This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.

Vitro Tahlili: 1. Bir Kararlı SH-SY5Y Hücre Line algılama SERCaMP Yayın <ol><li> Levha SH-SY5Y-glukozit-ASARTDL (SERCaMP) doku kültürü içinde yüzey alanının cm2 başına 150.000 hücre plakaları işlemden geçirildi. 96 oyuklu plakalar için, örneğin, 50,000 hücre, oyuk başına (Şekil 1A) tohum. DMEM (yüksek glukoz, GlutaMAX, piruvat) +,% 10 büyükbaş hayvan büyüme serumu + 1 x penisilin / streptomisin SH-SY5Y hücreleri büyütün. <ol><li> 15 kez (Şekil 1B) kadar Passage hücreleri. Yüksek geçit numarası test edilmemiştir. </li><li> % 5.5 CO2 ile 37 ° C &#39;de nemlendirilmiş inkübatör hücreleri dönün ve gece boyunca inkübe edilir. </li></ol></li><li> Deneysel tedavi (ler) önce, iyi bir opak kültür süpernatant 5 ul aktararak her biri için bir temel numune toplamak 96 plaka duvarlı. Toplama önce, hafifçe her tarafta plaka dokunun ve degrade etkileri önlemek için girdap. Yapışkan bir s ile opak plaka Sealenzimatik analiz zamanına kadar 4 ° C&#39;de ealing tabaka ve saklayın. Not: Salgılanmış glukozit-SERCaMP hücre kültür ortamı içinde çok kararlıdır. Daha önce glukozit aktivitesinin yaklaşık% 5-10 (SH-SY5Y hücreleri üzerinde inkübe) 37 ° C&#39;de 12 bir 72 saat inkübe edildikten sonra kaybolur bildirilmiştir. </li><li> ER kalsiyum tükenmesi incelemek için arzu edildiği gibi (örneğin çevre, farmakolojik, genetik manipülasyonlar) hücreleri davranın. Hızla atmosferik CO 2 de oluşacak pH değişiklikleri olarak (kontrollü inkübatör dışında) çevre ortama uzun maruz kalmaktan kaçının. Uzun süreli manipülasyonlar gerekli ise, pH değeri 14 stabilize edilmesi için, 20 mM kültür ortamına HEPES ekleyin. Kültür ortamında 15 HEPES kullanırken ışığa maruz kalmaktan kaçının. <ol><li> Pozitif kontrol: SH-SY5Y hücrelerinde deneyler için 4-6 saat boyunca 100 nM thapsigargin (Tg) ya da 50 uM siklopiazonik asit (CPA) ve hücreleri tedavi edin. Diğer hücre hatlarında maksimal tepkisi uzun inkubasyon ya da farklı yoğunlaştırma gerektirebilirBileşiklerin, yerel yönetim bu. </li><li> Negatif kontrol: Ebeveyn SH-SY5Y hücrelerinin topla kültür ortamı. Deneyimlerimize göre, bu deneyde arka plan lüminesans stabil SH-SY5Y-glukozit-SERCaMP hücreleri bazal salgılama az% 0.05. </li></ol></li><li> Adım 1.2&#39;de belirtildiği gibi, istenen zaman noktalarında toplayın ve klimalı ortamın mağaza 5 ul örnekleri. </li><li> Bölüm 5&#39;te belirtildiği gibi orta enzimatik aktivitesini değerlendirmek. </li><li> Immunoblot veya lüminesans deneyi ile hücre içi glukozit inceleyin. <ol><li> 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl,% 0.25 sodyum deoksikolat, 1 mM EDTA,% 1 NP40 içeren değiştirilmiş RIPA tamponunda lize hücreleri ve proteaz inhibitörleri: immünoblot için. 0,20 um PVDF membrana SDS-poliakrilamid jeli ve transfer ayrı. (: 2000 seyreltme 1) gece boyunca 4 ° C&#39;de glukozit antikor ile membran inkübe edin. Seçim tespiti ayıraç için kullanıcı tanımlı protokole göre sekonder antikor inkübasyon ve membran yıkar gerçekleştirin. </li><li> Nedeniylelüminesans tahlil (Şekil 2): buz üzerinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin: <ol><li> Bir doku kültürü plakasının gözeneklerine tüm orta çıkarın ve soğuk 200 ul PBS ile yıkayın. </li><li> Her bir oyuğa 50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl,% 1 NP40 ihtiva eden liziz tamponu ve proteaz inhibitörlerinin 75 ul ekle. </li><li> 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir orbital çalkalayıcı (120 rpm) üzerine plaka döndürün. </li><li> Yavaşça yukarı ve çok kanallı pipet kullanarak hava kabarcıkları kaçınarak aşağı lizat pipetle. Opak plaka lizat 5 ul aktarın ve Bölüm 5&#39;te belirtildiği gibi lüminesans değerlendirmek. </li></ol></li></ol></li></ol> İn Vitro Tahlili: 2. SERCaMP ölümsüzleştirilmiş Hücreler geçici transfeksiyonu Not: geçici transfeksiyon prosedürleri hücresel strese neden olabilir ve daha sonraki glukozit-SERCaMP yanıtı künt olduğunu gözlemledik. Aşağıdaki yaklaşım transfeksiyon eff en aza indirmek için geliştirildi<html> SH-SY5Y hücrelerinde ects. Alternatif hücresi soyları (transfeksiyon reaktifi seçimi de dahil olmak üzere), bu prosedürün optimize edilmesi gerekli olabilir. Mümkün olduğunda, bu sırasıyla Bölüm 1 ve 3 de tarif kararlı hücre kuşaklarının ya da viral transdüksiyon yöntemleri kullanmak tavsiye edilir. <ol><li> 4 x 10 6 hücre, bir 100 mm çanak Levha SH-SY5Y hücreleri. Bu bulaşık transfeksiyon prosedürü izleyerek yaklaşık 300 kuyu (96 oyuklu