This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati trattati secondo protocolli approvati dalla struttura alloggiativa animale Valladolid University in accordo con la Convenzione europea 123 / Consiglio d&#39;Europa e la direttiva 86/609 / CEE. 1. Breve e Lungo Periodo Cultura di ratto neuroni dell&#39;ippocampo <ol><li> Preparazione di poli-D-lisina rivestito, 12 coprioggetto mm vetro. <ol><li> Sterilizzare 12 mm di diametro vetrini in etanolo per almeno 24 ore. Lasciarli asciugare in condizioni sterili. </li><li> Distribuire i coprioggetti su una striscia di parafilm in una capsula di Petri. Coprire la superficie di ogni coprioggetto con 200 ml di 1 mg / ml di poli-D-lisina. Consenti il ​​trattamento O / N. </li><li> Il giorno dopo, lavare i coprioggetti con doppio acqua sterile distillata ogni 15 minuti per 90 minuti in condizioni di sterilità. </li><li> Riempire un piatto a quattro ben multidish con 500 ml di Neurobasal cultura medio per pozzetto. Neurobasal cultura medio dovrebbe essere integrata conSiero fetale bovino 10%, 2% B27, 1 mg / ml di gentamicina e 2 mM L-glutammina. </li><li> Mettere i coprioggetti nella piastra multidish. Mantenerli in un umidificata 37 ° C e 5% di CO 2 incubatore fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Isolamento di neuroni dell&#39;ippocampo di ratti neonati. <ol><li> Preparare 1,8 ml di soluzione di papaina (direttamente acquistato) in un flaconcino (20 ml / ml) in condizioni sterili: Per ottenere una concentrazione finale di 20 ml / ml aggiungere circa 40 microlitri papaina in 1,8 ml di Hank di più il 0,6% di BSA (ml devono essere calcolate a seconda delle condizioni del fornitore). Hank 0,6% BSA viene preparato miscelando 85 ml di HBSS media con 15 ml di albumina sierica bovina 4% (BSA, preparata risolvendo 4 g di BSA in 100 ml HBSS). Preparare in una cappa sterile. </li><li> Incubare la papaina in Hank più 0,6% BSA per 30 min a 37 ° C prima dell&#39;uso. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 micron prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare F-12 di media di Ham con l&#39;aggiunta di DulbeccoModificato Media polvere dell&#39;Aquila (13,5 g per l) in 900 ml di acqua distillata sterile doppio. Quindi aggiungere 6 g HEPES e 336 mg NaHCO3 e regolare il pH a 7,42 con NaOH 4 N. Aggiungere acqua sterile per ottenere una soluzione 1 L e filtrata utilizzando un polietersulfone 0.20 micron (PES) bottiglia filtro superiore. Portare questo processo in una cappa sterile. Infine saturare la soluzione con CO 2 in condizioni sterili prima dell&#39;uso. Soluzioni Conservare a 4 ° C e usarli refrigerata. </li><li> Eutanasia neonato (P0) cuccioli di ratto per decapitazione e lavare la testa in sterili medio HBS. Aprire il cranio con l&#39;aiuto di forbici sterili. Estrarre il cervello con una spatola e lavare rapidamente in F-12 di media di Ham. </li><li> Effettuare un taglio diagonale con l&#39;aiuto di un bisturi in ciascun emisfero (Figura 1B), e portarlo ad una piastra di Petri contenente F-12 di Ham medie. </li><li> Meningi Scartare con attenzione con l&#39;aiuto di pinze dissezione e sotto una lente di ingrandimento. </li> &lt;li&gt; Identificare l&#39;ippocampo in un luogo caratteristico concava sulla corteccia con lente di ingrandimento. Poi, separare l&#39;ippocampo dalla corteccia tirando con attenzione di una frontiera e la rimozione dalla sua posizione con le forbici occhi. </li><li> Trasferire il tessuto dell&#39;ippocampo ad una piastra di 4 ben riempita con mezzo sterile di Hank priva di Ca 2+ e Mg 2+ più dello 0,6% di BSA e lavare il tessuto dell&#39;ippocampo. Senza rimuovere i mezzi di taglio del tessuto in piccoli pezzi (circa 2 x 2 mm) utilizzando le stesse forbici occhio. </li><li> Trasferimento pezzi di ippocampo di un flaconcino contenente 1,8 ml di soluzione di papaina pre-filtrata. Poi li incubare a 37 ° C, con occasionale, agitando delicatamente. 