayarlanır edelim. </li><li> Tutucu içine aynasını yerleştirin ve sıkın. </li><li> Kilitli pozisyonda kolu kilitleyin ve kriyostat üzerine yeni bir bıçak yerleştirin. Amplifikasyon aşamasını içerir aşağı moleküler uç noktaları için (yani, qPCR) bu bulaşmayı önlemek (veya sonraki numune için bıçak alanı kullanabilirsiniz üzerinde bıçağı taşımak) her hasta için yeni bir bıçak kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Kolu kilidini ve dikkatle eşitlemek için elle veya bir ayak pedalı ile doku ilerlemek ve 50 mikron ile doku maruzistenen doku maruz kadar m bölümleri ulaşılır. </li><li> 5 um Kriyostat ayarlayın, bir veya iki bölümleri kesmek ve hematoksilen ve eozin (H &amp; E) boyama için ücret cam slayt üzerine yerleştirin (Adım 2). </li><li> Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt yerleştirin. </li><li> Etanol tahsil cam slayt çıkarın ve H &amp; E boyama (Adım 2) geçmeden önce oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Bir çerçeve destekçisi RT PEN-çerçeve slayt yerleştirin. </li><li> RT PEN çerçeve slaytlar üzerine 10 mikron ve yer bölümlerine Kriyostat ayarlayın. Bir dört bölümler doku büyüklüğüne bağlı olarak her bir slayt üzerine bir yer olabilir. </li><li> Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt dalma. </li><li> Etanol PEN-frame slaytları çıkarın ve LCM için hazır olana kadar -80 ° C derin dondurucuda bir desiccator kutusunda bir slayt kutusuna slayt saklayın. Üç gün Optimal RNA kurtarma için maksimum depolama süresidir. </li><li> Tahsil cam kaydırdı SADECE Adım 2 ile devam edine. PEN-frame slayt için Adım 3 ile devam edin. </li></ol> 2. Hematoksilen Eozin ve-Y (H &amp; E) histolojik Mark-up için Leke Not: Bu yüklü cam slayt doku ve DEĞİL LCM PEN-çerçeve slayt için eğer. <ol><li> Aşağıdaki gibi derecelendirilmiştir etanol ile slayt daldırma yüklü cam slayt bölümleri hidrat: 3 dakika için iki% 70 etanol içinde bir kez 3 dakika boyunca, 3 dakika süre ile kayıcı% 95 etanol içinde iki kez% 100 etanol içinde iki kez daldırma 3 dakika boyunca damıtılmış H 2 O zamanlar. <ol><li> 99 ml% 70 etanol + 1 mi% 1 HCI ve% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi: 100 ml içinde 0.1 g sodyum bikarbonat damıtılmış H2O asidi alkolü çözeltisi hazırlayın </li></ol></li><li> 5 dakika boyunca hematoksilin Gill II (% 0.4) slayt batırın. </li><li> 3 dakika sürekli çalışan musluk H 2 O aşırı leke yıkayın. </li><li> Kayıcı asit alkol 10 kez batırın </li><li> 3 dakika boyunca musluk H 2 O çalışan slayt yıkayın. </li><li> Slayt Dip% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi içinde 30-60 sn mavi mor renge dönüşür için. </li><li> 3 dakika boyunca musluk H 2 O çalışan slayt yıkayın. </li><li> 10 dips% 95 etanol içinde slayt durulayın. </li><li> 15 saniye toplam Eozin-Y 2-3 kez slayt batırın. </li><li> Aşağıdaki gibi kademeli etanol ile slayt dehydrate: Ksilen slayt% 95 etanol içinde iki kez,% 100 etanol içinde iki kez ve iki kez daldırma (doku kapsamlı dehidratasyon gösterir açıkça göründüğünden emin olun). </li><li> Sulu olmayan kalıcı sabit montaj orta ve kapak kayma ile slayt monte edin. </li><li> 30 dakika boyunca slayt kurumasını bekleyin. </li><li> Herhangi bir tam slayt tarayıcı ile tarama slayt ve 8 &quot;x 11&quot; kağıt üzerine bir büyük, yüksek çözünürlüklü görüntü yazdırmak. </li><li> Ilgi Anahat alanları işaretleyici ile (genellikle bir kurul onaylı patolog tarafından yapılır). Bu biçimlendirme LCM prosedürü için kılavuzdur. </li></ol> PEN-frame Slaytlar 3. Toluidine Mavi Boyama Not: ThLCM olarak AYNI GÜN yapılır edilir. Tüm çözümler için depcH 2 O su kullanın. RNaz ücretsiz alan tüm adımları tamamlayın. Tüm coplins RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenmelidir. <ol><li> LCM gün 2 dakika süreyle daha sonra 2 dakika süreyle% 90 EtOH içine yavaşça daldırma slaytlar tarafından% 75 EtOH -80 ° C derin dondurucuda ve hidrat gelen PEN-frame slaytları çıkarın. <ol><li> Daha sonra oda sıcaklığında 0.2 um&#39;lik bir filtreden ve mağaza sterilize filtre moleküler biyoloji sınıfı su içinde eritilmesi ile% 0.5 toluidin mavisi hazırlayın. Bu çözelti, en fazla 6 ay süreyle yeniden kullanılabilmektedir. Not: Bu son derece öncesinde filtrasyon birkaç saat sürebilir olarak solüsyonu hazırlamak için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Yavaşça 5-30 saniye boyunca% 0.5 toluidin mavisi içine slaytlar batırarak prostat dokusunu Leke. Yıkama ile doku 3 dakika için 30 saniye için% 75 EtOH, ardından 15 saniye boyunca depcH 2 O 2 kez slaytlar destain. Not: Leke ve destain süreleri iyi boyama sağlamak için ayarlanabilir. Prostat leke üzerinde eğilimindedir. </li><li&gt; buz üzerinde RNAaz serbest kuru kaba PEN-kare slaytlar aktarın. </li></ol> 4. Lazer yakalama Mikro diseksiyon (LCM) <ol><li> LCM, 15 dakika boyunca 42 ° C &#39;de sıcak bir slayt kuru slayt hemen önce. Işlenmiş ve onlar için hazır olana kadar buz üzerinde kalan saklamak olacak Kuru, sadece slayt. </li><li> LCM ve bilgisayar bu sırada, mikroskop gücü, lazer tuşu, lazer anahtarı ve ardından bilgisayarı açın. Lazer Diseksiyon yazılımını başlatın. </li><li> Slaytlar ve toplama tüpleri yüklemek için mikroskop