plaka formatı) tohum yeniden için yeterli olacaktır. </li><li> Xfect plazmid DNA 20 ug (kodlayan glukozit-SERCaMP) ile reaktif ve Xfect reaktifi 6 ul Transfect hücreleri. Büyük veya daha küçük kültür hazneleri göre ölçekli DNA and Xfect reajanı. </li><li> 48 saat boyunca inkübatör hücreleri dönün. </li><li> Hücreleri tripsinize edin ve oyuk başına 60,000 hücre olacak şekilde 96 oyuklu plakalara reseed. Bölüm 1&#39;de özetlenen sonraki adımları izleyin. </li></ol> İn Vitro Tahlili: 3. Viral vektör aracılı İfade glukozit-SERCaMP tert &quot;&gt; Not: Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü ambalaj 16 ve arıtma için 12 ve lentivirüs üretimi 13, daha önce rapor edilmiştir. <ol><li> Titer glukozit-SERCaMP AAV aşağıdaki primerler ve problar kullanılarak: ileri primer, 5&#39;-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 &#39;; ters primer, 5&#39;-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 &#39;; Prob (5&#39;-6-FAM / BHQ-3&#39;-1 etiketli) kantitatif PCR için, 5&#39;-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 &#39;. <ol><li> Glukozit içeren bir plazmid linnerleştirilmesi ve spin-kolon (örn Machery-Nagel NucleoSpin Jel ve PCR temizleme) kullanılarak DNA&#39;nın saflaştırılması ile standart eğri hazırlayın. Kütle merdiven birlikte bir agaroz jeli üzerinde ayırarak DNA nicelleştirmektedir. PBS içinde 10 fg / ml aralığındadır 100 ug / DNA 1:10 dilüe. Plazmidin molekül ağırlığına dayalı olarak her bir konsantrasyonunda, glukozit plazmid DNA&#39;nın kopya / ml hesaplanır. </li><li> PBS AAV stokları seyreltin (uygun seyreltme bağlı olacaktırViral hazırlama parametreleri ve) ampirik olarak belirlenir. </li><li> 94 ° C 20 sn ×, 95 ° C x 5 dakika ve 41 çevrim için, 60 ° C x 1 dak:, aşağıdaki koşullar kullanılarak, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde PCR reaksiyonu. Ml standart eğri kullanılarak / kopya hesaplayın. </li></ol></li><li> Bir p24 Lenti-X, hızlı titre kiti ile titre lentivirüs. Buz üzerinde lentiviral alikotları çözülme ve SH-SY5Y ortamında p24 proteini kontrol sulandırmak. <ol><li> Standart eğrinin (: 20,000 ya da 1: 100.000 örneğin 1) düşecek şekilde lentivirüs sulandırmak. Gerekli seyreltme faktörü lentiviral hazırlık parametrelere göre değişir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. Sonraki tüm adımlar için üreticinin talimatlarına uyun. </li></ol></li><li> 96 gözlü plakalara plakası hücreleri. SH-SY5Y hücreleri için, Bölüm 1&#39;de belirtilen kaplama prosedürleri takip edilebilir. Fare birincil kortikal nöronlarda için, hücreler izole edilir ve uygun bir şekilde kaplanmış plakalar, bir üzerine ekildi olmalıdırs, daha önce tarif edilen 16. 1x B27 ve 500 uM L-glutamin ile takviye edilmiş ortam içinde Neurobasal sıçan birincil kortikal nöronlar koruyun. Her gün yarım orta alışverişi yapın. </li><li> Virüs hücreleri nakletmek. Gaussia lusiferaz güçlü bir sinyal sağlar viral transdüksiyon hedefi, düşük düzeyde ekspresyonunu elde etmektir. <ol><li> AAV transdüksiyon SH-SY5Y hücreleri: kaplama ertesi gün transdüse. AAV seyreltme tamponu (PBS + 0.5mm MgCl2) 6.0 x 10 7 vg / ul AAV sulandırmak. (, Yaklaşık 6000 arasında MOI 3.0 x 10 8 vg) 96 oyuklu bir plaka (Şekil 3A) oyuk başına seyreltilmiş AAV 5 ul ekleyin. Viral vektör atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın. </li><li> Sıçan primer kortikal nöronların AAV transdüksiyon: kaplama sonrası 6-8 gün transduce. AAV seyreltme tamponu 4.0 x 10 6 vg / ul AAV sulandırmak. Seyreltilmiş AAV&#39;nin 5 ul ekleyin (2.0 x 10 7 VG, İçişleri Bakanlığı, yaklaşık 350) oyuk başına96 gözenekli bir plaka (Şekil 3B). Optimal MOI diğer hücre tipleri için ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. Viral vektör atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın. </li><li> SH-SY5Y hücrelerinin lentiviral transdüksiyon: kaplama ertesi gün transdüse. Hank dengeli tuz çözeltisi içinde (konsantrasyon titerleme kiti kullanılarak belirlenen) 20 pg / ml için, p24 lentivirüs seyreltin. 