15 minuti più tardi, aggiungere 90 ml di soluzione di DNasi I (50 mg / ml finale) e incubare per 15 minuti supplementari. </li><li> Trasferire il tessuto in una provetta da centrifuga da 10 ml e lavare i frammenti con fresco Neurobasal Cultura Media. Ottenere sospensione cellulare passando frammenti di tessuto attraverso una plastica pip 5 mlette. </li><li> Sospensione cellulare a 160 xg Centrifugare per 5 min. Rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur di plastica sterile e sospendere accuratamente pellet con 1 ml automatizzati pipetta in 1 ml di terreno di coltura Neurobasal. </li><li> Misurare la densità cellulare utilizzando una camera di conteggio Neubauer. Mettere il vetrino di vetro sopra la camera di Neubauer. Aggiungere 10 ml di sospensione cellulare. Assicurarsi che la sospensione cellulare entra in modo uniforme e senza fare bolle camera. Contare il numero di cellule al microscopio ed eseguire calcoli corrispondenti per ottenere una goccia adatto di 40-80 ml ​​contenente 30 x 10 3 cellule. Il numero totale di cellule dipenderà dal numero di animali utilizzati. </li></ol></li><li> A breve termine e la cultura a lungo termine dei neuroni dell&#39;ippocampo di ratto. <ol><li> Sul piatto quattro ben multidish contenente 500 ml di Neurobasal cultura medio preparato prima e conservati in incubatrice, piastra di circa 30 x 10 3 cellule in una goccia di circa 50 microlitri per ognipozzetto della piastra multidish contenente un poli-D-lisina rivestite, 12 mm coprioggetto di vetro di diametro. </li><li> Mantenere cellule dell&#39;ippocampo primarie in un umidificata 37 ° C e 5% di CO 2 incubatore per 2-5 giorni in vitro (DIV, a breve termine, i giovani culture) o&gt; 15 DIV (a lungo termine, di età compresa tra culture) prima di esperimenti senza cambiare la cultura media. </li></ol></li></ol> 2. imaging di fluorescenza della Ca citosolico 2 + Concentrazione <ol><li> Preparazione delle soluzioni di prova per l&#39;imaging di fluorescenza. <ol><li> Preparare una soluzione esterna salina HEPES-buffered (HBS) contenente, in mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl 2 1, CaCl 2 1, il glucosio 10, sodio-HEPES 10 (pH 7.42). </li><li> Preparare una soluzione esterna, Mg 2 + -free, salino HEPES-buffered (HBS) contenente, in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl 2 1, il glucosio 10 e HEPES 10 (pH 7.42). </li><li> Risolvere salina NMDA in Mg 2 + -free, HEPES-buffered (HBS) ad una finaconcentrazione l di 100 micron e integrare con 10 mM glicina. </li><li> Preparare una soluzione contenente KCl HBS invece di NaCl risolvendo (in mM): 145 KCl, MgCl 2 1, CaCl 2 1, glucosio 10 e 10 HEPES (pH 7.42). </li></ol></li><li> Caricamento di cellule dell&#39;ippocampo con sonda fluorescente calcio fura2 / AM. <ol><li> Prendere la coltura cellulare contenente lamelle via l&#39;incubatore e lavarli con HBS media a temperatura ambiente per il conferimento ad una nuova piastra multidish quattro pozzetti contenenti 500 ml di HBS per pozzetto. </li><li> Incubare le cellule con fura2 / AM 4 micron (preparati nello stesso mezzo HBS) per 60 minuti a temperatura ambiente (25 ° C) in un luogo buio. </li><li> Dopo 60 minuti, lavare coprioggetto con fresco medio HBS. </li></ol></li><li> Registrazione di immagini di fluorescenza di citosolico [Ca 2+] in cellule in coltura. <ol><li> Accendere la lampada, microscopio, sistema di perfusione, fotocamera fluorescenza e computer. </li><li> Mettere i coprioggetti in una piattaforma per termostatatoaperto 12 coprioggetto mm di vetro sul palco del microscopio invertito e selezionare un campo microscopico utilizzando un obiettivo 40X (olio, NA: 1.3). Profumato cellule continuamente con pre-riscaldato (37 ° C) HBS medie assenza o presenza di sostanze di prova. Mantenere il flusso ad una velocità di circa 5-10 ml / min. Nota: sistema di perfusione delle cellule per cellule viventi è montato in una piattaforma per termostatato aperta 12 coprioggetto mm vetro. 