kontrol etmek için yazılımı kullanın. Daha sonra &quot;Devam&quot; butonuna tıklayınız, &quot;boşaltma numune tutucu&quot; üzerine tıklayın aşağı bakacak şekilde doku ile mikroskop lamı sahibinin üzerine bölümleri ile slayt yüklemek ve mikroskopta uygun yuvaya slayt tutucu takın. <ol><li> &quot;Boşaltma toplama tüpleri&quot;, etiketin üzerine tıklayın ve tüp tutucu üzerine 0.5 ml tüpler yüklemek ve enstrüman uygun yuvaya takın. bir Zamanlarkapaklar toplama kapaklar Lizis tampon 35 ul ekleyin ve kabarcıkları önlemek için deneyin, güvencesindedir. Daha sonra &quot;Tamam&quot; a tıklayın. Not: 25 ul lizis tamponu 10 ul depcH2O ile: buharlaşma bir sorun varsa, aşağıdaki gibi tampon sulandırmak. </li></ol></li><li> Yazılımda, slayt slayt tutucuya yerleştirildi konumu seçin. LCM numune toplamak için toplama kapağı seçin. </li><li> Görselleştirmek ve 10X de bilgisayar aracılığıyla slayt odaklanır. Ardından &quot;kalibre&quot; &quot;Laser&quot; seçerek lazer kalibre etmek için yazılımı kullanın. Lazer ışını tamamen ve verimli seçilen alanı kesmek için izin lazerin güç, diyafram ve hız, seçme &quot;lazer&quot;, sonra &quot;kontrol&quot; ayarlayın. Tamamen doku içinden lazer kesim kadar ayarlamalar tekrarlayın. </li><li> Bir kılavuz olarak 8 &quot;x 11&quot; patolog mark-up kullanarak, epithe istenilen alanlarını sınırlamak için &quot;şekil çizmek&quot; aracını kullanıngörünümünde Lium herhangi bir stroma toplama önlemek. Birden alanlar tek bir görünümde içinde seçilebilir, ancak &quot;şeklinde kesmek&quot; aracını tıklayarak ilk kesme olmadan başka görünüme hareket etmiyor: Not. <ol><li> Bir alan tamamen lazerle kesilmiş olsun yoksa manuel üzerine gitmek için &quot;hareket ve kesim&quot; aracını kullanın. Yeni görüşlere hedefi hareketli Devam ve slayt tamamen disseke edilir veya doku istenilen miktarda tahsil edilene kadar lazer kesim tekrarlayın (tipik olarak 100 huylu bezleri RNA 150-500 ng verim). (Şekil 1A örneğe bakın). </li></ol></li><li> Dikkatle kapaklar lizis tamponu ve doku dikkatli olmak, tahsilat sahibinin tüpleri kaldırmak ve kapaklarını kapatın. Kısaca tüpünün dibinde sıvı ve doku toplamak 30 sn için santrifüjlenir. RNA izolasyonu için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de 30 dakika ve mağaza 42 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Bir Fil ile 5. Toplam RNA izolasyonuter bazlı Takımı ve Kalite Analizleri <ol><li> Buz üzerinde tüpler dışarı çözülme ve 100 ul çözümün ses getirmek. </li><li> Filtrenin merkezine 30 ul ofLysis Çözüm uygulayarak RNA izolasyon kiti, mikro filtre önceden ıslak ve sonraki iki adımı (en azından 5 dakika) whileperforming bekletin. </li><li> Lizat (kitte sağlanan) LCM katkı maddesi çözeltisi 3 ul ilave edin ve 5 saniye için vorteks ile karıştırılır. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 30 saniye boyunca santrifüjleyin. </li><li> Sıvıyı çıkarmak için en yüksek hızda 30 saniye ~ için önceden ıslatılmış filtre santrifüj. </li><li> Yukarı ve aşağı yavaşça, lizat karışımına girdap ya da pipet% 100 etanol (bu durumda 129 ul) 1.25 hacimleri ekleyin. ** Bu yöntem, büyük ve küçük RNA türleri hem de kurtaracaktır. </li><li> 1 dk filtreye RNA bağlamak için 10.000 xg&#39;de önceden ıslatılmış mikro filtre üzerine numuneyi ve santrifüj yükleyin. Daha sonra yıkama solüsyonu 1, R &quot;, 180 ul mikro filtre yıkama21; 1 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj. Not: Tüm santrifüj bu nokta 13.000 xg veya maksimum hızda yapılmalıdır seçin. </li><li> Kit protokol tarafından yönlendirildiği gibi yıkayın sırasıyla &quot;Yıkama çözümlerinin 2 ve 3&quot; 180 ul ile iki kez filtre. Santrifüj bakiye akışkan maddeyi ortadan kaldırmak ve kurutun 30 sn için, daha sonra akış atmak ve 1 dakika boyunca filtreyi dönerler. </li><li> Yeni bir koleksiyon tüpüne filtreyi aktarın. </li><li> (Takım ile birlikte verilme), -95 ° C&#39;ye kadar sıcak Elüsyon çözeltisi. </li><li> Filtrenin merkezine önceden ısıtılmış yıkama çözeltisi 10 ul uygulayın, kapağını takın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca muhafaza edin. Daha sonra RNA elüte etmek için 1 dk için santrifüj ve ~ RNA 20 ul elde etmek için bu adımı bir kez tekrarlayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca DNaz I tedavi gerçekleştirin. </li><li> 260 nm&#39;de absorbans ile spektrofotometre ile RNA ölçmek. 260 nm ve 280 nm dalga boylarında optik yoğunluk oranı saflığını değerlendirmek için kullanılırRNA 15 (Tablo 1). </li></ol> 6. Gen İfadesi Analizi Not: (mRNA ve lncRNAs gibi) uzun bir RNA türünün gen ekspresyonunu Aşama 6.1 ve kısa RNA türünün (mikroRNA gibi) gösterilir aşama 6.2&#39;de gösterilmiştir. Farklı kitleri RT-qPCR için kullanılabilir ve gerekli RNA miktarı (10 ng kadar az) kiti göre değişir. RNA sekans analizi, 6.3 tarif edilmektedir. <ol><li> Arka uyarlamak (RT) 5 RT ana karışımı ul (RT tampon maddesi, dNTP&#39;ler, rastgele primerler, RT enziminin, RNaz inhibitörü) ile 20 ng 5 ul / RNA örnek ul karışım cDNA&#39;ya RNA&#39;nın. 37 ° C&#39;de, sonra 120 dakika 25 ° C&#39;de 25 dakika boyunca reaksiyon inkübe ve 85 ° C &#39;de 5 dak. </li><li> RNaz içermeyen su ile RT reaksiyonu 1:10 