100 ul hacimde 96 oyuklu bir plakanın (1.250.000 lentiviral parçacıklara eşdeğerdir p24 100 ug, veya ~ 1250 IFUs) oyuk başına seyreltilmiş virüs 5ul ekleyin. Büyük biçimleri için buna göre ölçeklendirin. Viral atık inaktive% 10 çamaşır suyu kullanın. </li></ol></li><li> Ortamının bir ön-işleme örneği toplamak ve deneysel tedavi 48 saat (SH-SY5Y) ya da transdüksiyon sonra 5-7 gün (sıçan primer kortikal nöronlar) başlar. </li></ol> Vivo SERCaMP Tahlili 4. Not: herhangi bir hayvan prosedürleri kurum aracılığıyla uygun onay almak için emin olun gerçekleştirmeden önce. Hepsihayatta kalma ameliyatlar yeterli anestezi ile steril koşullar altında yapılması için vardır. Aşağıda açıklanan tüm prosedürler onaylanmış ve NIH ACUC kurallarına uygundur oylandı. <ol><li> Otoklav cerrahi aletler cerrahi başlatmak için önce (121 ° C, 30 dakika sterilizasyon, 20 dakika kuruma süresi). Hemen tüm prosedürler ve önceki otoklav aşağıdaki bir ultrasonikatör tüm enstrümanları temizleyin. Sağkalım ameliyat sırasında steril koşullar koruyun. Birden hayvanları gerektiren ameliyatlar için,% 70 alkol, ultrasonicate ve boncuk sıçanlarda arasında sterilize ile cerrahi aletler silin. Gerekli aletleri Malzeme Listesine bakınız. </li><li> Ameliyat için, sıçan hazırlayın. Burada Erkek Sprague-Dawley (180-200 g) kullanın. <ol><li> Ksilazin (8 mg / kg) ve ketamin (/ kg ile 80 mg), intraperitonal enjeksiyonlar izledi 3 dakika boyunca (4-5% Isoflurane 1000 cc / dakika verilir) gaz izofluran kullanılarak sıçan anestezisi. Kurumasını kornealar korumak için oftalmik merhem sürün. Bkuyruk veya ayak tutam aşağıdaki çekme refleksi eksikliği gösterdiği gibi sıçan kez Eğin cerrahi derin anestezi olduğunu. </li><li> Biraz orta karın bölgesine kaburga (düşük göğüs bölge) altında karın bölgesini tıraş. Cerrahi parkı% 70 alkol ve Betadinede fırçalayın alternatif üç kez, fırçalayın. Steril cerrahi örtüler ile steril cerrahi alanda yatar pozisyonda sıçan yerleştirin. </li></ol></li><li> 7,6 x 10 9 vg / ml (son konsantrasyon) &#39;daki AAV-glukozit-SERCaMP seyreltilir. Tersine tüp iyice karıştırın. Not: viral konsantrasyon aralığı (Şekil 4) değişebilir. <ol><li> Pipet steril kap içine seyreltildi AAV 105 ul. Bir şırınga içine virüs toplamak için 30 iğne kullanın. </li></ol></li><li> AAV-glukozit-SERCaMP karaciğer ortaya çıkarmak ve enjekte etmek ameliyat. <ol><li> Önceki karın bir kesi yapmadan, insizyon alanı% 0.25 bupivakain uygulayın. Bir neşter kullanılarak, göğüs kafesinin altında yatay bir kesi (ap yapmakproximately 2-3 cm). Hipodermis gelen bağ dokusu ayırmak için disseke künt. </li><li> Karaciğer sağ lobunu medial açığa karın kası kesti. Not: Diğer loblar son uygulamaya göre enjekte edilebilir. </li><li> Cerrahi mikroskop altında hayvan koyun ve görüş alanında karaciğer sağ lobunu medial almak için ayarlayın. Medial lob parankimi içine virüs enjekte; 3 ayrı siteler, site başına yaklaşık 33 ul. Not: Tüm enjeksiyon hacminin teslim edilmesini sağlamak için enjeksiyonu takiben 5-10 saniye dokuda iğne bırakın. </li><li> Ayrı ayrı karın kas ve cilt sütür ve pamuk uçlu aplikatör kullanarak Neosporin ekleyin. Bilinç kazanmış ve sıçan dik pozisyonunu koruyabiliyor kadar bir iyileşme odasında sıçan yerleştirin. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sıçan (ler) gözetimsiz bırakmayın. Ev tek başına kesi iyileşene kadar ve dikişler (7-14 gün) kaldırılmıştır. <br/&gt; Not: NIH ameliyat sonrası kurallar gereği, cerrahi kaydını tutmak. Prosedür, tarih, deney tanımlayıcısı, vücut ağırlığı ve cerrahi gününde kafes kartı açıklama. Ağrı / sıkıntı, dışkı üretim, aktivite, gıda ve su tüketimi izlenir ve 3 gün sonrası ameliyat kayıt altına alınmaktadır. Biz genellikle cerrahi sonrası ağrı veya sıkıntı belirtileri gözlemlemek olmamasına rağmen Post-operatif analjezi içme suyu (450 mg / 100 cc) asetaminofen eklenerek sağlanır. </li></ol></li><li> 4-7 gün enjeksiyonundan sonra kuyruk kan toplama başlayın. Etiketleme ve ön tartarak kan alma tüpleri hazırlayın. Her tüpe 50 ul heparin (1000 U / ml) eklenir. </li><li> (1000 cc / dak teslim% 4-5 İsofluranın) 3 dakika boyunca izofluran anestezi odasına yerleştirin sıçan. (500 cc / dak teslim% 2-3 İsofluranın) burun konisi odasından ve yerden sıçan çıkarın. Kuyruk pi aşağıdaki çekme refleksi eksikliği ile gösterildiği gibi kan toplama sıçan derinden uyuşturulduktan sonra başlayabilirnch. <ol><li> Steril makas kuyruk (1-2 mm) kesilerek ucu kullanarak ve önceden doldurulmuş heparin tüp içine damla damla kan toplamak. Heparin oranı (&gt; 100 ul kan / 50 ul heparin) 1 kan: hacim 2&#39;den büyük ulaşana kadar kan toplayın. Kan alma hacimleri deneysel tasarım dayalı olarak ayarlanabilir. Kanamayı durdurmak için kuyruk kanamayı durdurucu pudra uygulamak için ıslak pamuk aplikatör kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın kan tüpleri sonraki örneklerin toplanması durumunda. Koleksiyonlar arasında sterilize etanol pedi ve boncuk ile makas