8 linee di sistema perfusione gravità-driven dotati di posizionatore viene utilizzato per perfusione soluzioni. Pompa da vuoto è responsabile per la rimozione di ogni eccesso. Le soluzioni vengono riscaldati mediante un sistema di riscaldamento a tubo. </li><li> Acquisire un&#39;immagine di sfondo con l&#39;otturatore chiuso ad entrambe le lunghezze d&#39;onda di eccitazione. </li><li> Epi-illuminare le cellule alternativamente a 340 e 380 nm. Luce Record emessa a 520 nm ogni 5-10 sec con una telecamera a fluorescenza, che viene filtrato da un specchio dicroico fura-2. </li><li> Quando il periodo di registrazione è terminata, memorizzare la sequenza completa oimmagini f emessi a 520 nm nel computer per ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Analisi di immagini fluorescenti registrate. <ol><li> Aprire il file esperimento. Utilizzando il software aquacosmos, clicca su &#39;Rapporto&#39; e selezionare l&#39;intervallo rapporto desiderato. Calcolare il rapporto di pixel per pixel nelle immagini risultanti per ottenere una sequenza di immagini di rapporto. </li><li> Sottrarre sfondo regolando l&#39;&#39;eliminazione sfondo&#39;. Premere &#39;calcolo start&#39;. </li><li> Premere &#39;ogni momento sequenza&#39; pulsante e cancellare le antiche regioni di interesse (ROI). Per l&#39;analisi quantitativa delle singole cellule, stabilire nuove regioni di interesse o ROI corrispondenti ai singoli neuroni. Media tutti i valori del rapporto di ciascun pixel corrispondenti a ciascun ROI e ogni immagine per ottenere una registrazione di valori di fluorescenza di rapporto per i singoli ROI (celle). </li><li> Per rappresentare graficamente le singole registrazioni esportare i valori di rapporto di fluorescenza corrispondenti ad ogni ROI un progr graficaam. </li><li> Effettuare i calcoli corrispondenti per stimare la dimensione degli aumenti in rapporto fluorescenze in risposta a ciascuna stimolazione utilizzando un&#39;analisi dei dati adatto e grafici software. </li></ol></li></ol> 3. bioluminescenza Imaging di mitocondriale Ca 2+ Concentrazione <ol><li> La trasfezione di neuroni dell&#39;ippocampo in coltura con il plasmide mitGAmut. NOTA: Le cellule vengono prima trasfettate con il plasmide mitGAmut contenente una sequenza mitocondri mirati e un aequorina mutata priva di un sito di legame di Ca 2+ fusa alla proteina verde fluorescente (GFP). Questa costruzione rileva grandi aumenti in mitocondriale Ca 2+ assorbimento e permette l&#39;identificazione di cellule trasfettate da fluorescenza GFP. Il plasmide è stato sviluppato e gentilmente fornito da P. Brulet e collaboratori 18 (CNRS, Parigi). <ol><li> Preparare Neurobasal TF, contenente Neurobasal Cultura Media, privo siero fetale bovino, B27, gentamice 2 mM L-glutammina. </li><li> Preparare 50 ml di Neurobasal TF oltre 2,5 ml di reagente di trasfezione in un flaconcino (soluzione A). Preparare 50 ml di Neurobasal TF più 4 mg mitGAmut plasmide in un flaconcino (soluzione B). Aggiungere delicatamente soluzione B sopra soluzione A. Consentire miscelazione durante 20 minuti, senza agitare. </li><li> Trasferire i coprioggetti contenenti neuroni dell&#39;ippocampo a nuove piastre multidish contenenti 200 ml di Neurobasal fresco TF. </li><li> Aggiungere goccia a goccia 100 ml di soluzione A + B su ogni vetrino. Incubare per 30 min. Rimuovere il supporto. Lavare una volta cellule con Neurobasal fresco TF. Ritorna i coprioggetti all&#39;originale Neurobasal Cultura Media. </li><li> Neuroni di coltura per altre 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 dopo la trasfezione per consentire l&#39;espressione efficace e la destinazione della sonda. </li></ol></li><li> Preparazione delle soluzioni di prova per l&#39;imaging bioluminescenza. <ol><li> Preparare le soluzioni HBS contenenti NMDA 100 micron o 145 mM KCl comesopra (punto 2.1). Preparare la soluzione HBS contenente 10 mM Ca 2+ più digitonina 100 micron. </li></ol></li><li> Ricostituzione di equorina mitocondri mirati con coelenterazine n. <ol><li> Coprioggetto trasferimento contenenti neuroni dell&#39;ippocampo transfettate ad una piastra di quattro pozzetti contenenti 200 ml di HBS. </li><li> Aggiungere 4 ml di coelenterazine n (200 micron) per 200 ml di HBS per una concentrazione finale di 4 micron e mescolare delicatamente. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (25 ° C) e al buio. </li></ol></li><li> Registrazione di immagini bioluminescenza di mitocondriale [Ca 2+]. <ol><li> Accendere il microscopio, la lampada, il sistema di perfusione, fotocamera bioluminescenza e il computer. </li><li> Trasferimento coprioggetti ricostituiti per un termostatato (37 ° C) camera di perfusione e profumato continuamente con soluzione pre-riscaldato HBS ad una velocità di 5-10 ml / min. </li><li> Utilizzando un obiettivo 40X (olio, NA: 1.3), selezionare un campo microscopico che contiene le cellule che esprimono l&#39;unapoaequorins come dimostrano emissione di fluorescenza associata con l&#39;espressione di proteine ​​verde fluorescente (GFP) usando i filtri FITC. Un tipico campo può contenere 1-2 cellule transfettate. Acquisire l&#39;immagine fluorescenza GFP, utilizzando una camera CCD. </li><li> Spegnere la luce microscopio. Rimuovere la scatola-dicroico contenente situato nella via luce. Spegnere la luce di eccitazione e chiudere al buio-box per la completa oscurità. </li><li> Profumato cellule a 5-10 ml / min con HBS medie, con o senza soluzioni di test pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Cattura immagini emissioni fotoniche ogni 10 sec con una macchina fotografica conteggio di fotoni maneggiato con un processore di immagine. </li><li> Al termine di ogni esperimento, permeabilize cellule con 0,1 mM digitonina in 10 mM CaCl 2 in HBS per liberare tutti i rimanenti emissioni fotonici. Nota: Queste emissioni fotoniche devono essere sommati al fine di stimare le emissioni totali fotonici, un valore richiesto per la calibrazione di Ca 2+ concentrazioni &lt;./ li&gt; <li> Conservare immagini bioluminescenza nel computer l&#39;immagine di fluorescenza GFP associata con catturati prima di imaging conteggio dei fotoni. </li></ol></li><li> Analisi di immagini bioluminescenza riflettono mitocondriale [Ca 2+]. <ol><li> Quantificare le emissioni fotoniche utilizzo di software specifici. Emissioni fotonici possono essere convertiti mitocondriale Ca 2+ libera concentrazione ([Ca 2+] mit) utilizzando l&#39;algoritmo descritto da Brini et al. 15. </li><li> Aprire l&#39;immagine fluorescenza GFP esperimento e. Seleziona regioni di interesse (ROI) con l&#39;ausilio di software specifici disegnando la forma delle cellule trasfettate secondo le immagini di fluorescenza catturate all&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Incollare le stesse ROI su ogni immagine. Totale emissioni fotoniche in ogni ROI sono calcolate con un software specifico per ottenere il valore di emissione di luminescenza (L) per ogni cella in ciascun punto nel tempo. </li><li> Sommate tutte le emiss fotonicaioni nelle immagini bioluminescenza, compresi quelli ottenuti dopo digitonina permeabilizzazione, utilizzando il software specifico, per ottenere un&#39;immagine bioluminescenza contenente tutte le emissioni fotonici. </li><li> Valore delle esportazioni di emissioni fotonici per ogni regione di interesse per un software specifico per i calcoli. Per fare questo, fare clic su &#39;grafico&#39;, al fine di calcolare i valori bioluminescenza per ogni ROI in ogni momento. Seleziona &#39;valore totale&#39; e &#39;usare il ROI corrente a tutte le immagini. Premere &#39;Calcola&#39;. Salvare il &#39;txt.file&#39; ed esportare i dati di un foglio di lavoro. Per ogni ROI, [Ca 2+] mit è calcolato utilizzando il seguente algoritmo: [Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; dove, R = [L / (totale λ L)] 1 / n L è la luminescenza emessa al momento della misurazione in ciascuna regione di interesse. L totale èla luminescenza totale rimanente dopo l&#39;aggiunta dei conteggi presenti nel tessuto in quel momento al momento della misurazione per ciascuna regione di interesse. λ, K TR, K e R n sono costanti i cui valori dipendono combinazione di equorina (wild type o mutato) e coelenterazin utilizzato (wild type o tipo n) e la temperatura 16 registrazione. Per la combinazione qui utilizzato (mutato AEQ e coelenterzine n), a 37 ° C, abbiamo utilizzato i seguenti valori: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165.6 x 10 3, n = 1.204 e λ = 0,138. </li></ol></li><li> Effettuare i calcoli corrispondenti per stimare la dimensione degli aumenti di bioluminescenza in risposta ad ogni stimolo utilizzando un&#39;analisi dei dati adatto e grafici software. </li></ol>