seyreltin ve ilgi genleri için primer ya da primer / prob setleri ile 10 ul qPCR reaksiyon başına 2.5 ul kullanın. Not: kısmen bozulmuş RNA analizini kolaylaştırmak için bu fo primerler kullanılması tavsiye edilirr kısa amplikonlar (az 100 bp) 16. (Tablo 2B) <ol><li> MicroRNA ifade analizi için RT usta karışımı 5 ul 2-10 ng 5 ul / RNA örnek ul karıştırılarak RT reaksiyonu çalıştırın. Not: her biri ticari olarak temin edilebilen PCR bazlı mikroRNA algılama teknolojisi, özel ve özel bir RT primerleri kullanılmasını gerektirir. </li></ol></li><li> Alternatif olarak veya RT-PCR ilave olarak, RNA farklı türler ölçmek için yeni nesil dizilimi (RNA seq veya küçük RNA seq) kullanın. Genellikle, bu prosedür (Tablo 3) RNA 500 ​​ng kullanımı ve üretimi ve tespit aracı ile gösterildiği gibi yöntemi gerçekleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Schauer, I. G., Rowley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+reactive+stroma+in+benign+prostatic+hyperplasia.">The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia.</a> Differentiation. 82, 200-210 (2011).</li><li>Peehl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cell+cultures+as+models+of+prostate+cancer+development.">Primary cell cultures as models of prostate cancer development.</a> Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).</li><li>McNeal, J. E., Haillot, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+spread+of+adenocarcinoma+in+the+prostate+as+related+to+cancer+volume.">Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume.</a> The Prostate. 49, 48-57 (2001).</li><li>Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+and+micro-RNA+expression+analysis+in+laser-capture+microdissected+prostate+biopsies:+valuable+tool+for+risk+assessment+and+prevention+trials.">mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials.</a> Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transcriptome+analysis+of+formalin-fixed+prostate+cancer+specimens+identifies+biomarkers+of+disease+recurrence.">Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence.</a> Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-coding+and+microRNA+biomarkers+of+recurrence+of+prostate+cancer+following+radical+prostatectomy.">Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy.</a> The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).</li><li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+vitamin+D+hydroxylases+and+inflammatory+genes+in+prostate+stroma+and+epithelium+by+1,25-dihydroxyvitamin+D+in+men+with+prostate+cancer+and+an+in+vitro.+model.">Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model.</a> The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).</li><li>Giangreco, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+microRNAs,+miR-100+and+-125b,+are+regulated+by+1,25-dihydroxyvitamin+D+in+primary+prostate+cells+and+in+patient+tissue.">Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue.</a> Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).</li><li>Mihelich, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-183-96-182+cluster+is+overexpressed+in+prostate+tissue+and+regulates+zinc+homeostasis+in+prostate+cells.">miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).</li><li>Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+RNA+integrity+in+a+homogeneous+population+of+mammary+epithelial+cells+isolated+by+Laser+Capture+Microdissection.">Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection.</a> BMC cell biology. 11, 95 (2010).</li><li>Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+prostate+cancer+epithelial+and+interstitial+stromal+cells+using+laser+capture+microdissection.">Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection.</a> BMC cancer. 10, 165 (2010).</li><li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+microRNA+profiling+of+prostate+carcinomas+with+increasing+tumor+stage+by+deep+sequencing.">Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing.</a> Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).</li><li>Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+siRNAs+and+noncoding+RNA-derived+small+RNAs+are+expressed+in+adult+mouse+hippocampus+and+are+up-regulated+in+olfactory+discrimination+training.">Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training.</a> Rna. 17, 166-181 (2011).</li><li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+analysis+of+microRNAs+in+prostate+cancer+by+next-generation+sequencing.">Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing.</a> The Prostate. 75, 500-516 (2015).</li><li>Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+six+RNA+extraction+methods+for+the+detection+of+classical+swine+fever+virus+by+real-time+and+conventional+reverse+transcription-PCR.">Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR.</a> Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).</li><li>Kong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+short+amplicons+in+FFPE-derived+long-chain+RNA.">Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA.</a> Scientific reports. 4, 7246 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

