The authors would like to thank Janelle Ryals, Rachel Supple, and Frank Wang for technical assistance. This work was supported by NIH grants R03 DK080182 (JAC), R01 DK099611 (JAC), R01 DK103872 (JAC), Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) grant P20 GM104936 (JAC), start-up funds and core support from the Kansas Institutional Development Award (IDeA) P20 GM103418, core support from the Kansas IDDRC P30 HD002528, and The Madison and Lila Self Fellowship Program (ANP).

Bu protokol açıklanan tüm deneyler Kansas Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından belirlenen esaslara uygun olarak NIH kurallarına uygundur. 1. Yenidoğan Anne Ayırma (NMS) <ol><li> Çöp doğum günlük hamile baraj izleyin. Not: doğar çöp P0 kabul edilir bir gün. </li><li> P1, ev kafes baraj kaldırmak ve temiz bir kap içine koyun ikincil. </li><li> Evde kafes kokusunu korumak için temiz eldivenli elleri arasına yatak bir avuç ovun. </li><li> Uygun 2 L cam beher etiketli, temiz içine ev kafes yatak 2 cm - 1 derinliğe ekleyin. Cam beher, ev kafes içinde mevcut olan herhangi bir ek zenginleşme yatak malzeme, örneğin, nestlet, kırışık kağıt yaklaşık yarısını ekleyin. </li><li> Yavaşça aynı beher, bireysel, tek bir çöp gelen yavruların hepsi koyun. </li><li> Hemen yerbir kuluçka makinesi içinde beher 180 dakika süreyle 33 o C ve% 50 nemlilikte tutulmaktadır. </li><li> İkincil kaptan baraj çıkarın ve ev kafesine onu iade edin. Vivaryum içinde kendine uygun konut konumu ev kafes dönün. </li><li> , NMS geçiren her çöp / baraj temiz eldiven ve ikincil kapları kullanarak her çöp için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Bunlar çıkarıldı olarak 180 dakika ayırma sürenin sonunda, aynı sırada kendi kafeslerine ibrelerin döndürür. </li><li> Günün erken ayrıldı ilk çöp ev kafes alın. Ev kafesinden baraj çıkarın ve temiz bir kap içine koyun ikincil. </li><li> Inkübatör ilk beher çıkarın ve yavrular işlerken evde kafes kokusunu korumak için temiz eldivenli elleri arasına yatak bir avuç ovalayın. </li><li> Yavaşça ev kafesine kaptan ayrı ayrı, yavruların taşıyın. </li><li> Için beher kalan zenginleşme ve yatak dönev kafes. </li><li> Ev kafesine ikincil kaptan baraj İade ve vivaryum içinde kendine uygun konut konumuna geri döndürebilir. </li><li> Su ile durulayın ve beher inkübatör geri. Ayırma işlem boyunca her çöp için aynı beher kullanın. </li><li> Onlar inkübatör yerleştirildi aynı sırayla NMS geçiren her çöp için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Her çöp Yapılıyor NMS P21 ile her gün için tüm bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Yiyecek ve su ile tam temiz kafeslerde birlikte aynı cinsiyetten yavruları koyarak P22 üzerinde NMS ve naif yavrular vazgeçirmek. Naif yavru doğdu ve NMS fareler ile aynı koşullar altında muhafaza fakat normal hayvancılık görevleri dışında başka bir işleme tabi tutulabilir olmalıdır. </li></ol> 2. perigenital Mekanik Hassasiyet <ol><li> von Frey tertibat Ayar <ol><li> Test odasına fareler getirin ve onları için 30 gelmesini bekleyindk evlerinde kafeslerde kalan süre. </li><li> Araştırmacı fareler, yüksekliği yaklaşık 55 cm şaşırtıcı olmadan alt gelen yaklaşmasına izin için yeterli alan sağlar yükseltilmiş bir tel örgü-üst tablo (79 cm x 28 cm) altında bir emici underpad koyarak test alanını hazırlayın. </li><li> Şeffaf, delikli plastik odaları altında, ayrı ayrı, 12 fareye tel örgü tablosunun üstündeki (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) kadar yerleştirin. Kaçan fareler önlemek için odaların üstünde ağır bir nesne yerleştirmeyin. </li><li> Geri çekme eşiği değerlendirmesine önceki ekrana ek bir 30 dakika boyunca fareler alıştırıldı. </li></ol></li><li> Perigenital Mekanik Hassasiyet Değerlendirme <ol><li> Kademeli