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None of the authors have competing interests or conflicting interests.

La ristrutturazione di Ca 2+ intracellulare omeostasi nel cervello che invecchia è stata collegata alla perdita cognitiva, aumentata suscettibilità alle ischemico danni, eccitotossicità e neurodegenerazione. Per studiare questa ipotesi in vitro, le procedure di imaging Ca 2+ sono disponibili. Purtroppo, colture vitali di vecchi neuroni dell&#39;ippocampo non sono affidabili. Recentemente, è stato osservato che le culture a lungo termine di ratto hippocampal neuroni presenti molte delle...

Eccitotossicità è uno dei meccanismi più importanti che contribuiscono a danno neuronale e la morte cellulare in insulti neurologici quali ischemia, e in alcune malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer 1. Questo tipo di neurotossicità è mediato principalmente da glutammato agisce su Ca 2+ -permeable, recettori ionotropici NMDA (NMDAR) 2. L&#39;esposizione di neuroni in coltura per il glutammato può portare a eccitotossicità 3, che provoca l&#39;apoptosi neuronale 4. Noi e altri abbiamo già riferito che la vulnerabilità neuronale all&#39;apoptosi NMDA indotta può cambiare con lo sviluppo in vitro e l&#39;invecchiamento 5-8. È ampiamente accettato che un aumento del libero citosolico Ca 2+ concentrazione ([Ca 2+] cyt) porta all&#39;attivazione cellule. Tuttavia, se questo aumento è troppo alta e / o di sostegno sufficientemente, può innescare la morte cellulare 9. Inoltre, è stato propostoeccitotossicità che richiede Ca 2+ mitocondriale assorbimento 10, poiché il trattamento con neuroni neuroni protette contro disaccoppiatore mitocondriale indotta da glutammato morte cellulare 11. Se mitocondri occupano troppo Ca 2+, l&#39;apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale può verificarsi, che porta al rilascio del citocromo c ed altri fattori pro-apoptotica, e inducendo apoptosi. Abbiamo recentemente dimostrato che questo mitocondriale Ca 2+ assorbimento è direttamente correlata alla suscettibilità età-dipendente per eccitotossicità, misurando direttamente NMDA indotta mitocondriale Ca 2+ uptake in singoli neuroni ippocampali 5, un metodo che viene riportato in questo articolo. L&#39;ippocampo, coinvolto in processi fisiologici, come l&#39;apprendimento, la memoria e altri processi cognitivi 12, è altamente vulnerabile a invecchiamento e malattie neurodegenerative 13. E &#39;stato proposto che, dopo diverse settimane in vitro, coltaneuroni ippocampali mostrano una serie di caratteristiche tipiche di neuroni dai 14. Di conseguenza, colture di neuroni dell&#39;ippocampo a lungo termine possono fornire un modello globale per indagare Ca 2+ meccanismi mediata di una maggiore eccitotossicità nell&#39;invecchiamento. L&#39;obiettivo generale del metodo presentato è, quindi, di indagare i cambiamenti sostanziali nel intracellulare di Ca 2+ omeostasi o Ca 2+ rimodellamento nel cervello di invecchiamento tra cui il differenziale Ca 2+ risposte indotte da agonisti del recettore NMDA in una prospettiva a lungo termine colture di neuroni dell&#39;ippocampo . Il metodo comprende una descrizione dettagliata della cultura di neuroni ippocampali di ratto e il monitoraggio di citosolici e mitocondriali Ca 2+ concentrazioni da fluorescenza e l&#39;imaging bioluminescenza in singoli neuroni rispettivamente. Imaging di fluorescenza di citosoliche Ca 2+ in neuroni in coltura è una procedura standard. Tuttavia, questo metodo è meno affidabile per subcellulare Ca 2+ misure tra cui mitocondriale Ca 2+. Le ragioni di questa includono la mancanza di una corretta mirati sonde sintetiche e affinità inadeguato per Ca 2 + concentrazioni che possono cambiare nei mitocondri dal livello di micron basso anche per il livello di mm. L&#39;utilizzo di Ca 2+ sonde a base di proteine ​​come ad esempio equorina, ha permesso di organelli subcellulari di targeting e l&#39;utilizzo di derivati ​​diversi Ca 2+ affinità utilizzando diversi coelenterazines o sonde mutanti privi specifico Ca 2+ siti di legame 15. In questo modo, bioluminescenza di cellule che esprimono equorina mitocondri mirati può consentire il monitoraggio dei mitocondriali di Ca 2+ concentrazioni in singoli neuroni. Tuttavia, questa procedura può richiedere l&#39;uso di macchine fotografiche di conteggio di fotoni o telecamere CCD ultrasensibili per bioluminescenza 16-18. Questo metodo può produrre nuovi risultati che dovrebbero essere confermata in più establmodelli mentata invecchiamento del cervello come, ad esempio, fette di cervello da vecchi animali.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal Culture Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS medium</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F-12 medium</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (from bovine pancreas)</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>12 mm glass coverslips</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>4-well multidish plaques</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Petry dishes</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite ilumination system</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER fluorescence camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM photon counting CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8 valve controller</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B heating system&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquacosmos Software</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

