Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC) NIEHS hayvan çalışma teklifi IIDL 05-46 altında bu çalışmanın tüm metodoloji onayladı.
1. en uygun doku koleksiyonu için lazer mikrodiseksiyon
<ol><li>3-ay-yaşlı fareler, 2'yi edinmek erkek veya kadın C57BL/6. Ötenazi CO2 en az 1 dk ya kadar solunum kesildiği tarih vardır. Kafes hayvan kaldırmak ve servikal yerinden çıkması, işten çıkarma veya torakotomi ölüm sizi temin ederim.</li>
	<li>Diseksiyon önce tüm diseksiyon araçları temiz ve steril olduğundan emin olun. Not: gözleri kaldırılması için eğri makas ve forseps ile tırtıklı uç (tercih edilen ucu boyutu: 0.5 x 0.4 mm) gerekli olacaktır.</li>
	<li>Göz kolayca erişilebilir olması kendi tarafında düz bir yüzeye fare yere bırak. Gözün yuvasından kolayca alınabilir kadar göz çukuru bir kılavuz olarak kullanarak göz çevresinde göz, uzak eğri bakan eğri makas kullanarak kesebilir ve daha sonra fare, stabilize etmek forseps ile kavramak canthus (göz ucuyla) (eğri değil kullanma ipuçları makas).</li>
	<li>Yavaşça çekin ve eğri makas kullanılarak, yörünge soket gözünden bültenleri optik siniri kesme. Dikkatle göz göz ve durulama 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x dokuyu. 1.3-1.4 kontralateral göz için yineleyin.</li>
	<li>Gömme daha önce herhangi bir nem kaldırmak için doku Temizleme işlemi gözle leke. Objektif ve optik sinir sagittal bölümler elde etmek için tezgah üstüne paralel göz numune kalıp (25 x 20 x 5 mm3) içine yerleştirin. En iyi kesim ısı (O.C.T. içinde) bileşik gözleri katıştırabilir ve dondurma kuru buza koyun. Donmuş bir kez blok-80 ° C'de depolayın</li>
</ol>2. lazer mikrodiseksiyon için dondurulmuş bölümüne hazırlık
<ol><li>Kullanmadan önce polietilen tereftalat (PET) membran slaytları UV cross-linker 45 dk için maksimum güçte kuluçkaya.</li>
	<li>RNase dekontaminasyon çözüm üzerine fırça, kavanoz kaplin ve chuck montaj forseps, sprey. İyice silin. Nükleaz ücretsiz su ile durulayın ve kuru. Cryostat ile % 100 etanol çapraz bulaşma kaçınmak için aşağı silin.</li>
	<li>Cryostat-18 ° C'ye ayarlamak Bir donmuş blok-80 ° C dondurucudan bir kerede kaldırmak ve cryostat Kuru buz ile teslim. Donmuş blok en az 10 dk cryostat sıcaklığı ile equilibrate izin verir.</li>
	<li>O.C.T. küçük bir miktar üzerine montaj yığın (Şekil 1A) sıkmak ve doku blok kalıptan çıkarın ve dikkatli bir şekilde blok montaj chuck (Şekil 1B) yerleştirin. Montaj chuck doku blokta sağlam dondurulur sonra cryostat (Şekil 2A) numune tutucu yerleştirin.</li>
	<li>8 µm bölüm kesip dikkatle doku örneği ulaşmak için O.C.T. blok ile bölüm cryostat ayarlayın. Doku gözlenen sonra kesit durdurun, temiz bir jilet kullanarak her tarafta donmuş blok döşeme ve boya fırçası (Şekil 2B) ile işlemeyi etkinleştirmek IÇIN dokuyu çevreleyen O.C.T. 3-4 mm bırakın. Yeni bir temiz boya fırça rulo plaka örnek çapraz bulaşma kaçınmak için her örnek değişiklik arasında yerine kullanın.</li>