von Frey monofillerin 43 standart seti kullanarak yukarı-aşağı yöntemi uygulayın. Aşağıdaki monofilamanlar kullanın: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, ve 4.74 g. <ol><li> 3.22 g monofilament tabanını tutun ve geri çekilmiş mono maruzFilament. Not: Bazı modellerde bir geri çekilme monofilament olmayabilir. </li><li> Monofilament dikey odaklı böylece sonda yerleştirmek ve fare, uyarı hareketsiz ve onun vücut ağırlığı arka pençelerinin arasında eşit olarak dağıtılır zaman hafif bir kadar orta hat kaçınarak, skrotum sol veya sağ tarafına ya uygulamak eğme filament görülmektedir. </li><li> 10 sn veya hayvan olumlu bir yanıt gösterene kadar yerinde monofilament tutun. Not: bir pozitif tepki monofilin uygulama ya da yalama ya da monofilament yönelik ısırma davranışları karşılık olarak bir canlı pislik ya da atlama olarak kabul edilir. Bu davranışları görüntülemeden 10 sn monofilament uygulama sırasında fare hareket, monofilament asgari 1 dakika süren dinlenme dönemi izleyen tekrar test edilmesi gerekir. Bir fare ne hamle de 10 sn monofilament uygulama sırasında listelenen davranışların üzerinde herhangi sergilerse, bu olumsuz bir yanıt olarak kabul edilir. </li><html><li> Bir laboratuar dizüstü veya dizüstü bilgisayar, olumlu veya olumsuz, bir yanıt kaydedin ve 3.22 g monofilament kullanılarak, kalan farelerin tüm bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Daha sonraki uygun monofilament kullanan farelerin hepsi sınayın. Not: Fare 3.22 g monofilament olumsuz yanıt sergiledi ise, aynı şekilde 3.61 g monofilament uygulamak ve yanıtı kaydedin. Fare 3.22 g monofilament olumlu yanıt sergiledi ise, 2.83 g monofilaman uygulamak ve yanıtı kaydedin. </li></ol></li><li> İlk olumlu cevap görülmektedir sonra ek bir 4 uygulamalar için, uygun şekilde, bir sonraki daha büyük veya daha küçük monofilament kullanarak her fare test devam edin. </li><li> Ev kafeslere fareler dönün. </li><li> Chaplan ve arkadaşları. 43&#39;de tarif edildiği gibi% 50 gr geri çekme eşiğinin için günlük birimlerinin deneme dizisi uygulanan son von Frey monofilin değerini kullanın. </li></ol></li></ol>başlığı &quot;&gt; 3. Acidified Toluidine Mavi Mast Hücre Boyama <ol><li> Doku İşleme <ol><li> Intrakardiyak buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit ile perfüze 45 olan farelerden prostat dokusu 44 teşrih. Postfix&#39;i oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4&#39;lük paraformaldehit doku ve daha sonra 4 ° CO / N 1x PBS içinde% 30 sukroz içinde cryoprotect. </li><li> Heptan küçük bir (30 mi) bir banyo hazırlayın ve kuru buz üzerine yerleştirin. </li><li> 1x PBS prostat dokusunu durulayın ve bir hafif yük silin kullanarak kurutun. </li><li> Dondurulmuş kadar soğuk heptan içine prostat dokusunu yerleştirin. </li><li> Donmuş kadar hemen kuru buz üzerinde montaj medya ve yeri içeren bir cryomold dondurulmuş prostat dokusunu yerleştirin. </li><li> Mağaza -20 ° C &#39;de cryomolds. </li><li> Enine bir Kriyostat kullanarak 7 mikron kalınlığında cryosections halinde prostat dokusunu kesti. </li><li> Pozitif yüklü mikroskop lamı üzerine, doku uzunluğu kapsayan 12 olmayan seri cryosections - 8 koyun. </li><li> Mağaza fazla işlem kadar -20 ° C&#39;de slaytlar tamamladı. </li></ol></li><li> Acidified Toluidin Blue Hazırlama <ol><li> % 1 &#39;lik bir stok çözeltisi hazırlamak üzere çözelti içinde kadar, 100 ml% 70 etanol ve vorteks Toluidin Mavi O 1 g ekleyin. stok çözeltisi en fazla üç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Bir karıştırıcı plaka üzerine yerleştirilmiş bir çanak içinde 100 ml su, 1 g NaCI ekleyin. </li><li> 1.0 elde edilir - 0.5 arasında bir pH aralığı kadar 12 M HCI kullanılarak NaCl çözeltisi pH ayarlayın. </li><li> Toluidin Mavi stok çözeltisi 