İnsan örneklerden gen ekspresyonu kalitesi veya uygun bir doku miktarı için değil, aynı zamanda, belirli bir doku numunesinde mevcut olan çeşitli histolojik kişiler için değil, sadece zor olabilir. Bu iyi huylu dokular büyük ölçüde stromal doku ve kanser alanlardır stroma yoksun olduğu prostat özellikle zordur. LCM, iki farklı hücre tipleri (Şekil 1A) daha doğru bir imza prostat stroma ve epitel RNA fiziksel olarak ayrılmasını kolaylaştırır. Macrodissection veya bütün doku...

Prostat bezi, öncelikle düz kas 1 oluşan Fibromusküler stroma ile çevrili glandüler asinüs düzenlenmiş salgı epitel oluşan heterojen bir dokudur. Bazal hücreler, salgı hücreleri, nöroendokrin hücre transit yükselterek hücre ve kök hücre 2: epitelial bölmesi, beş farklı ama organize hücre tiplerinin oluşur. Luminal epithelial hücrelerde ortaya çıkar, prostat kanseri (PCa) &#39;de, adenokarsinom büyüme stromal bölmesinde 3 arasında belirgin bir aşamalı bir düşüş olur. Bu nedenlerden dolayı, doku örnekleri PCa ölçüde göre stromal ve epitelyal hücre tipinin orantılı olarak belirgin farklılıklar vardır. Bu farklılıklar, istenen hücre tipi mikrodiseksiyon bakılmaksızın tüm dokulardan elde edilen gen ekspresyon verileri yanlı varsayımlar yol açabilir. Bu nedenle, bu önyargı kaldırmak için onu önce RNA ekstraksiyon ve hücre tiplerini ayırmak için esastırgen ekspresyon analizi. Macrodissection ya mikrodiseksiyon fiziksel çevredeki stroma 4 -6 den iyi karakterize edilmiş epitelyal alanları ayırmak için kullanılabilir. Macrodissection tipik bir mikroskop altında bir jilet ile yapılan ve büyük PCa stromadan nodüller ayırmak için iyi çalışır, ancak stroma çevreleyen benign epitel kaldırma yeteneğine sahip değildir (Şekil 1&#39;de huylu prostat histoloji örneğe bakın). Bir lazer (LCM) ile Mikrodisseksiyonla macrodissection önemli ölçüde daha fazla emek yoğun, ama çok doğru bir iyi huylu epitel 4 incelemek olabilir. Bizim laboratuardan Son yayınlar RNA başarıyla formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) biyopsi veya dondurulmuş doku 4,7-9 birinden LCM tarafından elde edilebilir olduğunu göstermiştir. LCM-RNA ekstraksiyonu büyük zorluklar R 1) doğru dokuda istenilen alanlarını incelemek için, ve 2) korumak için vardırLCM ve izolasyon işlemi 4.10 sırasında NA bütünlüğü. Saf hücre popülasyonlarının izole RNA ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) 7,8, mikrodizi 11 ve derin -sequencing 12-14 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle gen ekspresyon analizi için kullanılabilir. Bu protokolün amacı, aşağı doğru gen ekspresyon analizleri donmuş dokudan LCM prostatik epitel toplam RNA&#39;nın izole edilmesi için.