	<li>Bölümü hızla çalışmaya göz üzerinden. Slayt bir hızlı tek adımlı Hematoksilen ve eozin (H & E) ile sel tarafından üçüncü her bölüm için 60 leke leke s, musluk suyuyla durulayın, net Temizleme Aracısı kurutma ve mount bir coverslip ile dolu cam slayt üzerindeki. Mikroskop altında görüntülemek ve TM kesme bölümlerde belirgin olana kesit devam edin.</li>
	<li>TM görünmeye başladığında, 2 bölüm kesme ve H & E LCM ile kesme için bir harita oluşturmak için boyama için rutin bir dolu cam slayt üzerine monte. Not: Bölüm 3 harita ve boyama Ayrıntılar için bkz.</li>
	<li>İlk H & E slayt göster sonra kesip cryostat 6 seri 8-µm kalınlığında bölümlerde hizalayın ve aynı anda evde beslenen hayvan membran slayt (Şekil 3A, B) monte. Doku kısaca membran arka boyunca eldivenli başparmak kaydırarak uygun. Montaj sonra evde beslenen hayvan membran slayt hemen kuru buzda bir slayt kutusuna yerleştirin. Not: Daha az bölümleri monte, ancak, bir slayda birden çok bölüm aynı anda montaj RNA bozulması her bölüm oda sıcaklığında havaya maruz zaman miktarını sınırlayarak azaltmak için önerilir.</li>
	<li>Her iki evde beslenen hayvan membran slayda 6 bölümleri ile sonra gözlerinin, bölüm, H & E boyama için başka bir harita slayt oluşturmak için dolu cam slayt üzerindeki iki bölüm toplamak devam. Kesit, yaklaşık 100 seri 8-µm kalınlığında kesitler, TM görünene kadar devam edin. Hızlı bir şekilde şarj edilmiş cam slayt (bkz: 2.6) üzerindeki bir bölümü boyama tarafından onaylayın.</li>
	<li>Tüm evde beslenen hayvan membran slaytları daha sonra LCM kullanmak-80 ° C'de depolayın.</li>
</ol>3. H & E harita slayt Protokolü ve morfolojik İnceleme boyama
<ol><li>Görselleştirmek ve harita slaytlar dolu cam slaytlara İnceleme için doku hemen boyama kavanoza aktarma tarafından 100 mL hızlı sabitleme çözeltisi ile 7 s. durulama için slayt içine daldırma dolu düzeltme 10 - 20 kez distile su , slayt bir kaplin kavanoz temiz distile su ile aktarın.</li>
	<li>Slayt sudan çıkarın ve kuru kenarları doku bezle leke. Pipet 200 değiştiren µL Harris hematoksilen her bölümün filtre ve 30 için kuluçkaya s, oda sıcaklığında. Dikkatli bir şekilde su açık çalıştırır kadar akan musluk su altında slayt durulayın. Aşırı sıvı kaldırmak için bir doku bezle slayt her adım (leke arasında her adım 3.2-3,5) arasında sonu leke.</li>
	<li>1 x PBS, oda sıcaklığında 30 yer slayt s. O zaman, dikkatle durulama akan musluk su 30 altında slayt s.</li>
	<li>Slayt 3 - 4 kez % 95 etanol banyo içine daldırma. Ve doku slayt üzerinde kapağı için 15 kuluçkaya yeterli eozin Y boya çözüm geçerli s, oda sıcaklığında.</li>
	<li>Slayt % 95 etanol banyo iki kez 10-20 hızlı dips her ile yıkayın. Slayt % 100 etanol banyo iki kez 10-20 hızlı dips her ile yıkayın. Sonra slayt ksilen banyo (10-20 hızlı dips her) iki kez yıkayın.</li>
	<li>Reçineli montaj orta için doku uygulayarak mount, coverslip dikkatle hava kabarcıklarını önlemek ve mahallede gece kurumaya bırakın ekleyin.</li>