8 ml ve% 1 NaCl çözeltisi 32 ml birleştirerek% 0.25 Toluidin Mavi çalışma çözeltisi hazırlayın. Toluidin Mavi stok solüsyonu toplam birleşme sağlamak ve bir girdap kullanarak karıştırmak için aşağı yukarı pipet ve. çalışma çözeltisi taze yapılmış ve kullandıktan sonra atılmalıdır. </li></ol></li><li> Prostat cryosections Boyama <ol><li> Dondurucu işlenecek slaytları çıkarın ve yaklaşık 30 m oda sıcaklığına gelmesini sağlayınıziçinde. </li><li> Bireysel slayt monte doku bölümleri tamamen sular altında olacak emin olmak için 1x PBS yeterli bir hacmi içeren 50 ml&#39;lik konik tüp içine yaklaşık 1 saniye boyunca slaytlar batırarak doku bölümleri yıkayın. Slaytlar bir kağıt havlu üzerinde kuru hava için izin ver. </li><li> Yeterince% 0.25 çalışan Toluidine Mavi çözeltisi içeren bir cam boyama kavanoza yerleştirin slaytlar slayt monte doku bölümleri tamamen sular altında olacak emin ve 10 inkübe - süre 15 rpm&#39;de ayarlanmış bir platformdur rocker 15 dakika. </li><li> Yaklaşık 1 saniye 1x PBS Dip slaytlar aşırı Toluidine Mavi yıkayın. </li><li> Slaytlar, drenajı mümkün kılması için kendi tarafta olduğu şekilde bir slayt kutusu ya da rafa slaytlar yerleştirin. </li><li> 2 saat oda sıcaklığında veya O / N, en az 37 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde slaytlar kurutun. </li><li> Alkol maruziyet arasındaki slaytlar tamamen kuru izin hızla alkol kullanarak slaytlar dehydrate. Bir kağıt havlu a üzerinde drenaj kuru slaytlarnd hafif görev ile silinerek arkaları ve kenarları silin. <ol><li> Yaklaşık 1 saniye% 95 EtOH slaytlar daldırın ve tamamen kuru izin verin. Doku mor daha mavi kuruyana kadar 10 kez - Bu işlemi 1 tekrarlayın. </li><li> Yaklaşık 1 saniye% 100 EtOH slaytlar daldırın ve tamamen kuru bekleyin. Doku ve orta mavi karanlık, ama mor olmayana kadar 10 kez - Bu işlemi 1 tekrarlayın. </li></ol></li><li> 3 dakika boyunca% 100 ksilen slaytlar inkübe edilerek leke sabitleyin. Kurumasını bekleyin. </li><li> Gliserol, PBS, ya da ksilen bazlı kalıcı montaj medya ile slaytlar lamel. Oda sıcaklığında aşırı medya ve mağaza boşaltın. </li></ol></li><li> Ükler Mast Hücreleri <ol><li> 20X büyütme ışık mikroskobu kullanılarak (Şekil 2) toluidin blue-lekeli doku bölümleri gözünüzde canlandırın. </li><li> Görüntülenmiştir alanı içinde bulunan mast hücrelerinin toplam sayısını ve olmayan degranüle ve degranüle mast hücreleri arasında ayrım. 40X Magnificatiyon bazı mast hücrelerindeki granülasyon durumunu onaylamak için gerekli olabilir. Not: Non-degranüle mast hücreleri ya da hiç soluk nükleer anahat ve / veya hücre çevresinde hiçbir granül ekstrüzyon ile yoğun metakromazi gösterirler. Degranüle mast hücreleri daha az yoğun metakromazi sergileyen ve sitoplazma içinde ve hücre sınırın dışında çekirdek ve / veya serbest granül bariz bir açık anahat var. </li><li> Mevcut doku kesitinin bütünüyle olmayan degranüle ve granüle mast hücrelerinin toplam sayısını değerlendirmek için devam edin. Uzunluğu, her dokuyu kapsayan, en az 7 ek ayrı bölümlerde bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Aşağıdaki denkleme göre her bir doku / fare için toplam mast hücreleri için granüle (DG) yüzdesini hesaplayın: (DG mast hücreleri / Toplam mast hücreleri) x 100. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, yetişkin erkek farelerde CP / KAPS gösterge semptomolojisini indükleme NMS şeklinde neonatal stres kullanmak için bir yöntem sağlar. Yetişkinler olarak NMS fareler önemli düzeyde perigenital mekanik alodinya, hem de prostat dokusu mast hücre degranülasyonunu kanıt gösterir. NMS kullanımı olarak, genellikle kronik pelvik ağrı 12-14 olan hastalar tarafından bildirilen erken yaşam stresi, çoğaltır CP / KPAS bir klinik öncesi bir model geliştirilmesi yanı sıra non-invaziv i...