<table><tbody><tr><td>RNase-AWAY&amp;nbsp;</td><td>MBP</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>PEN-membrane 4.0 mm slides&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>11600289</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides, Superfrost Plus</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon labs.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td><td>Sigma</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Staining jar)</td><td>IHCWORLD</td><td>M900-12</td><td></td></tr><tr><td>Coplins (Staining rack)</td><td>IHCWORLD</td><td>M905-12</td><td></td></tr><tr><td>Aperio ScanScope</td><td>Aperio(Leica)</td><td>ScanScope&amp;reg; CS</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Fluka</td><td>89640-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laser Microdissection System</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0350</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous&amp;reg;-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan microRNA RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>Thermo Fisher Scientific Brand</td></tr><tr><td>Hematoxylin stain&amp;nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3536-16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Richard Allan Scientific&amp;nbsp;</td><td>7111</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Bir önceki çalışmada aynı hastadan 4 dondurulmuş ve FFPE prostat dokularından mRNA ve microRNA RT-qPCR ifade profilleme karşılaştırmak epitel ve stromal doku toplamak için LCM kullanımını gösterdi. LCM RNA büyük miktarda nesil sekans analizi için toplanacak olan, özellikle de zaman alıcıdır. Bu nedenle, çalışma alanı tutmak için çok önemlidir ve araçları ücretsiz RNaz. (Bir sonraki paragrafta daha ayrıntılı olarak ele) toplandı RNA kaliteli ve hücre-özgüllük kontroller...