Suscettibilità alla morte cellulare dei neuroni associati alla neurodegenerazione e ischemia sono estremamente aumentata nel cervello invecchiato ma meccanismi responsabili sono mal noti. Eccitotossicità, un processo che si ritiene di contribuire al danno dei neuroni indotta da entrambe le ingiurie, è mediata da attivazione dei recettori del glutammato che promuove Ca 2+ afflusso e mitocondriale sovraccarico di Ca 2+. Un cambiamento sostanziale intracellulare di Ca 2+ omeostasi o ristrutturazione di Ca2 + intracellulare omeostasi può favorire danno neuroni in vecchi neuroni. Per indagare Ca 2+ rimodellamento nell&#39;invecchiamento abbiamo usato l&#39;imaging cellulare dal vivo in colture a lungo termine di neuroni di ratto dell&#39;ippocampo che assomigliano per alcuni aspetti neuroni in vivo di età. Per questo fine, cellule dell&#39;ippocampo sono, in primo luogo, al momento disperso dalle nuove ippocampi di ratto nato e placcato su vetrini rivestiti, vetro poli-D-lisina. Poi culture sono tenuti in media controllati per diversi giorni o più weeks per indagare giovani e vecchi neuroni, rispettivamente. In secondo luogo, neuroni in coltura sono caricati con fura2 e sottoposti a misure di concentrazione citoplasmatica di Ca 2+ utilizzando digitale rapporto imaging di fluorescenza. In terzo luogo, neuroni in coltura sono trasfettate con plasmidi che esprimono un tandem di bassa affinità equorina e GFP mirata ai mitocondri. Dopo 24 ore, equorina all&#39;interno delle cellule viene ricostituito con coelenterazine e neuroni sono sottoposti ad immagini bioluminescenza per il monitoraggio della concentrazione di Ca2 + mitocondriale. Questa procedura in tre fasi permette di monitorare citosolica e mitocondriale Ca 2+ risposte agli stimoli rilevanti come ad esempio l&#39;agonista del recettore del glutammato NMDA e confronta se queste ed altre risposte sono influenzati da invecchiamento. Questa procedura può produrre nuove intuizioni su come l&#39;invecchiamento influenza citosolica e mitocondriale risposte Ca 2+ agli stimoli selezionati, nonché la sperimentazione di farmaci selezionati volti a prevenire cella neuronemorte in malattie legate all&#39;età.