Kronik pelvik ağrı başlı başına bir hastalık değildir, daha ziyade irritabl barsak sendromu (IBS) tanısı hastalar tarafından devam eden spontan ve / veya uyarılmış ağrı, interstisyel sistit / ağrılı mesane sendromu (IC / PBS), vulvodini ile ilgili bir terim, veya kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu (CP / CPPS). Bu sendromlar genellikle bağışıklık sistemi, merkezi sinir sistemi ve periferal sinir sistemi içinde işlev bozuklukları bu bozukluklara 1 bakım ve ilerlemesine katkıda gösterilmiştir, ancak bunlar, herhangi bir ilişkili patolojisini veya tespit altta yatan nedeni olduğu birçok özelliklere eşlik eden ve paylaşan -3. Kronik pelvik ağrısı olan hastalar semptomları ile ortaya olasılığı daha yüksektir ek olmayan pelvik ilgili hipotalamik değişmiş işleyişi ile ilişkili bulunmuştur anksiyete, depresyon ve panik bozukluk 4-6 da dahil olmak üzere fonksiyonel ağrı bozuklukları ve duygudurum bozuklukları, hipofizadrenal (HPA) eksen 7-10. Erken yaşam stres veya travma Pozlama HPA anormallikleri ve ilişkili kronik ağrı sendromları 10,11 ve gibi geliştirmek için önemli bir risk faktörüdür, fonksiyonel pelvik ağrı bozukluğu olan hastaların önemli bir alt kümesi gibi istismar veya ihmal gibi olumsuz çocukluk olayları deneyimli rapor 12-14. Sütten kesim öncesi dönemde zaman belirli bir süre için kendi baraj yavrular kaldırmayı içerir neonatal anne ayrılık (NMS), kemirgen modelleri, erken yaşam stresi sonuçlarını incelemek için son iki yıldır kullanılmaktadır. Genel olarak, NMS doğrudan hipotalamus içinde gen ekspresyonunu etkileyebilen yanı sıra, limbik yapılarda 15-18 aşağı akış düzenleme bozulmasıyla, HPA eksen aktivasyonu ve elde edilen anksiyete benzeri davranışları geliştirmek için gösterilmiştir. Doğru HPA ekseninin işleyişinin bozulması artan kolorektal 19-22 katkıda gösterilmiştir </sup&gt; Ve vajinal 16 duyarlılık kemirgen NMS modelleri tarafından görüntülenen, ancak doğum sonrası mesane iltihabı 23-25 ​​uzun vadeli etkisi geniş karakterizasyonu rağmen, erken yaşam stresinin etkisi büyük ölçüde ürogenital organlarda unstudied gitti. Bu nedenle, aşağıdaki çalışma farelerde NMS gerçekleştirmek ve daha sonra CP / KPAS için bir preklinik model olarak erkek NMS farelerin kullanımını doğrulamak için prostat perigenital mekanik duyarlılık ve mast hücre infiltrasyonu / aktivasyonunu değerlendirmek için nasıl anlatacağız. Tanısı kronik pelvik ağrı bozukluklarının tüm CP / CPPS bel ağrısı ya da romatoid o iki belki de yaklaşık% 14 26 yaşam boyu yaygınlığı ve 4.400 $ (tahmini yıllık hasta maliyetlerinin olmasına rağmen en az iyi tanınan ve karakterize sendrom olduğunu artrit 27). Perine, rektum, prostat, penis, testisler ve / veya karın 28, hi deneyim CP / CPPS raporu ağrısı olan hastalarGher kontrol hastalara 29 den psikolojik stres derecesi, ve ya semptomları ile yaygın mevcut komorbid kronik pelvik ağrı ya da duygudurum bozuklukları 5,29-31 ile tanı konur. Tekrarlayan enfeksiyonu, sızan epiteli, nörojenik enflamasyon ve otoimmünite tüm potansiyel yatan / CPPS 2,32,33 CP nedenleri olarak mast hücresi aktivasyonu ve degranülasyonunu 34 olarak tahmin etti edilmiştir. Ayrıca artmıştır, mast hücresi aktivasyonu bir belirteç CP / KPAS&#39;li erkeklerden ifade prostat salgıları mast hücre triptaz ve sinir büyüme faktörü (NGF) seviyeleri 34 artmış ve bir sonraki çalışma triptazın doğruladı ve A (CPA3) carboxypeptidase CP / CPPS hastalarının 35 idrar. başlangıç ​​ve CP / KAPS bakım mast hücreleri için potansiyel rolü bugüne kadar bu sendromun hayvan araştırmalarının önemli bir odak noktası olmuştur. En sık kullanılan kemirgen modeli CP incelemek için kullanılan / CPPS deneysel otoimmün prostatit ise (DAP) modeli gen34,36-39 kullanılan türler ve suşu ile ilgili olarak, prostat iltihabı, çeşitli derecelerde sonuçlanan Tam Freund katkı maddesi, prostat antijeni deri altına enjeksiyon tutulmasıyla oluşturulmuştur. Mast hücresi infiltrasyonu ve aktivasyon / degranülasyon DAP 34,35,40 aşağıdaki indüksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir. Mast hücreleri 34 veya triptaz reseptörü PAR2 35 ya eksik transgenik fareler vahşi tipli DAP fareler aksine DAP aşağıdaki prostat taktik duyarlılık geliştirmek yok. Bu preklinik model, insan CP / KPAS özelliklerinin birçoğu çoğaltır ederken, indüksiyon protokolü doğrudan inflamasyon, enfeksiyon ya da prostat yaralanma içermeyen, genellikle farklı etyolojisi vardır ve insan koşulu, göstergesi değildir. İnsanlarda CP / KPAS gelişimine erken yaşam stresinin etkisi büyük ölçüde soruşturulmadan uğramış; Ancak, Hu ve ark. 41 tarafından yapılan bir çalışmada, bana gösterdin çocukluk fiziksel, duygusal öyküsü bildirdi ve / veya cinsel istismar CP / KPAS düşündüren belirtileri yaşamaya anlamlı olarak daha fazlaydı kim. Dahası, onlar acı ve idrar skorları hem fiziksel hem de duygusal istismar öyküsü olan hastalarda artmış olduğunu gösterdi. Biz daha önce dişi C57BL / 6 farelerinde aynı NMS paradigma vajinal hipersensitiviteye ve anormal gen ifadesini ürettiğini göstermiştir hem vajina ve işlevsiz HPA ekseninin çıkışı 16 düşündüren mesane. Daha net erken yaşam strese maruz kalma 12-14 ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir IC / PBS ve duygudurum bozuklukları gibi diğer komorbiditeler 42, ile başvuran CP / CPPS hastalarının yüksek prevalans ile birlikte bu delil, bir kullanma gerekçelerini sağlar NMS modeli farelerde CP / KPAS araştırmak.