	<li>H & E slaytlar görsel olarak veya bir dijital slayt tarayıcı kullanarak gözden geçirin. Harita slaytlar TM açıkça görünür ve kesme için erişilebilir tanımlar. Evde beslenen hayvan kullanın membran slaytlar arasında bunlar LCM için slaytları göster.</li>
</ol>4. polietilen tereftalat (PET) membran işleme ve boyama Protokolü slaytlar
<ol><li>Evde beslenen hayvan dondurucu slaytlardan kaldırma ilk 0.3 g kresil menekşe asetat 20 mL % 75 etanol içinde eriterek tarafından kresil menekşe hisse senedi çözüm hazırlamak ve üzerine yerleştirin önce 6 Pzt'dan 2 h. filtre 0,22 µm steril filtre ünitesi ve mağaza için artık 4 ° C'de ile çözüm için sarsıcı THS.</li>
	<li>Eozin Y alkollü çözüm 1:4 oranında taze % 75 etanol ile hazırlayın. Fiksasyon (% 75 etanol) ve su kaybı çözümleri (etanol % 75, % 95 ve % 100) temiz, nükleaz bırakmayan, 50 mL konik polipropilen borular buzda hazırlayın. RNase inhibitörü her ekleyin.</li>
	<li>-80 ° C dondurucu donmuş doku bölümleri içeren slayt kutusunu çıkarın ve kuru buza yerleştirin. Bir slayt anda işleme. Slaytları Slayt hemen soğuk % 75 etanol için 30 içine yerleştirerek düzeltmek s.</li>
	<li>Yavaşça nükleaz ücretsiz su doku bölümlerle engel olmadan O.C.T. dağıtılması için 10-15 s için slayt daldırma.</li>
	<li>Dikkatle 300 µL % 1.5 kresil menekşe asetat çözüm bölümleri doğrudan üzerine pipet ve 45 için kuluçkaya s, oda sıcaklığında. O zaman, 30 s. pipet 200 µL eozin Y çözüm için bölümler üzerine % 75 etanol banyo içine yerleştirerek bir kez yıkama ve 3-5 s için kuluçkaya.</li>
	<li>Daha sonra % 75 etanol, % 95 etanol ve son olarak, % 100 etanol banyo için 30 slayt yerleştirerek doku kurutmak her s. Bir doku bezle slayt aşırı sıvı kaldırmak için her adımda arasında sonu leke. 5 min için başlık altında kurumasını slayt hava girsin. Kuru bir kez LCM hemen sonra gerçekleştirin. Not: Bu adım için ksilen kullanımını önlemek için önerilir, yeterli ölçüde membran slayda bağ doku bölümleri neden olabilir ve doku yakalama verimliliği azaltır.</li>
</ol>5. lazer mikrodiseksiyon UV Lazer ile
<ol><li>Bilgisayarı açın ve önyükleme için izin verir. Mikroskop beyaz ışık güç kaynağı açın. UV Lazer anahtar ve bir sarı LED yanacaktır açın. LCM yazılımını başlatın, tam yük ve canlı video görüntüler sağlar. Denetleyicisi sille lazer düğmesine basın ve yeşil bir LED ışık yanacaktır.</li>
	<li>Mikroskop sahne alanı'na yeni bir cam slayt yük sonra lekeli doku yüzü aşağı bakacak şekilde doğrudan cam slayt üstünde evde beslenen hayvan membran slayt yerleştirin. Membran ve cam slayt mikroskop sahne alanı'nda sıkı bir şekilde eşleştirilmiş emin olun.</li>
	<li>İlk slayt sınırlarını ayarlayarak başlangıç LCM. Seçin en düşük 4 X büyütme objektif panelinde (Şekil 4). Sonra çalışma alanının membran slaydın metal ve membran kesiştiği sol üst köşesinde, canlı görüntülerin basın "Sınırı 1" düğmesini ve kırmızı bir dikdörtgen yol haritası-ecek gözükmek içinde görünene kadar mikroskoplar xy aşamalı hareket ettirerek tanımlayın. Ardından, xy-sahne alanı'na karşı köşeye taşımak ve "2 sınırla" düğmesine basın. Membran ve dokuların set sınır arasında bir yol haritası görüntü oluşturmak için "tarama" düğmesine basın.</li>