Qui si descrive un metodo semplice per valutare Ca 2+ rimodellamento e gli effetti di NMDA sulla citosolica e mitocondriale [Ca 2+] nei neuroni età. La figura 1 mostra lo schema del procedimento per l&#39;isolamento e la coltura neuroni ippocampali di ratti neonati. Prima di iniziare, abbiamo bisogno di preparare sterili, rivestiti, vetrini poli-D-lisina e localizzarli in un piatto 4-bene. Poi, ratti neonati vengono uccisi e il cervello rimossi. Dopo aver isolato l&#39;ippocampo, ...

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K Views.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

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Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Ricerca

Neuroscienze

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These amyloid fibrils can sequester endogenous metastable proteins as well as components of the proteostasis network (PN) and thereby exacerbate protein misfolding in the cell. There are a limited number of tools available to assess the aggregation process of amyloid proteins within an animal. We present a protocol for fluorescence lifetime microscopy (FLIM) that allows monitoring as well as quantification of the amyloid fibrilization in specific cells, such as neurons, in a noninvasive manner and with the progression of aging and upon perturbation of the PN. FLIM is independent of the expression levels of the fluorophore and enables an analysis of the aggregation process without any further staining or bleaching. Fluorophores are quenched when they are in close vicinity of amyloid structures, which results in a decrease of the fluorescence lifetime. The quenching directly correlates with the aggregation of the amyloid protein. FLIM is a versatile technique that can be applied to compare the fibrilization process of different amyloid proteins, environmental stimuli, or genetic backgrounds in vivo in a non-invasive manner.

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescence lifetime imaging monitors, quantifies and distinguishes the aggregation tendencies of proteins in living, aging, and stressed C. elegans disease models.

Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Biochimica

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Comportamento

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Biologia dello sviluppo

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca

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