Watch this Scientific Journal Video about Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis at JoVE.com

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago. The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Video: Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Tıp

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results in cancer regression. However, in a significant number of cases, the disease progresses to advanced, castration-resistant prostate cancer (CRPC), which has limited therapeutic options and is often aggressive. Distant metastasis is mostly observed at this stage of the aggressive disease. CRPC is treated by a second generation of AR pathway inhibitors that improve survival initially, followed by the emergence of therapy resistance. Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a rare variant of prostate cancer (PCa) that often develops as a result of therapy resistance via a transdifferentiation process known as neuroendocrine differentiation (NED), wherein PCa cells undergo a lineage switch from adenocarcinomas and show increased expression of neuroendocrine (NE) lineage markers. In addition to the genomic alterations that drive the progression and transdifferentiation to NEPC, epigenetic factors and microenvironmental cues are considered essential players in driving disease progression. This manuscript provides a detailed protocol to identify the epigenetic drivers (i.e., small non-coding RNAs) that are associated with advanced PCa. Using purified microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) metastatic tissues and corresponding serum-derived extracellular vesicles (EVs), the protocol describes how to prepare libraries with appropriate quality control for sequencing microRNAs from these sample sources. Isolating RNA from both FFPE and EVs is often challenging because most of it is either degraded or is limited in quantity. This protocol will elaborate on different methods to optimize the RNA inputs and cDNA libraries to yield most specific reads and high-quality data upon sequencing.

Therapy resistance often develops in patients with advanced prostate cancer, and in some cases, cancer progresses to a lethal subtype called neuroendocrine prostate cancer. Assessing the small non-coding RNA-mediated molecular changes that facilitate this transition would allow better disease stratification and identification of causal mechanisms that lead to development of neuroendocrine prostate cancer.

Formalin-sabit Dokulardan Küçük Kodlamaz RNA'nın ve Kastrasyona Dirençli Prostat Kanseri Hastalarından Serum Türetilmiş Ekzozomların Dizilimi

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Kanser Araştırmaları

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Gelişim Biyolojisi

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Prostat Kanseri Klinik Dokularındaki miRNA İfade Analizleri

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Nörobilim

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Biyoloji

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and depth of this technology and extending it to the level of cells within the tissue is needed. Although the use of single nuclear and single cell RNA sequencing has become widespread, the expression signatures of cells obtained from tissue dissociation do not maintain spatial context. Laser microdissection (LMD) based on specific fluorescent markers would allow the isolation of specific structures and cell groups of interest with known localization, thereby enabling the acquisition of spatially-anchored transcriptomic signatures in kidney tissue. We have optimized an LMD methodology, guided by a rapid fluorescence-based stain, to isolate five distinct compartments within the human kidney and conduct subsequent RNA sequencing from valuable human kidney tissue specimens. We also present quality control parameters to enable the assessment of adequacy of the collected specimens. The workflow outlined in this manuscript shows the feasibility of this approach to isolate sub-segmental transcriptomic signatures with high confidence. The methodological approach presented here may also be applied to other tissue types with substitution of relevant antibody markers.

We describe a protocol for laser microdissection of sub-segments of the human kidney, including the glomerulus, proximal tubule, thick ascending limb, collecting duct and interstitium. The RNA is then isolated from the obtained compartments and RNA sequencing is carried out to determine changes in the transcriptomic signature within each sub-segment.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...