<table><tbody><tr><td>Pregnant C57BL/6 female mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.</td></tr><tr><td>2 L glass beaker(s)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS10002L</td><td>Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.</td></tr><tr><td>VWR Forced Air Incubator, Basic</td><td>VWR International</td><td>414005-124</td><td>The incubator should be held at 33&amp;deg;C and 50% humidity.</td></tr><tr><td>Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)</td><td>Stoelting</td><td>58011</td><td>The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.</td></tr><tr><td>Animal Enclosure (12 mice 6 rats)</td><td>IITC</td><td>435</td><td>Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)</td><td>IITC</td><td>410</td><td>Place stand on a stable table top for comfortable access.</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td>Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4&amp;deg;C overnight.</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td>Chill heptane on dry ice to freeze tissue.</td></tr><tr><td>Standard Cryomold&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>4557</td><td>To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>12 x 125 ml</td></tr><tr><td>VWR Superfrost Plus Micro Slide</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td>75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.</td></tr><tr><td>Ethanol, Absolute (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.</td></tr><tr><td>GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>C-3394</td><td>Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.</td></tr><tr><td>Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-815</td><td>Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.</td></tr><tr><td>Xylenes (Histological)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P</td><td>Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.</td></tr><tr><td>Microscope Slide Boxes, 100-Place</td><td>VWR International</td><td>82003</td><td>Boxes can be used for storage and transportation of slides.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Microscope Slide Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-400</td><td>These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Glycerol is a traditional mounting medium.</td></tr><tr><td>Mounting Medium, Richard-Allan Scientific</td><td>VWR International</td><td>4111</td><td>Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1</td><td>VWR International</td><td>48393-106</td><td>A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.</td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