	<li>Bir yol haritası içinde göz bölümlerinin TM yakınındaki çift tıklayın, TM iridocorneal açı (Şekil 5A) tepe bulunabilir. TM saptanmıştır sonra 10 X ve el ile TM odaklanmak için büyütmeyi. 20 X ve 40 X hedefleri ile yineleyin. TM 40 X amaç (Şekil 5B) ile odak olduğunda, boş bir alana gidin (odak biraz ayarlanması için gerekebilir), "serbest çizim aracı" seçin ve doku boş bir alan üzerinde uzun bir çizgi çizin.</li>
	<li>% 34 "kesme hızı" olduğunu, "odak" % 58, "güç" % 70 (Şekil 4) sonra "Kes" tuşuna basın böylece ve lazer parametrelerini ayarlamak. Bir açık ve iyi kesme hattı (bkz: Şekil 5C) görülmektedir kadar hız, odak ve güç parametreleri iyi lazer ayarlamaları yapın. Hassas kesme, kesme hareketi çizilmiş çizgiyi takip emin olun.</li>
	<li>Yalıtım tüp kapak kap yuvasına yükleyin ve tüp açın. Cap-tutucu kap asansörü iliştirin ve tüp ters emin olun. Yapışkanlı kap malzeme kapağı istenen doku düzgün yakalanır emin olmak için belgili tanımlık uç protrudes sizi temin ederim.</li>
	<li>"El ile" diseksiyon modu yazılım panelinde seçin. TM (5B rakam) doğrudan yalıtım tüp altında olduğunu dikkatle gözden geçirin. Beyaz ayarını ve en iyi görüntü kalitesi (Şekil 4) elde etmek için parlaklığını ayarlayın.</li>
	<li>Kesme başlar, el ile odak ayarlamak ve serbest çizim aracını kullanarak bir çizgi çizmek için koleksiyon kap henüz dokunmadan membran yukarı konumda kalır emin olun. TM (Şekil 5C), sklera buluştuğu yakınındaki kısmi daireler çizmek sonra basın "kes." Bir kez ilk kesim yapılır, kapağı aşağı pozisyona getirin ve odağı yeniden ayarlayın, daha sonra basın "Kes" ve doku bölümünden toplamak sonra TM, Çember tamamlanıyor iki kısmi daire bağlanmak için açık veya serbest uzayda iki çizgiler çizmek , TM mikrodiseksiyon kap (Şekil 5 D-F) tarafından tutuklanmıştı emin olun.</li>
	<li>Kapağı yukarı pozisyona getirin ve kalan bölümlerde (5.2-5,8) tekrarlayın. Böylece tüm izole örneklerini kap uygun ve (Şekil 5G) üst üste değil biraz kap pozisyonunu ayarlayýn. Tutarlılık sağlamak için bir slayt için zaman penceresi 20 dk. kullanım TM bütün bölümlerden yalıtmak için daha fazla zaman gerekirse hayvan başına daha az bölümleri slayt olduğunu. Sonraki evde beslenen hayvan membran için yeni bir yalıtım tüp takın ve Bölüm 5 tekrarlayın.</li>
</ol>6. lizis Microdissected TM doku
<ol><li>Taze RNA lizis arabellek izole LCM doku koşullar için hazır olun. 10 µL β-mercaptoethanol lizis arabellek için her 1 mL ekleyin. β-mercaptoethanol en fazla 1 ay için oda sıcaklığında lizis önbellekle saklayın.</li>
	<li>Mikrodiseksiyon başlangıcından 20 dk içinde kap sahibinden yalıtım tüpü çıkarması. Cap yüzey TM yakalanması emin olmak için göz tarafından görselleştirin.</li>
	<li>Dikkatle 10 µL lizis arabellek lizis arabellek tamamen microdissected TM kapsar sağlanması koleksiyonu tüpün kapağı üzerine pipet. Yavaşça yapışkanlı kapağı kapatın ve toplama tüp ters, oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. Kuluçka sonra vasıl 800 x g 2 dk santrifüj kapasitesi ve kuru buza lysate yerleştirin. Lysates daha sonra arıtma ve çözümleme-80 ° C'de depolayın.</li>