silin. </li><li> Toplama tüpleri tartılır ve 2 elde heparin ile ayarlayın: 1 oranını (kan: heparin). Bu adım, her bir örnek (Tablo 1) &#39;de heparin miktarını normale olacaktır. </li><li> Santrifüj tüpleri 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de. Lusiferaz deneyi (bölüm 5) zamanına kadar -80 ° C taze tüp ve saklamak için yüzer (plazma) aktarın. Not: 72 saat kadar önce, enzimatik deney için 4 ° C&#39;de numunelerin depolama &#39;ye sahiptirlüminesans (Şekil 5A) üzerinde inimal etkisi. Plazma numunelerinin 3 kadar donma-çözülme döngüsünden lüminesans üzerinde etki göstermemiştir (Şekil 5B) sahiptir. </li></ol></li><li> Thapsigargin uygulama (pozitif kontrol): <ol><li> 2.5 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar etanol içinde seyreltilerek thapsigargin hazırlayın. Alt karın içine 1 mg / kg ip thapsigargin enjekte edilir. Not: thapsigargin trombine bağlı platelet pıhtılaşmasını 17 artar ve daha zor kuyruk kan alma yapabilir. </li></ol></li><li> Gaussia lusiferaz deneyi: <ol><li> Buz üzerinde plazma örnekleri çözülme. Uzunlamasına çalışmalarda, çözülme için ve (alt tabakanın tek hazırlık kullanarak) aynı gün tüm timepoint örnekleri için ışıldama tahlil gerçekleştirin: Not. </li><li> Opak duvarlı plaka transfer plazma 10 ul ve kesit her bir plazma numunesinin 5. Çalışma 3-4 teknik çoğaltır tarif edildiği gibi enzimatik aktivitesini ölçmek. </li></ol></li><li> Euthanasibir Not: SERCaMP teknolojinin avantajı monitör ER kalsiyum uzunlamasına yeteneğidir. Deneysel parametreleri ve son nokta analizleri bağlı hayvanlar son nokta analizleri için uygun ve kurumsal ACUC kurallarına uygun önlemler ötenazi edilmelidir. </li></ol> 5. Lüminesans Deneyi <ol><li> 20 mM (3 ml metanol, 10 N HCI 30 ul) ile asitleştirildi, metanol içinde bir bileşik seyreltilmesiyle coelenterazine (CTZ) stok çözelti hazırlayın. -80 ° C tek kullanımlık alikotları ve mağaza hazırlayın. </li><li> Deney gününde çalışan alt-tabakanın hazırlanması. <ol><li> In vitro değerlendirmeler için, örneğin, PBS içinde 8 uM koelenterazin seyreltik PBS, 25 ml 20 mM CTZ stokunun 10 ul (Şekil 6A, B). </li><li> İn vivo deneyler için, PBS içinde 100 uM, 500 mM askorbik asit, 5 mM NaCl koelenterazin seyreltin. </li></ol></li><li> En az 30 dakika süreyle inkübe edin hazırlanan CTZtahlili başlamadan önce oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Not: hazırlanması sonra ilk 30 dakika boyunca hızlı bir şekilde alt-tabaka çürüme çalışma vardır Bu adım genellikle Gaussia lusiferaz analizleri dahildir. Bizim sistemde (Şekil 6C) bu etkiyi gözlenen değil; Biz tahlil üzerinde hiçbir olumsuz etkisi bulduk gibi ancak, biz sık sık kuluçka aşamasını içerir. </li><li> İzleme biyolüminesans edebilen bir alt-tabaka enjektör ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak. Substrat ile Başbakan hatları. Not: hatları üzerinden, ilk alt-tabaka bozunmaya eğilimli olabilir. Erken örnekleri için yapay olarak düşük okumaları önlemek için deneysel örnekleri ölçümünden önce (okuyucu boş bir levha yüklenmesi) 20-30 boş kuyu enjekte edilir. </li><li> , Kuyunun içine substrat 100 ul enjekte 5 saniye boyunca orta hız sallamak ve ışık emisyon ölçümü. Biotek Sinerji II plaka okuyucu için, (0.5 sn boyunca (in vitro örnekleri) ve 5 saniye ışık emisyonu entegreokuma adımı için in vivo örnekleri). İdeal tahlil performansı için plaka okuyucu parametrelerini optimize. Not: (diğer lusiferazlarm gözlenen kinetik kızdırma karşılaştırıldığında) hızlı sinyal çürümesi ile Gaussia lusiferaz sergiler flaş kinetiği. Glukozit flaş kinetiği örnekleri arasında, orta bileşimin kontrol edilmesinin önemini vurgular hücre kültür ortamı (Şekil 7A) serum etkilenir. Nedeniyle alt tabaka (flaş kinetik) eklendikten sonra lüminesans hızlı çürüme, enjekte ve tüm örnekler için üniform olmalıdır adımları okumak arasında zaman. Plaka okuyucu (biz 5 sn sallamak adımı kullanmak gibi) ve bu iyi okumak sabit bekleme süresi, bir kuyunun alt tabakayı enjekte ayarlanmalıdır. Alt-tabaka, aynı anda tüm oyuklara ilave edilebilir sürece okumadan önce bütün bir plaka alt-tabakanın eklenmesi önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bir enjektör kullanılabilir durumda değilse, sorunu kısmen alt-tabaka addin arasında 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırılarak atlatılabiliryon ve ölçüm (Şekil 7B) (böylece bozulma eğrisinin dik parçası kaçınarak). </li><li> , Enjeksiyon Tekrar bekleme süresi ve iyi plaka üzerinde her adımları okuyun. </li></ol>