assessment of perigenital sensitivity and prostatic mast cell activation in a mouse model of neonatal maternal separation

Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu (CP / CPPS)% 14 yaşam boyu yaygınlığı vardır ve 50 yaşın altındaki erkeklerde en sık ürolojik tanı, henüz en az anlaşılan ve çalışılan kronik pelvik ağrı bir hastalıktır. Kronik pelvik ağrı raporu ile hastaların önemli bir alt kümesi belirgin hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) eksen işleyişi ve düzenlenmesini etkileyen erken yaşam stresi ya da kötüye, deneyimli. Gösterilmiştir mast hücresi aktivasyonu, kısmen HPA ekseninin alt aktivasyonu ile düzenlenir, her iki idrar artmış ve CP / CPPS hastanın prostat salgıları ifade edilmesi. Yenidoğan anne ayırma (NMS) HPA eksenin ve visseral duyarlılık değişiklikleri de dahil olmak üzere, kemirgen modellerinde erken yaşam stresi sonuçlarını incelemek için iki yıldan uzun bir süredir kullanılmaktadır. Burada erkek C57BL / 6 farelerinde CP / KAPS preklinik model olarak NMS kullanılarak ayrıntılı protokol sağlar. Biz metodoloji tarifperigenital mekanik allodini ve mast hücresi aktivasyonu histolojik kanıtları değerlendirirken, NMS gerçekleştirmek için. Biz de erken psikolojik stres farelerde erkek ürogenital sistem üzerinde uzun süreli etkilere sahip olduğuna dair kanıt sağlamaktadır.

NMS geçiren fareler CP / KPAS göstergesidir davranışsal kanıt gösterdi. Von Frey monofiller, 8 haftalık fareler NMS kademeli bir dizi ile test edildiği zaman (n = 4) saf karşılıkları ile karşılaştırıldığında perigenital mekanik alodinya gösterilmiştir (n = 5, Şekil 2). Monofilament yönelik monofilin uygulama ya da yalama ve ısırma davranışları yanıt olarak canlı bir pislik ya da atlama olarak kaydedilir, pozitif bir davranış yanıtı ortaya çıkardı, mekanik geri çekm...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation at JoVE.com

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu bir klinik öncesi modelini teşvik etmek amacıyla yenidoğan anne ayrılık, - Biz bir erken yaşam stresi paradigmasını uygulanan erkek C57BL / 6 farelerin prostat perigenital mekanik duyarlılık ve mast hücre aktivasyonunu ölçüyorlar.