</ol>7. RNA izolasyon ve kalite Analizi
<ol><li>RNA kalitesi örnekleri, oda sıcaklığında çözdürme tarafından analiz. Havuzu birlikte tüm örnekleri tek bir fare--dan bir RNase free 1.5 mL microfuge tüp izole. Not: Örneğin, 10-12 tüpler 10 µL lysate microdissected kapakları biyolojik her çoğaltma için oluşturulan ve tüm lysates her biyolojik Çoğalt (100-120 µL lysate) için tek bir tüp içine transfer edildi.</li>
	<li>Bir taze hazırlanmış % 70 etanol (RNase free su ile yapılan) hacmi lysate her ekleyin. Sonra toplam RNA RNA izolasyon kiti Kullanıcı yönergeleri izleyerek arındırmak. Genomik DNA RNA örnekleri'kaldırılmasını sağlamak. Not: Genomik DNA aşağı akım RNA analizi ile etkileyebilir.</li>
	<li>Birlikte her fare örnekleri havuz ve ribozomal RNA bütünlüğü (6A rakam) analiz TM izole RNA kalitesini ölçmek. Not: TM küçük boyutu nedeniyle, ribozomal RNA doruklarına observable (Şekil 6B) RNA kalite profili (iki doruklarına 1.000-4.000 bp Şekil 6A, C'arasındagözlenen) üzerinde olmayabilir RNA bütünlük numarası (RIN) hesaplamak için kullanılan 47.<ol>
<li>RNA bütünlüğünü daha doğru bir ölçü RNA membran slayda daha bol kalan dokusundan izole ederek elde edilir. Bir temsilci RIN, pipetting 10 membran slaytta vizörün dokusundan izole RNA elde etmek için µL lizis bir doku bölümü tampon ve RNA izolasyon gerçekleştirmek. RNA kalite analiz ve RIN (Şekil 6C) hesaplar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağı akım RNA uygulamalarda kullanım tekrarlanabilir verim sıralama ve cDNA Kütüphanesi üretimi için alçak giriş RNA seti LCM kadar az 80 bölümlerden sonuçları TM izole.</li>
</ol>8. analiz
<ol><li>Toplanan doku aslında TM ilişkili genler zenginleştirilmiştir doğrulamak için birden çok ek RNA microdissected bütün göz, sklera, Iris, retina, kornea ve 3 ayrı fareler objektiften toplamak. LCM ile birlikte bu RNA RNA üzerinden toplanan kullanımı TM ve silier vücut 4 ayrı fareler toplanan izole.</li>
	<li>Convert RNA microdissected örneklerinden cDNA cDNA Ters transkripsiyon kiti kullanılarak yapıldı. RNA izole LCM örneklerinden yükseltmek ve düşük giriş RNA cDNA Kit kullanarak cDNA dönüştürmek.</li>
	<li>Tüm RNA trabeküler meshwork genler, myocilin (MYOC) ve Alfa-aktin-2 (ACTA2), ifade etmek için analiz ve dijital PCR (Şekil 7A-B) tarafından HSP90a1 temizlik gen kullanarak normalleştirmek.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

TM aktif olarak homeostatik IOP korumada önemli bir rol oynar ve onun disfonksiyon yaygın hipertansif glokom1,2,19ana etken faktör olarak kabul edilir. Tek nükleotid polimorfizmleri çeşitli genlerde GWAS analiz tarafından tanımlanan bir dizi artan Glokom riski ve TM AH çıkım tesisinde artan direnç bağlantılı olmuştur; Ancak, bu hastalığın ortaya çıkmasına kesin moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anla...