<ol>
	<li>Sitia, R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum+protein+factory.">Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory.</a> Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).</li><li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function.">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).</li><li>Fu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+lipid+metabolism+disrupts+calcium+homeostasis+causing+liver+endoplasmic+reticulum+stress+in+obesity.">Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity.</a> Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).</li><li>Micaroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcium+in+intracellular+trafficking.">The role of calcium in intracellular trafficking.</a> Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).</li><li>Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic-reticulum+calcium+depletion+and+disease.">Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+probes+for+measurement+of+intracellular+calcium.">Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium.</a> Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).</li><li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+class+of+sensors+to+monitor+Ca2++dynamics+in+high+Ca2++concentration+cellular+compartments.">Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).</li><li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2++analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor.">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).</li><li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intraorganellar+Ca2++at+subcellular+resolution+using+CEPIA.">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nat Commun. 5, 4153 (2014).</li><li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum.">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).</li><li>Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCaMP:+a+carboxy-terminal+protein+modification+that+enables+monitoring+of+ER+calcium+homeostasis.">SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis.</a> Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).</li><li>Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesencephalic+astrocyte-derived+neurotrophic+factor+(MANF)+secretion+and+cell+surface+binding+are+modulated+by+KDEL+receptors.">Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors.</a> J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).</li><li>Shipman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic+acid+(HEPES)+as+a+tissue+culture+buffer.">Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine&#235;thanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).</li><li>Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cytotoxic+effects+of+light-exposed+HEPES-containing+culture+medium.">Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).</li><li>Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+and+toxicity+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1,+2,+5,+6,+7,+8,+and+9+in+rat+neurons+and+glia+in+vitro.">Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro.</a> Virology. 372 (1), 24-34 (2008).</li><li>Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thapsigargin+amplifies+the+platelet+procoagulant+response+caused+by+thrombin.">Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin.</a> Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Sobrevals, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors+transduce+hepatocytes+in+vivo+as+efficiently+in+cirrhotic+as+in+healthy+rat+livers.">AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers.</a> Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+transduction+by+double-stranded+adeno-associated+virus+vectors+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).</li><li>Seppen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+serotypes+mediate+sustained+correction+of+bilirubin+UDP+glucuronosyltransferase+deficiency+in+rats.">Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats.</a> Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).</li><li>Hareendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+gene+therapy:+immune+challenges+and+strategies+to+circumvent+them.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them.</a> Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, in vitro vurgular ve glukozit-SERCaMP in vivo programı ER kalsiyum tükenmesi izlemek için. SERCaMP oluşturmak için protein modifikasyonu, diğer raportör protein 12 genelleme gibi görünüyor olsa da, biz diğer lusiferazlarm 18 oranla sağlam (200-1,000 kat daha büyük) biyoparlaklık için Gaussia lusiferaz seçti. Primer sıçan kortikal nöronlarında, SH-SY5Y hücrelerinin ve sıçan karaciğer teslim glukozit-SERCaMP virüsünün 100 ka...