Yenidoğan Anneden Ayrılma Fare Modelinde perigenital Duyarlılık ve Prostat Mast Hücre aktivasyonu Değerlendirilmesi

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

assessment-perigenital-sensitivity-prostatic-mast-cell-activation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K Görüntüleme.  University of Kansas Medical Center.  Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu bir klinik öncesi modelini teşvik etmek amacıyla yenidoğan anne ayrılık, - Biz bir erken yaşam stresi paradigmasını uygulanan erkek C57BL / 6 farelerin prostat perigenital mekanik duyarlılık ve mast hücre aktivasyonunu ölçüyorlar. 

Video: Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors. Using animal models to accomplish this goal, many methodological strategies require invasive techniques to manipulate the intensity of the behavior of interest (e.g., lesion methods, pharmacological manipulations, microdialysis techniques, genetically-engineered animal models). The utilization of a comparative species approach allows researchers to take advantage of naturally occurring differences in response strategies existing in closely related species. In our lab, we use two species of the Peromyscus genus that differ in paternal responses. The male California deer mouse (Peromyscus californicus) exhibits the same parental responses as the female whereas its cousin, the common deer mouse (Peromyscus maniculatus) exhibits virtually no nurturing/parental responses in the presence of pups. Of specific interest in this article is an exploration of the neurobiological factors associated with the affiliative social responses exhibited by the paternal California deer mouse. Because the behavioral neuroscience approach is multifaceted, the following key components of the study will be briefly addressed: the identification of appropriate species for this type of research; data collection for behavioral analysis; preparation and sectioning of the brains; basic steps involved in immunocytochemistry for the quantification of vasopressin-immunoreactivity; the use of neuroimaging software to quantify the brain tissue; the use of a microsequencing video analysis to score behavior and, finally, the appropriate statistical analyses to provide the most informed interpretations of the research findings.

The comparative species approach allows behavioral neuroscientists to explore various neurobiological factors associated with specific behaviors viewed as characteristic of a specific animal model. Taking advantage of naturally occurring differences in behavior between closely related species, this technique doesn&#x2019;t require invasive techniques to manipulate the expression of the behavior.

Baba Yanıtları Nörobiyoloji incelenmesi Karşılaştırmalı Türlerin Yaklaşım

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

Nörobilim

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

Bakteriyel Prostatit bir fare modelinde Dokunsal allodini Ölçümü

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

Using a Murine Model of Psychosocial Stress in Pregnancy as a Translationally Relevant Paradigm for Psychiatric Disorders in Mothers and Infants

The peripartum period is considered a sensitive period where adverse maternal exposures can result in long-term negative consequences for both mother and offspring, including the development of neuropsychiatric disorders. Risk factors linked to the emergence of affective dysregulation in the maternal-infant dyad have been extensively studied. Exposure to psychosocial stress during pregnancy has consistently emerged as one of the strongest predictors. Several rodent models have been created to explore this association; however, these models rely on the use of physical stressors or a limited number of psychosocial stressors presented in a repetitive fashion, which do not accurately capture the type, intensity, and frequency of stressors experienced by women. To overcome these limitations, a chronic psychosocial stress (CGS) paradigm was generated that employs various psychosocial insults of different intensity presented in an unpredictable fashion. The manuscript describes this novel CGS paradigm where pregnant female mice, from gestational day 6.5 to 17.5, are exposed to various stressors during the day and overnight. Day stressors, two per day separated by a 2 h break, range from exposure to foreign objects or predator odor to frequent changes in bedding, removal of bedding, and cage tilting. Overnight stressors include continuous light exposure, changing cage mates, or wetting bedding. We have previously shown that exposure to CGS results in the development of maternal neuroendocrine and behavioral abnormalities, including increased stress reactivity, the emergence of fragmented maternal care patterns, anhedonia, and anxiety-related behaviors, core features of women suffering from perinatal mood and anxiety disorders. This CGS model, therefore, becomes a unique tool that can be used to elucidate molecular defects underlying maternal affective dysregulation, as well as trans-placental mechanisms that impact fetal neurodevelopment and result in negative long-term behavioral consequences in the offspring.

The chronic psychosocial stress (CGS) paradigm employs clinically relevant stressors during pregnancy in mice to model psychiatric disorders of mothers and infants. Here, we provide a step-by-step procedure of applying the CGS paradigm and downstream assessments to validate this model.

Anne ve Bebeklerde Psikiyatrik Bozukluklar İçin Çevirisel olarak İlgili Bir Paradigma Olarak Gebelikte Psikososyal Stresin Murine Modelini Kullanmak

The peripartum period is considered a sensitive period where adverse maternal exposures can result in long-term negative consequences for both mother and ...

Davranış

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

Bir Yenidoğan Fare Omurilik Sıkıştırma Yaralanması Modeli

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Tıp

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Yenidoğan Polymicrobial Sepsis için kontrollü fare modeli

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Akut Chorioamnionitis'in Yenidoğan Bağırsak Gelişimi Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Anne İltihaba Fetal MaruzIyetin Bir Murine Modeli

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in offspring. Animal models of MIA are used to test causality, investigate mechanisms, and develop diagnostics and treatments for these disorders. Despite their widespread use, many MIA models suffer from a lack of reproducibility and almost all ignore two important aspects of this risk factor: (i) many offspring are resilient to MIA, and (ii) susceptible offspring can exhibit distinct combinations of phenotypes. To increase reproducibility and model both susceptibility and resilience to MIA, the baseline immunoreactivity (BIR) of female mice before pregnancy is used to predict which pregnancies will result in either resilient offspring or offspring with defined behavioral and molecular abnormalities after exposure to MIA. Here, a detailed method of inducing MIA via intraperitoneal (i.p.) injection of the double stranded RNA (dsRNA) viral mimic poly(I:C) at 12.5 days of gestation is provided. This method induces an acute inflammatory response in the dam, which results in perturbations in brain development in mice that map onto similarly impacted domains in human psychiatric and neurodevelopmental disorders (NDDs).

Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using PolyI:C to Study Susceptibility and Resilience in Offspring

Maternal infection is a risk factor for neurodevelopmental disorders. Mouse models of maternal immune activation (MIA) may elucidate infection's impact on brain development and function. Here, general guidelines and a procedure are provided to produce reliably resilient and susceptible offspring exposed to MIA.

Yavrularda Duyarlılık ve Esnekliği Incelemek için Poli (I: C) Kullanarak Orta Gebelik Maternal İmmün Aktivasyonun Yeniden Üretilebilir Bir Modelinin Oluşturulması

Maternal immune activation (MIA) during pregnancy is consistently linked to increased risk of neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Erken Doğum Sonrası Ağrı Araştırmaları için Preterm Sıçan Modeli Oluşturma

A Preterm Rat Model for Pain Studies

This research delves into the consequences of consistent pinprick stimulation on preterm offspring to ascertain its long-term implications for pain sensitivity. The primary objective of this protocol was to investigate the impact of neonatal pinprick stimuli on the pain threshold in the later stages of life using a preterm rat model. By establishing this model, we aim to advance the research on understanding and managing early postnatal pain associated with prematurity. The findings of this study indicate that while the baseline thresholds to mechanical stimuli remained unaffected, there was a notable increase in mechanical hypersensitivity following complete Freund's adjuvant (CFA) injection in adult rats. Interestingly, compared with male rats, female rats demonstrated heightened inflammatory hypersensitivity. Notably, maternal behavior, the weight of the litters, and the growth trajectory of the offspring remained unchanged by the stimulation. The manifestation of altered nociceptive responses in adulthood after neonatal painful stimuli could be indicative of changes in sensory processing and the functioning of glucocorticoid receptors. However, further research is needed to understand the underlying mechanisms involved and to develop interventions for the consequences of prematurity and neonatal pain in adults.

<meta charset="utf8"></head><body>Ağrı Çalışmaları için Preterm Sıçan Modeli

Here, we present a concise protocol for creating a preterm rat model, facilitating research on early postnatal pain management. The method involves performing a cesarean section three days before the expected birth, extracting preterm rat pups via hysterectomy, and integrating them with the biological offspring of a surrogate dam.

Ağrı Çalışmaları için Preterm Sıçan Modeli

This research delves into the consequences of consistent pinprick stimulation on preterm offspring to ascertain its long-term implications for pain ...