Glokom optik nöropati ve sonuçta geri dönüşü olmayan körlüğü1,2' ye giden retinopati karakterize hastalıklar grubudur. Bu tarafından 2020 over 70 milyon kişi dünya çapında hastalığı3,4,5,6,7çeşit ile yaşıyor olacak tahmin edilmektedir. Birincil açık açılı glokom (POAG), glokom, en yaygın türü göz içi basınç artışı (gib)8,9,10' aönde gelen sulu mizah (AH) çıkış bir azalma ile karakterize, 11,12,13,143,15,16,17,18. Sol tedavi edilmezse, kronik olarak yükseltilmiş IOP retina ve radyal körlüğü1,2,19neden optik sinir başı ilerici ve geri dönüşü olmayan zarar yol açar. Glokom gib, silier vücut tarafından Ah üretim hızını azaltarak veya bu çıkış1,8,9, artırılması tarafından azaltma konusuna önem ilerlemesini yavaşlatmak için tüm geçerli yöntemleri 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabeküler meshwork (TM) aktif olarak birincil AH çıkım yolu düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve uygunsuz işlevini hipertansif glokom1,2,19için sorumlu bir faktördür. Ancak, TM disfonksiyon ve nasıl AH drenaj düzenleyen ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılmış değil ve şu anda önemli bir odak noktası glokom araştırma1,2,19, 20. çeşitli genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) glokom ve TM AH çıkım tesisinde artan direnç genleri bir dizi bağladığınız iken hastalığı yol değildir tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak21 anlayamadım , 22 , 23 , 24 , 25.
Hayvan modelleri büyük ölçüde geçerli bilgimizi (3,15,16,26,27,28', kapsamlı bir şekilde gözden glokom hastalığın ilerlemesinde gelişmiş var. 29,30,31,32,33). TM34,35,36 çalışmaya çeşitli öncü yöntemler geliştirilmiştir ve bu yöntemler yaygın olarak normal ve hastalıklı doku geçerli bizim anlayışı ilerletmek için kullanılmıştır. Değil kapsamlı bir şekilde araştırılmalıdır bir alan TM başarısızlık moleküler mekanizmaları incelemek için genetik olarak değiştirilmiş fare modellerinin kullanımı olduğunu. Transgenik knock ve knock-out fare çalışmaları gibi Myocilin (Myoc)37,38 ve Cyp1b139, TM ilişkili genlerin TM moleküler mekanizmaları eğitim için birincil araçlar olmuştur işlev. Anlaşılır, farelerde TM küçük boyutlu bu doku çalışmaya başlamak için aşılması gereken ciddi bir engel temsil eder. Fare modelleri LCM teknolojik gelişmeler TM dahil olmak üzere en küçük ve en hassas dokuları çalışma güçlendirmek için gerekli araçları sunarken genetik ve moleküler mekanizmaları hastalık, eğitim için güçlü bir araç temsil eder.