Endoplazmik retikulum (ER) 1 sinyalizasyon protein katlanması, protein salgılanması, lipid homeostazı ve intraselüler dahil olmak üzere birçok hücresel kapasitelerde çalışır. Normal ER işlevine Merkez ~ 5000 kez luminal kalsiyum konsantrasyonlarını sitoplazma 2-4 bulunanlar sürdürmektedir. Bu enerji yoğun bir süreç Sarko / endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA), ER içine kalsiyum iyonlarını hareket eden bir pompa tarafından düzenlenir. ER kalsiyum bir akış esas olarak riyanodin (RyR) ve inositol trifosfat (IP3R) reseptörleri tarafından aracılık eder. Birçok ER işlemler kalsiyum bağımlı olduğundan, mağaza kesintiye ER stres ve sonuçta hücre ölümüne neden olabilir. ER, kalsiyum disregülasyon, kardiyomiyopati, diyabet de dahil olmak üzere, Alzheimer hastalıkları gözlenmiştir, ve Parkinson 5. Bu hastalıkların ilerleyen doğası nedeniyle, bir sebep-sonuç yeniden çizmek için zorlu olmuşturER kalsiyum deposunda patogenezi ve değişiklikler arasında lationship. Teknolojilerin bir dizi boyalar ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) dahil ER kalsiyum dinamikleri, anlayışımızda önemli gelişmeler için izin vermiş. Ca2 + bağlandığmda floresanstaki artış, düşük afinite kalsiyum boyalar, kalsiyum 6 konsantrasyonu yüksek olan hücre içi bölmelere incelemek için hücrelere yerleştirilebilir. Böyle D1ER ve Catcher olarak geçiş, subsellüler lokalizasyonu 7-9 daha hassas kontrolü ile kalsiyum dalgalanmaların izlenmesi için izin verir. Son zamanlarda, geçiş bölgesinin bir başka sınıfı olarak adlandırılır kalsiyum ölçüm organel tutulmuş protein göstergeleri (CEPIA) 10 tarif edilmiştir. Genetik ve birleştiren üçüncü bir yaklaşım küçük moleküllü kimya hedeflenen esteraz boya yükleme bir ester bazlı kalsiyum boya 11 (ER hedeflenen) genetik olarak kodlanmış karboksilesteraz kullanır (TED). Afor ikenementioned yaklaşımlar da floresan akut ölçümlerle aracılığıyla ER kalsiyum dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir, doğal güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bununla birlikte, çoğu zaman, hastalığın ilerlemesini araştırmak için gerekli boyuna çalışmalar için uygun değildir. Zaman genişletilmiş süreler boyunca kalsiyum dinamiklerini izlemek için bir yöntem oluşturulması amacıyla, biz tespit ve salgılanan ER kalsiyum izleme proteinleri (SERCaMPs) 12 oluşturmak için bir protein modifikasyonu geliştirdi. SERCaMP defalarca ER kalsiyum deposu sorgulamak için minimal invaziv bir yaklaşım sağlayarak, diğer yöntemlerle ilişkili çeşitli sınırlamalar circumvents. Daha önce karboksi-terminal peptit ASARTDL (alanin-serin-alanin-arginin-treonin-aspartik asit-leucine) ER-retensiyon teşvik etmek için yeterli olduğunu göstermiştir; Bununla birlikte, ER kalsiyum düşüşler neden olan koşullar altında, peptid dizisi, artık ER localizatio muhafaza edebilmektedirn ve protein 13 salgılanır. SERCaMP teknoloji temelinde bir salgılanmış proteininin karboksi-terminalinde salgılanması dolayısıyla ER kalsiyum disregülasyonun 12 sağlam bir raportör oluşturma ER kalsiyum azalması ile tetiklenir, bu durumda (örneğin, lusiferaz Gaussia veya glukozit) için ASARTDL bir ek alım düzenidir. Transgenik yöntemlerle glukozit-SERCaMP ekspresyonu ER Kalsiyum homeostazında bir göstergesi olarak glukozit aktivitesindeki değişikliklerin analiz edilmesi için hücre kültür aracı ve plazma da dahil olmak üzere, biyolojik sıvıları sağlar. Yöntem, in vitro ve in vivo olarak ER kalsiyum deposunda progresif değişiklikler uzunlamasına çalışma için uygulamalar vardır. Aşağıdaki protokol ER kalsiyum homeostazını incelemek için glukozit merkezli SERCaMP kullanmak için genel bir taslak olarak yazılır, ama protokol alternatif raportör SERCaMPs için bir rehber olarak hizmet verebilir.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10% NP-40 solution&amp;nbsp;</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td>for intracellular GLuc assays</td></tr><tr><td>1 ml luer-lok syringes</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>200 microliter filter tips</td><td>Rainin</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0 surgical sutures</td><td>Fisher</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>30 G needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-821-13A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive microplate sealing sheets</td><td>Thermo</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol prep pads</td><td>Fisher</td><td>22-246-073</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Auto Flow System</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Animal recovery chamber</td><td>Lyon Vet</td><td>ICU-912-004</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Betadine solution</td><td>Fisher</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bovine growth serum</td><td>Thermo</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine, Native</td><td>Regis Technologies</td><td>1-361204-200</td><td></td></tr><tr><td>Cotton tipped applicators</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Cutting needles 3/8 circle sutures</td><td>WPI</td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>Digital ultrasconic cleaner</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DNA mass ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase (recombinant protein)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8023S</td><td>1:2,000 (WB)</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Gluc assay plates (96 well, opaque)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Styptic powder</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>a452-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R Centrifuge</td><td>Bekman Colter</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Fisher</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel and PCR Cleanup</td><td>Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X rapid titer kit</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>PCR film seal</td><td>Fisher</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>ReFresh Charcoal Filter canister</td><td>E-Z Anesthesia</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades, #10</td><td>Fine Science tools Inc</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>SD rats 150-200 g</td><td>Charles River</td><td>Rats</td><td>rats ordered at 150-200 g.&amp;nbsp; Surgery 5 days after arrival</td></tr><tr><td>Small animal ear tags</td><td>National Band and Tag co</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile surgical drapes</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 plate reader</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>harmful to human health</td></tr><tr><td>Virapower lentiviral packaging mix</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Transfection reagent</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Valley Vet</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring endoplasmic reticulum calcium homeostasis using a gaussia luciferase sercamp