Bu raporda, sonraki RNA izolasyon ve güçlendirme için aşağı akım ifade analizi ile birlikte fare gözlerinden zenginleştirilmiş TM LCM için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemi açıklanmıştır. Benzer Yöntem başarıyla farelerde göz dokularının40,41,42,43,44diğer türleri yalıtmak için kullanılmıştır, burada bildirilen metodoloji diğerine uygulanabilir RNA, mikroRNA, DNA ve proteinler çalışmaya göz ayrı dokuların. Önemlisi, bu teknik TM bozukluğu glokom ve oküler hastalığı3,15,16,17 moleküler patogenezi daha iyi anlamak için genetik olarak değiştirilmiş fare kullanımı sağlar ,18,26,31,45,46. Yeteneğini LCM fare gözlerle TM izole etmek-ecek var olmak daha fazla birkaç oküler hastalıkların moleküler mekanizmaları anlayışlar elde yararlı bir yöntem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2946-90004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad QX200 Droplet Digital PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paint Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged Glass Microscope Slide</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y dye</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>71204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemaCen</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>STHEM30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031255</td>
			<td>VEX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1850 Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGS033SB</td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellCut UV Cutting Model</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td>LCM intrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI CellTools Software</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50202</td>
			<td>LCM software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>ST-LMD-M-500</td>
			<td>Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>modified Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7211</td>
			<td>FAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10031252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free</td>
			<td>ASEE Products</td>
			<td>FS-LMD-M-50r</td>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memebrane Slides, RNase Free (Alternative)</td>
			<td>Molecular Machines &#38; Industries</td>
			<td>50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Fix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6764212</td>
			<td>H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>lysis bufffer used for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA RNAse Inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>634888</td>
			<td>low input RNA to cDNA kit for LCM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix (no dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>digital PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratalinker UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Macron</td>
			<td>8668</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of highly pure trabecular meshwork from mouse eyes for gene expression analysis

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) gen ifade analizi tek hücre izin ve hücre popülasyonlarının doku bölümlerde zenginleştirilmiş. LCM hücre farklılaşma ve geliştirme ve glokom da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesini temel moleküler mekanizmaları incelenmesi için harika bir araçtır. Glokom, ilerici optik neuropathies bir ailenin oluşur, geri dönüşü olmayan körlüğü dünya çapında en sık nedenidir. Yapısal değişiklikler ve trabeküler meshwork (TM) içinde hasar glokom geliştirmek için önemli bir risk faktörü olan göz içi basınç artışı (gib), neden olabilir. Ancak, hassas moleküler mekanizmaları dahil hala kötü anlaşılır. Gen ifade analizi gerçekleştirme olanağı daha fazla bu hücreler ve rolünü IOP ve glokom gelişme Yönetmelikte işlevi anlayışlar elde etmek çok önemli olacak. Bunu başarmak için RT-qPCR ve RNA-Seq gereklidir gibi son derece izole bir tekrarlanabilir Yöntem TM fare gözler ve bir yöntemi için aşağı akım gen ifade analizi, donmuş bölümlerden zenginleştirilmiş. Burada açıklanan yöntemi son derece saf TM fare gözlerinden aşağı akım dijital PCR ve Mikroarray analiz için izole etmek için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, bu Teknik yalıtım diğer zenginleştirilmiş oküler hücreleri ve fare gözlerinden izole etmek zordu hücre bölmeleri için kolayca adapte edilebilir. LCM ve RNA Analizi kombinasyonu glokom temel hücresel olaylar daha kapsamlı bir anlayış için katkıda bulunabilir.

LCM RNA TM toplanan ve 4 farklı fareler vücuttan silier gen ekspresyonu analiz ve bu ifadeyle bütün göz, sklera, Iris, retina, kornea ve objektif üç ayrı fare izole karşılaştırmak için izole edildi. TM, genlerin ifade izole TM örnekleri gerçekten son derece TM zenginleştirilmiş onaylamak için toplanan tüm dokularda MYOC48 ve ACTA249 analiz edildi. CDNA LCM örneklerinden son derece düşük miktar nedeniy...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

laser-capture-microdissection-highly-pure-trabecular-meshwork-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Görüntüleme.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH. Burada, biz bir tekrarlanabilir lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) için bir protokol trabeküler meshwork (TM) aşağı akım RNA analizi için yalıtmak için açıklamak. TM ifadede gen değişiklikleri analiz yeteneği göz hastalıkları TM ile ilgili temel moleküler mekanizmaları anlamada yardımcı olacaktır.

Video: Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Memeli Doku Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Dan Tagged Çekirdeğin Affinity-tabanlı yalıtım<em&gt; Drosophila</emGen ekspresyon analizi için&gt; Dokular

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray'ler Kullanımı