Endoplazmik retikulum (ER) konsantrasyonu yaklaşık sitoplazmik kıyasla daha fazla 5000 misli, hücre içi kalsiyum üst düzeyde bulunmaktadır. ER kalsiyum üzerinde sıkı kontrol protein katlanması, modifikasyonu ve insan ticareti için zorunludur. ER kalsiyum düzensizlikler katlanmamış protein karşılığının bir üç uçlu ER stres tepkisi mekanizmasının aktivasyonu ile sonuçlanan ve hastalıkların çok çeşitli patogenezine katkıda bulunabilir. Hastalık başlangıcı ve ilerlemesi sırasında ER kalsiyum değişiklikleri izleme yeteneği pratikte prensipte önemli, ama zor olduğunu. Kalsiyum bağımlı floresan boyalar ve proteinler gibi izleme ER kalsiyum yönelik güncel yöntemler arasında, ancak bu araçlar, in vivo çalışmalar için uygun değildir, hücrelerde ER kalsiyum dinamiklerinin kazanmasını sağlamıştır. Bizim laboratuvar Gaussia lusiferaz karboksi-terminalinde bir modifikasyon yanıt olarak raportör salgılanmasını sağladığını göstermiştirER kalsiyum tükenmesi. In vitro ve in vivo uygulamaları bir lusiferaz göre, salgılanan ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) kullanmak için yöntemler burada tarif edilmiştir. Bu video ER kalsiyum boyuna izlenmesi için karaciğer enjeksiyonları, glukozit-SERCaMP, kan toplama ve işleme farmakolojik manipülasyon ve tahlil parametrelerini vurgulamaktadır.

Glukozit-SERCaMP yöntemi dışı sıvılar örnekleyerek ER kalsiyum homeostasisin değerlendirilmesi için izin verir. Birkaç kontrol sonuçların yorumlanmasını geliştirmek için deney tasarımı dahil edilebilir. İlk olarak, (C-terminali ASARTDL veya &quot;glukozit-Resim Tag&quot; olmayan, örneğin glukozit) kurucu salgılanmış habercinin kullanılması salgı yoluna (global hücresel sekresyon) ve transgen ekspresyonu üzerindeki deneysel tedavilerin etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP at JoVE.com

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

13.1K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Video: Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biyokimya

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Biyoloji

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

<meta charset="utf8"></head><body>Yüksek Verimli Ekranlar için ER-Mitokondri Kontaklarını Ölçmek İçin Basit Bir Test

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid homeostasis, mitochondrial dynamics, autophagosome and mitophagosome biogenesis, and apoptosis. Failure to maintain normal ER-mitochondrial coupling is implicated in many neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#39;s disease, Parkinson&#39;s disease, amyotrophic lateral sclerosis, and hereditary spastic paraplegia. It is of considerable significance to explore how the dysregulation of ER-mitochondrial contacts could lead to cell death and whether repairing these contacts to the normal level could ameliorate neurodegenerative conditions. Thus, improved assays that measure the level of these contacts could help to illuminate the pathogenic mechanisms of these diseases. Ultimately, establishing simple and reliable assays will facilitate the development of new therapeutic strategies. Here we describe&#160;a split-luciferase assay to quantitatively measure the level of ER-mitochondria contacts in live cells. This assay can be used to study the pathophysiological role of these contacts as well as to identify their modulators in high-throughput screening.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: ER-Mitokondri Temaslarının Düzenlenmesi ve Düzensizliği — Nörodejeneratif Hastalık Patogenezi için Çıkarımlar

We have established a split-luciferase reassembly assay to monitor the endoplasmic reticulum-mitochondria contacts in live cells. Using this assay, we describe a protocol to quantitatively measure the level of these inter-organelle couplings in HEK293T cells, under the condition of chemical treatment.

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Nörobilim

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Virüsle Enfekte İnsan Bağırsağı Organoid Tek Tabakalarının Kalsiyum Görüntülemesi

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Yazar Spotlight: Bağırsak Epitel Sinyalizasyonunun Viral Bozulmasının Araştırılması – Araştırma Öngörüleri ve Gelecekteki Yönergeler 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar^{2 +} ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Yerel Ca^{2 +} sinyalleri membran hedefli Ca^{2 +} göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi